Modelo animal de pez cebra para el estudio de reacciones alérgicas en respuesta a biomoléculas de saliva de garrapatas

Resumen

Aquí, el pez cebra (Danio rerio) se utiliza como modelo para estudiar las reacciones alérgicas y las respuestas inmunes relacionadas con el síndrome alfa-Gal (AGS) mediante la evaluación de las reacciones alérgicas a la saliva de garrapatas y el consumo de carne de mamíferos.

Resumen

Las garrapatas son artrópodos vectores que causan enfermedades por transmisión de patógenos y cuyas picaduras podrían estar relacionadas con reacciones alérgicas que afectan la salud humana en todo el mundo. En algunos individuos, altos niveles de anticuerpos de inmunoglobulina E contra el glicano Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) han sido inducidos por picaduras de garrapatas. Las reacciones anafilácticas mediadas por glicoproteínas y glicolípidos que contienen el glicano α-Gal, presentes en la saliva de garrapatas, están relacionadas con el síndrome alfa-Gal (AGS) o alergia a la carne de mamíferos. El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un modelo vertebrado ampliamente utilizado para el estudio de diferentes patologías. En este estudio, el pez cebra se utilizó como modelo para el estudio de las reacciones alérgicas en respuesta al consumo de carne de α-Gal y mamíferos porque, al igual que los humanos, no sintetizan este glicano. Para este propósito, se evaluaron los patrones de comportamiento y las reacciones alérgicas de tipo anafiláctico hemorrágico en respuesta a la saliva de la garrapata Ixodes ricinus y el consumo de carne de mamíferos. Este enfoque experimental permite la obtención de datos válidos que respaldan el modelo animal de pez cebra para el estudio de alergias transmitidas por garrapatas, incluido el AGS.

Introducción

Las garrapatas son vectores de patógenos que causan enfermedades y también son la causa de reacciones alérgicas, afectando la salud de humanos y animales en todo el mundo ^1,2. Durante la alimentación por garrapatas, las biomoléculas en la saliva de garrapatas, especialmente proteínas y lípidos, facilitan la alimentación de estos ectoparásitos, evitando las defensas del huésped³. Algunas biomoléculas de saliva con glicano Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R (α-Gal) modificaciones conducen a la producción de altos niveles de anticuerpos anti-α-Gal IgE después de la picadura de garrapata, solo en algunos individuos, lo que se conoce como síndrome de α-Gal (AGS)⁴. Esta es una enfermedad asociada con la alergia mediada por IgE que puede provocar anafilaxia a las picaduras de garrapatas, consumo de carne de mamíferos no primates y algunos medicamentos como cetuximab⁵. Las reacciones a α-Gal a menudo son graves y a veces pueden ser fatales 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

El α-Gal se encuentra en todos los mamíferos, excepto en los monos, simios y humanos del Viejo Mundo que no tienen la capacidad de sintetizar α-Gal¹³. Sin embargo, patógenos como bacterias y protozoos expresan este glicano en su superficie, lo que puede inducir la producción de altas cantidades de anticuerpos anti-α-Gal IgM/IgG y puede ser un mecanismo protector contra estos patógenos^16,17. Sin embargo, la producción de anticuerpos anti-α-Gal aumenta el riesgo de desarrollar alergias anti-α-Gal mediadas por IgE ^7,13. Los anticuerpos naturales anti-α-Gal producidos en humanos, principalmente de los subtipos IgM/IgG, podrían estar asociados a esta modificación presente en bacterias de la microbiota intestinal¹⁶. El AGS puede ser un diagnóstico clínico difícil, ya que el principal método de diagnóstico en este momento se basa en una historia clínica de reacciones alérgicas tardías, especialmente asociadas con alergias alimentarias (es decir, prurito, urticaria localizada o angioedema recurrente a anafilaxia, urticaria y síntomas gastrointestinales) y la medición de los niveles de anticuerpos IgE anti-α-Gal⁹. Los hallazgos actuales sugieren que las picaduras de garrapatas constituyen uno de los principales riesgos en la aparición de AGS 18,19, un aumento de 20 veces o más en los niveles de IgE a α-Gal después de una picadura de garrapata 19, una historia de picaduras de garrapatas en pacientes con AGS^20,21,22, la existencia de anticuerpos reactivos a los antígenos de garrapatas en pacientes con AGS ^19, y que la IgE anti-α-Gal está fuertemente relacionada con los niveles de IgE anti-garrapatas^19,23, pero se necesitan más estudios para evaluar qué biomoléculas están realmente involucradas.

Además, otro escenario posible son los pacientes que presentan fuertes reacciones alérgicas a las picaduras de garrapatas y altos niveles de anticuerpos anti-α-Gal IgE, pero son tolerantes al consumo de carne de mamíferos¹². Por lo tanto, la alergia a la carne de mamífero podría ser un tipo particular de alergia relacionada con la picadura de garrapata. Las principales especies de garrapatas asociadas con AGS incluyen Amblyomma americanum (EE.UU.), Amblyomma sculptum (Brasil), Amblyomma testudinarium y Haemaphysalis longicornis (Japón), Ixodes holocyclus (Australia) e Ixodes ricinus (el principal vector de la borreliosis de Lyme en Europa)^11,24.

El único modelo que se ha utilizado para evaluar la producción de IgE relacionada con las picaduras de garrapatas es el modelo de ratón modificado genéticamente con el gen para ratones α-1,3-galactosiltransferasa noqueada (α-Gal KO)^25,26 porque al igual que otros mamíferos^, los ratones también expresan α-Gal en proteínas y lípidos y no producen IgE a α-Gal. Sin embargo, el pez cebra (Danio rerio) es un modelo útil para la investigación biomédica aplicada a los mamíferos porque comparte muchas similitudes anatómicas con los mamíferos y, al igual que los humanos, también es incapaz de sintetizar α-Gal. Dado que α-Gal no se produce naturalmente en el pez cebra, es un modelo asequible, fácil de manipular y permite un alto tamaño de muestra para el estudio de reacciones alérgicas relacionadas con α-Gal.

En este estudio, el pez cebra se utiliza como organismo modelo para caracterizar y describir las reacciones alérgicas locales, los patrones de comportamiento y los mecanismos moleculares asociados con la respuesta a la sensibilización percutánea a la saliva de garrapatas^26,27 y el posterior consumo de carne de mamíferos. Para este propósito, los peces se exponen a la saliva de garrapatas por inyección intradérmica y luego se alimentan con alimento para perros, que contiene productos derivados de la carne de mamíferos adecuados para uso animal que contienen α-Gal²⁷, luego se evalúan posibles reacciones alérgicas relacionadas. Este método se puede aplicar al estudio de otras biomoléculas relacionadas con procesos alérgicos, especialmente las relacionadas con AGS.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad de Castilla La Mancha en el marco del estudio "Evaluación de la respuesta inmune a la vacuna inactivada contra M. bovis y desafío con M. marinum en el número de modelo de pez cebra PR-2017-05-12".

Las garrapatas se obtuvieron de la colonia de laboratorio, donde se analizaron muestras representativas de garrapatas en la colonia mediante PCR para detectar patógenos comunes de garrapatas para confirmar la ausencia de patógenos, y se mantuvieron en el Instituto de Parasitología, Centro de Biología de la Academia Checa de Ciencias (IP BC CAS), República Checa.Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Ley de Protección Animal de la República Checa No. 246/1992 Sb (aprobación ética No. 34/2018).

1. Tratamiento del pez cebra

NOTA: El ensayo está diseñado para evaluar las reacciones alérgicas y la respuesta inmune en el pez cebra tratado con saliva de garrapata en respuesta al consumo de carne de mamíferos.

1. Tratar el pescado (como se explica en la sección 4) con saliva de garrapata, Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal) comercial (ver Tabla de materiales), utilizada como control positivo, con solución salina tamponada con fosfato (PBS) como control negativo. El pez cebra adulto se distribuye aleatoriamente en tres grupos de género equilibrado (Figura 1).
   NOTA: Cualquier otro compuesto deseado relacionado con AGS puede ser evaluado usando este modelo.

2. Extracción de saliva de garrapata Ixodes ricinus

1. Use garrapatas hembras semi-hinchadas libres de patógenos alimentadas durante 6-7 días en conejillos de indias.
2. Tratar la garrapata con 5 μL de una solución al 2% (peso / vol) de clorhidrato de pilocarpina en PBS (ver Tabla de materiales) a pH 7.4 en el hemocoel usando una jeringa de 50 μL con una aguja de 0.33 mm como se describió anteriormente²⁸ para inducir la producción de saliva por garrapata.
   NOTA: Las garrapatas se manejan con fórceps; Tenga cuidado de no aplicar demasiada fuerza al agarrarlos.
3. Recoger la saliva con una punta de 10 μL montada en una micropipeta.
   1. Introduzca la punta dentro del hipostoma de garrapatas con cuidado.
   2. Mantenga la saliva en un tubo de 1,5 ml sobre hielo, constrímela y guárdela a -80 °C como se describió anteriormente²⁷.
4. Determinar la concentración de proteína en saliva, para establecer la cantidad de proteína a inyectar en el pescado como en estudios previos²⁷ utilizando un kit de ensayo de proteína BCA (ver Tabla de materiales) siguiendo las recomendaciones del fabricante.

3. Mantenimiento del pez cebra

1. Mantener el pez cebra en un sistema de agua de flujo continuo a 27 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 14 h/10 h (Figura 2).
2. Alimente a los peces dos veces al día a las 9:30 a.m. y 1:30 p.m. con alimento seco para peces (50-70 μg / pescado) hasta el día 2.
3. Alimente a los peces dos veces al día a las 9:30 a.m. y 1:30 p.m. con alimento seco para perros (50-70 μg / pez) desde el día 2 después de la inyección del tratamiento hasta el final del experimento

4. Inyección de pez cebra

1. Seleccione 10 peces por grupo con una proporción similar de hembras / machos y peso similar.
   NOTA: El grupo 1 contiene pescado inyectado con PBS, el grupo 2 contiene pescado inyectado con saliva de garrapatas y el grupo 3 contiene pescado inyectado con α-Gal.
2. Anestesiar brevemente el pescado por inmersión en metanosulfonato de tricaína al 0,02% (MS-222) (Película 1).
   NOTA: Los peces debidamente anestesiados muestran respiración normal y no nadan, mientras que podrían colocarse en el fondo del tanque de agua o flotando. Cada pez debe ser anestesiado individualmente para evitar posibles daños fisiológicos.
3. Capturar los peces anestesiados utilizando una red de pesca.
4. Coloque el pez en su mitad de lado usando fórceps o manos con cuidado, sobre una esponja húmeda, con la aleta caudal en el lado derecho para inyectar los compuestos en la misma dirección con el fin de controlar las lesiones.
5. Inyectar grupos de peces por vía intradérmica, como en estudios previos²⁶, en el músculo a 5 mm de la aleta caudal y en un ángulo de 45° en relación con el cuerpo del pez (Película 2). Utilizar el tratamiento adecuado en los días 0, 3 y 8 como se ha descrito anteriormente 27 con una jeringa de 100 μL equipada con una aguja de 1 cm, 29 G con 1 μL (con 9 μg/μL de proteína) de I. ricinus saliva en 10 μL de PBS (saliva por garrapata), 5 μg de α-Gal en 10 μL de PBS (α-Gal)²⁷,  y 10 μL de PBS (Figura 3).
   NOTA: La manipulación debe hacerse rápida y cuidadosamente para evitar cualquier daño físico al animal.
   Otras biomoléculas en la saliva de garrapatas se pueden evaluar siguiendo este protocolo.
6. Coloque los peces tratados nuevamente en un tanque de agua dulce sin anestesia para su recuperación.
   NOTA: Todos los peces del mismo grupo se pueden colocar en el mismo tanque de agua para su recuperación.

5. Alimentación del pez cebra

1. Machaca la comida para perros con un mortero.
2. Alimente 50-70 μg/pescado dos veces al día a las 9:30 a.m. y 1:30 p.m. con alimento para peces secos hasta el día 2.
3. Alimente 50-70 μg / pescado dos veces al día a las 9:30 a.m. y 1:30 p.m. con puré de alimento para perros desde el día 2 después de la inyección del tratamiento hasta el final del experimento el día 8.
   NOTA: Si se van a evaluar los marcadores de inmunidad o los títulos de anticuerpos contra el anticuerpo α-Gal o IgE en respuesta a los tratamientos o la alimentación a lo largo de las diferentes inoculaciones, la alimentación sería necesaria hasta el final del experimento.

6. Evaluación de reacciones alérgicas, lesiones y comportamiento en pez cebra

1. Examine el tipo hemorrágico de reacciones alérgicas (enrojecimiento de la piel, decoloración y hemorragia) utilizando una lupa o estereomicroscopio para verificar su precisión e indique la ubicación de su aparición en los peces siguiendo la categorización incluida en la Tabla 1 (Figura 4A).
   NOTA: Las reacciones alérgicas presentadas en la Figura 4 aparecieron después de la inyección de saliva de garrapata y el consumo de alimentos que contienen carne roja. Por lo tanto, las reacciones descritas son el tipo de reacciones asociadas con AGS, ya que aparecen reacciones similares en el contexto clínico.
   1. Observe si aparece alguna reacción después de los tratamientos y mientras se administran alimentos dos veces al día mientras los peces están en el tanque de agua.
2. Examinar el comportamiento de los peces evaluando los cambios²⁷ en los patrones de natación (movilidad, velocidad, permanecer inmóvil en el fondo del tanque de agua y natación en zigzag) siguiendo la categorización incluida en la Tabla 1.
3. Evaluar la mortalidad acumulada, informando el número de peces muertos, incluida la hora/día de la muerte (Figura 4B).
   NOTA: Todos los parámetros se evalúan inmediatamente después del tratamiento o después del cambio de alimento y se siguen diariamente hasta el final del experimento en el día 8 categorizando las variables cualitativas (Tabla 1). Como recomendación, esta evaluación debe ser realizada por un profesional con conocimientos sobre el pez cebra para considerar cambios de comportamiento en función de sus antecedentes y experiencia trabajando con este modelo animal.
4. Calcule el número de peces cebra por día con reacciones alérgicas reportadas, comportamiento anormal y cambios en la alimentación en cada grupo y compare entre grupos mediante una prueba ANOVA unidireccional.

7. Recogida de muestras

1. Eutanasia de los peces por inmersión en 0.04% MS-222 el día 8.
   NOTA: También recoja las muestras de los peces que mueren por reacciones alérgicas durante el ensayo.
2. Fije el pescado en una placa de parafina con alfileres.
3. Recoger suero de los vasos sanguíneos branquiales 29 de los peces inmediatamente después de la eutanasia, cuando las branquias todavía están irrigadas con sangre, utilizando una jeringa de 0,5 ml equipada con una aguja de 1 cm,²⁹ G. Almacénelo en un tubo de 1,5 ml a -20 °C hasta su uso (película 3).
4. Cortar el pescado sagitalmente con una cuchilla de bisturí y evaluar las lesiones internas (lesiones hemorrágicas o granulomas)^27,30 si aparecen.
   NOTA: Las lesiones no aparecen necesariamente, pero deben registrarse si lo hacen.
5. Recoja el intestino (Película 4) y el riñón (Película 5) de cada pez en tubos vacíos separados de 1,5 ml, como se describió anteriormente³¹, y almacénelos a -80 C (Figura 4C).
6. Extraiga el ARN total de las muestras de intestino y riñón del pez cebra utilizando un kit de purificación de ARN (consulte la Tabla de materiales).
7. Analizar la expresión de genes relacionados con la respuesta inmune como se describió anteriormente^30,32 (ver Tabla 2 para secuencias de cebadores) en pez cebra^, realizando una reacción en cadena cuantitativa de polimerasa con transcripción inversa (RT-qPCR) utilizando una mezcla de transcripción inversa para RT-qPCR (ver Tabla de materiales), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Normalizar los valores de cT de ARNm contra D. rerio GAPDH y comparar entre grupos (peces tratados con saliva, α-Gal y los grupos tratados con PBS) utilizando una prueba t de Student con varianza desigual.
8. Determinar los títulos de anticuerpos IgM que reconocen α-Gal en pez cebra en muestras de suero por ELISA como se describió anteriormente^27,30. Registre los títulos de anticuerpos como valores de _{O.D.450 nm}, utilizando un lector de placas, y compare entre los grupos (peces tratados con saliva, α-Gal y los grupos tratados con PBS) utilizando una prueba t de Student con varianza desigual.
   NOTA: La determinación de los títulos de anticuerpos IgM y el análisis de genes de expresión son opcionales y se realizan solo si se requiere información inmunológica. La mezcla RT-qPCR es un kit de síntesis de ADNc de primera cadena para el análisis de la expresión génica utilizando qPCR en tiempo real.

Resultados

El protocolo aquí presentado se basa en varios aspectos de experimentos previamente publicados^27,30 y resultados realizados en nuestro laboratorio donde se establece y valida el modelo de pez cebra para el estudio del AGS y la respuesta inmune al α-Gal porque tanto los humanos como el pez cebra no sintetizan esta molécula¹³. Este modelo permite la caracterización y evaluación de una variedad de reacciones alérgicas como resultado de ...

Discusión

El pez cebra es un modelo rentable y fácil de manejar que también ha sido una herramienta muy factible para el estudio de los mecanismos moleculares de la respuesta inmune, enfermedades patógenas, pruebas de nuevos medicamentos y vacunación y protección contra infecciones^33,34,35. El estudio sobre el comportamiento del pez cebra es útil ya que estudios previos han encontrado que algunas especies de peces permanecen inmóvi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube	VWR	525-0990
All Prep DNA/RNA	Qiagen	80284
Aquatics facilities
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Disection set	VWR	631-1279
Dog Food - Red Classic	Acana
ELISA plates-96 well	Thermo Fisher Scientific	10547781
Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal)	Dextra	NGP0203
iScript Reverse Transcription Supermix	Supermix	1708840
Microliter syringes	Hamilton	7638-01
Plate reader	any
Phosphate buffered saline	Sigma	P4417-50TAB
pilocarpine hydrochloride	Sigma	P6503
Pipette tip P10	VWR	613-0364
Pipette tip P1000	VWR	613-0359
Premium food tropical fish	DAPC
Sponge Animal Holder			Made from scrap foam
Stereomicroscope	any
Thermal Cycler Real-Time PCR	any
Tricaine methanesulphonate (MS-222)	Sigma	E10521