진드기 타액 생체 분자에 대한 알레르기 반응 연구를 위한 제브라피쉬 동물 모델

요약

여기서, 제브라피쉬(Danio rerio)는 진드기 타액에 대한 알레르기 반응과 포유류의 육류 섭취를 평가하여 알파갈 증후군(AGS)과 관련된 알레르기 반응 및 면역 반응을 연구하는 모델로 사용됩니다.

초록

진드기는 병원체 전파에 의해 질병을 일으키는 절지동물 매개체이며 물린 부위는 전 세계적으로 인체 건강에 영향을 미치는 알레르기 반응과 관련이 있을 수 있습니다. 일부 개인에서는 글리칸 Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R(α-Gal)에 대한 높은 수준의 면역글로불린 E 항체가 진드기 물림에 의해 유도되었습니다. 진드기 타액에 존재하는 글리칸 α-Gal을 함유한 당단백질 및 당지질에 의해 매개되는 아나필락시스 반응은 알파-갈 증후군(AGS) 또는 포유류 육류 알레르기와 관련이 있습니다. Zebrafish (Danio rerio)는 다양한 병리학 연구를 위해 널리 사용되는 척추 동물 모델이되었습니다. 이 연구에서 제브라피쉬는 인간과 마찬가지로 이 글리칸을 합성하지 않기 때문에 α-Gal 및 포유류 육류 소비에 대한 알레르기 반응 연구의 모델로 사용되었습니다. 이를 위해 Ixodes ricinus 진드기 타액 및 포유류 육류 섭취에 대한 행동 패턴 및 출혈성 아나필락시스 유형 알레르기 반응을 평가했습니다. 이 실험적 접근 방식을 통해 AGS를 포함한 진드기 매개 알레르기 연구를 위한 제브라피쉬 동물 모델을 뒷받침하는 유효한 데이터를 얻을 수 있습니다.

서문

진드기는 질병을 일으키는 병원체의 매개체이며 알레르기 반응의 원인이기도하며 전 세계적으로 인간과 동물의 건강에 영향을 미칩니다 ^1,2. 진드기 먹이를 먹는 동안 진드기 타액의 생체 분자, 특히 단백질과 지질은 이러한 외부 기생충의 먹이를 촉진하여 숙주 방어를 피합니다³. 글리칸 Galα1-3Galβ1-(3)4GlcNAc-R(α-Gal) 변형이 있는 일부 타액 생체 분자는 진드기에 물린 후 일부 개인에서만 높은 항-α-Gal IgE 항체 수준을 생성하며, 이는 α-Gal 증후군(AGS)⁴으로 알려져 있습니다. 이것은 진드기에 물린 아나필락시스, 비영장류 포유류 육류 섭취 및 세툭시맙⁵와 같은 일부 약물을 유발할 수 있는 IgE 매개 알레르기와 관련된 질병입니다. α-Gal에 대한 반응은 종종 심각하며 때로는 치명적일 수 있습니다 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

α-Gal은 구세계 원숭이, 유인원 및 α-Gal¹³을 합성하는 능력이 없는 인간을 제외한 모든 포유류에서 발견됩니다. 그러나 박테리아 및 원생동물과 같은 병원체는 표면에 이 글리칸을 발현하여 다량의 항-α-Gal IgM/IgG 항체 생성을 유도할 수 있으며 이러한 병원체에 대한 보호 메커니즘이 될 수 있습니다^16,17. 그러나 항-α-Gal 항체의 생산은 IgE 매개 항-α-Gal 알레르기 발병 위험을 증가시킵니다 ^7,13. 주로 IgM/IgG 아형으로 인간에서 생성되는 천연 항-α-Gal 항체는 장내 미생물총의 박테리아에 존재하는 이러한 변형과 관련이 있을 수 있습니다¹⁶. AGS는 현재 주요 진단 방법이 지연된 알레르기 반응의 임상 병력, 특히 식품 알레르기(예: 가려움증, 국소 두드러기 또는 아나필락시스, 두드러기, 위장관 증상에 대한 재발성 혈관부종)와 IgE 항-α-Gal 항체 수치 측정에 기초하기 때문에 어려운 임상 진단이 될 수 있다⁹. 현재 연구 결과에 따르면 진드기 물림은 AGS 18,19의 출현에서 주요 위험 중 하나이며, 진드기 물림 후 IgE 수치가 α-Gal로 20배 이상 증가함 19, AGS^20,21,22 환자에서 진드기 물림 이력, AGS 환자에서 진드기 항원에 반응하는 항체의 존재 ^19, 항-α-Gal IgE는 항진드기 IgE 수치와 밀접한 관련이 있지만^19,23 그러나 어떤 생체 분자가 실제로 관련되어 있는지 평가하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.

또한, 진드기에 물렸을 때 강한 알레르기 반응을 보이고 항-α-Gal IgE 항체 수치가 높지만 포유류의 육류 섭취에는 내성이 있는 환자도 발생할 수 있다¹². 따라서 포유류 육류 알레르기는 특정 유형의 진드기 물림 관련 알레르기일 수 있습니다. AGS와 관련된 주요 진드기 종에는 Amblyomma americanum (미국), Amblyomma sculptum (브라질), Amblyomma testudinarium 및 Haemaphysalis longicornis (일본), Ixodes holocyclus (호주) 및 Ixodes ricinus (유럽의 라임 보렐리 아증의 주요 벡터)^11,24.

진드기 물림과 관련된 IgE 생산을 평가하는 데 사용된 유일한 모델은 α α α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 녹아웃(α-Gal KO) 마우스^25,26에 대한 유전자로 유전자 변형된 마우스 모델입니다. 그러나 제브라피쉬(Danio rerio)는 포유류와 많은 해부학적 유사성을 공유하고 인간과 마찬가지로 α-Gal을 합성할 수 없기 때문에 포유류에 적용되는 생물 의학 연구에 유용한 모델입니다. α-Gal은 제브라피쉬에서 자연적으로 생산되지 않기 때문에 저렴한 모델이며 조작하기 쉽고 α-Gal 관련 알레르기 반응 연구를 위한 높은 표본 크기를 허용합니다.

이 연구에서 제브라피쉬는 진드기 타액에 대한 경피적 감작 및 후속 포유류 육류 소비에 대한 반응과 관련된 국소 알레르기 반응, 행동 패턴^및 분자 메커니즘을 특성화하고 설명하기 위한 모델 유기체로 사용됩니다. 이를 위해 물고기는 피내 주사로 진드기 타액에 노출 된 다음 α-Gal²⁷을 함유 한 동물용으로 적합한 포유류 육류 유래 제품이 포함 된 개 사료를 먹인 다음 가능한 관련 알레르기 반응을 평가합니다. 이 방법은 알레르기 과정과 관련된 다른 생체 분자, 특히 AGS와 관련된 생체 분자 연구에 적용될 수 있습니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 "비활성화된 M. bovis 백신에 대한 면역 반응 평가 및 제브라피쉬 모델 번호 PR-2017-05-12에서 M. marinum 에 대한 도전" 연구에 따라 카스티야 라만차 대학의 동물 실험 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.

진드기는 실험실 콜로니에서 채취했으며, 콜로니의 진드기 대표 샘플은 일반적인 진드기 병원체에 대해 PCR로 테스트하여 병원체의 부재를 확인하고 체코 과학 아카데미 생물학 센터 기생충학 연구소 (IP BC CAS), 체코 공화국.모든 동물 실험은 체코 동물 보호법 No. 246/1992 Sb (윤리 승인 No. 34/2018)에 따라 수행되었습니다.

1. 제브라피쉬 치료

참고: 이 시험은 포유류 육류 섭취에 대한 반응으로 진드기 타액으로 처리된 제브라피쉬의 알레르기 반응과 면역 반응을 평가하기 위해 고안되었습니다.

1. 물고기(섹션 4에 설명된 대로)를 진드기 타액, 상업용 Gala1-3Gal-BSA 3(α-Gal)( 재료 표 참조)로 처리하여 양성 대조군으로 사용하고 인산염 완충 식염수(PBS)를 음성 대조군으로 사용합니다. 성체 제브라피쉬는 무작위로 세 개의 성별 균형 그룹으로 나뉩니다(그림 1).
   참고: AGS와 관련된 기타 원하는 화합물은 이 모델을 사용하여 평가할 수 있습니다.

2. Ixodes ricinus 진드기 타액 추출

1. 기니피그에서 6-7 일 동안 먹이를 준 반 충혈 된 병원균이없는 암컷 진드기를 사용하십시오.
2. pH 7.4에서 PBS 중의 2%(wt/vol) 필로카르핀 염산염 용액 5μL로 진드기를 처리하고( 재료 표 참조) 이전에 설명한 바와 같이 0.33mm 바늘이 있는 50μL 주사기를 사용하여 헤모코엘에 넣고²⁸ 진드기 타액 생산을 유도했습니다.
   알림: 틱은 집게를 사용하여 처리됩니다. 잡을 때 너무 많은 힘을 가하지 않도록 주의하십시오.
3. 마이크로피펫에 장착된 10μL 팁을 사용하여 타액을 수집합니다.
   1. 진드기 hypostome 안쪽에 팁을 조심스럽게 소개하십시오.
   2. 타액을 얼음 위의 1.5 mL 튜브에 보관하고, 풀링하고, 앞서 설명한 바와 같이 -80°C에서 보관한다²⁷.
4. 타액 단백질 농도를 결정하고, 제조자의 권고에 따라 BCA 단백질 분석 키트(표 참조)를 사용하여 이전 연구(²⁷)에서와 같이 어류에 주입되는 단백질의 양을 확립한다.

3. 제브라피쉬의 유지 관리

1. 제브라피쉬를 27°C의 흐름수 시스템에서 14시간/10시간의 명암 주기로 유지합니다(그림 2).
2. 2일차까지 매일 오전 9시 30분과 오후 1시 30분에 건어물 사료(50-70μg/생선)를 생선에 먹이십시오.
3. 치료 주사 후 2일차부터 실험이 끝날 때까지 건견사료(50-70μg/생선)로 매일 오전 9시 30분과 오후 1시 30분에 생선을 먹이십시오

4. 제브라피쉬 주사

1. 암컷/수컷의 비율이 비슷하고 무게가 비슷한 그룹당 10마리의 물고기를 선택합니다.
   참고: 그룹 1에는 PBS가 주입된 물고기가 포함되고, 그룹 2에는 진드기 타액이 주입된 물고기가 포함되고, 그룹 3에는 α-Gal이 주입된 물고기가 포함됩니다.
2. 0.02% 트리카인 메탄설포네이트(MS-222)에 담가 물고기를 잠시 마취합니다(동영상 1).
   알림: 적절하게 마취된 물고기는 정상적인 호흡과 수영을 하지 않는 반면 물 탱크 바닥에 놓거나 떠 있을 수 있습니다. 가능한 생리적 손상을 피하기 위해 각 물고기를 개별적으로 마취해야합니다.
3. 어망을 사용하여 마취 된 물고기를 잡습니다.
4. 젖은 스폰지에 집게나 손을 사용하여 물고기를 반쪽에 조심스럽게 놓고 꼬리 지느러미를 오른쪽에 놓고 병변을 조절하기 위해 같은 방향으로 화합물을 주입합니다.
5. 이전 연구²⁶에서와 같이 꼬리 지느러미까지 5mm, 물고기의 몸과 관련하여 45° 각도로 근육에 물고기 그룹을 피내로 주입합니다(동영상 2). PBS 10μL에 I. ricinus 타액(진드기 타액), 10μL PBS(α-Gal)에 5μg의 α-Gal 10μL, 10μL의 -Gal이 포함된 1cm, 29G 바늘이 장착된 100μL 주사기로^{앞서 설명한 대로} 0, 3, 8일에 적절한 처리를 사용하십시오.²⁷,  및 10μL의 PBS(그림 3).
   알림: 동물의 물리적 손상을 방지하기 위해 신속하고 신중하게 취급해야 합니다.
   진드기 타액의 다른 생체 분자는 이 프로토콜에 따라 평가할 수 있습니다.
6. 처리 된 물고기를 회복을 위해 마취없이 담수 탱크에 다시 넣으십시오.
   알림: 같은 그룹의 모든 물고기는 회수를 위해 동일한 수조에 넣을 수 있습니다.

5. 제브라피쉬 먹이주기

1. 박격포와 유봉으로 개밥을 으깬다.
2. 2일차까지 건어물 사료와 함께 매일 오전 9시 30분과 오후 1시 30분에 50-70μg/생선을 먹이십시오.
3. 치료 주사 후 2일차부터 8일차 실험이 끝날 때까지 으깬 개 사료로 매일 오전 9시 30분과 오후 1시 30분에 50-70μg/생선을 먹이십시오.
   참고: 다양한 접종에 걸쳐 처리 또는 사료에 반응하여 α-Gal 또는 IgE 항체에 대한 면역 마커 또는 항체 역가를 평가해야 하는 경우 실험이 끝날 때까지 급여가 필요합니다.

6. 제브라피쉬의 알레르기 반응, 병변 및 행동 평가

1. 돋보기 또는 실체 현미경을 사용하여 출혈성 알레르기 반응 (피부 발적, 변색 및 출혈)을 정확하게 검사하고 표 1 에 포함 된 분류에 따라 물고기의 출현 위치를 나타냅니다 (그림 4A).
   참고 : 그림 4 에 제시된 알레르기 반응은 진드기 타액을 주사하고 붉은 고기를 함유 한 사료를 섭취 한 후에 나타났습니다. 따라서 설명된 반응은 임상적 맥락에서 유사한 반응이 나타나기 때문에 AGS와 관련된 반응 유형입니다.
   1. 치료 후 그리고 물고기가 물 탱크에있는 동안 하루에 두 번 음식을 투여하는 동안 반응이 나타나는지 관찰하십시오.
2. 표 1에 포함된 분류에 따라 수영 패턴(이동성, 속도, 물탱크 바닥에 움직이지 않고 서 있는 것, 지그재그 수영)의 변화(²⁷)를 평가하여 물고기의 행동을 조사합니다.
3. 누적 사망률을 평가하여 사망 시간/날짜를 포함하여 죽은 물고기의 수를 보고합니다(그림 4B).
   참고: 모든 매개변수는 처리 직후 또는 사료 변경 후 평가되고 정성적 변수를 분류하는 8일째 실험이 끝날 때까지 매일 추적됩니다(표 1). 권장 사항으로, 이 평가는 제브라피쉬에 대한 지식이 있는 전문가가 수행하여 이 동물 모델에 대한 배경과 경험을 기반으로 행동 변화를 고려해야 합니다.
4. 각 그룹에서 보고된 알레르기 반응, 비정상적인 행동 및 섭식 변화로 하루에 제브라피쉬의 수를 계산하고 일원 분산 분석으로 그룹 간 비교합니다.

7. 시료 채취

1. 8일째에 0.04% MS-222에 담가 물고기를 안락사시킨다.
   참고: 또한 시험 기간 동안 알레르기 반응으로 사망한 물고기에서 샘플을 수집하십시오.
2. 핀으로 파라핀 판에 물고기를 고정하십시오.
3. 안락사 직후, 아가미에 혈액이 아직 관개되어 있을 때 1cm, 29G 바늘이 장착된 0.5mL 주사기를 사용하여 물고기의 아가미 혈관(²⁹ )에서 혈청을 채취합니다. 사용할 때까지 -20°C의 1.5mL 튜브에 보관합니다(동영상 3).
4. 메스 칼날로 물고기를 시상 모양으로 자르고 내부 병변 (출혈성 병변 또는 육아종)^27,30이 나타나면 평가하십시오.
   참고: 병변이 반드시 나타나는 것은 아니지만 나타나는 경우 등록해야 합니다.
5. 앞서 설명한³¹과 같이 각 물고기의 장(동영상 4)과 신장(동영상 5)을 별도의 빈 1.5mL 튜브에 수집하고 -80°C에서 보관합니다(그림 4C).
6. RNA 정제 키트를 사용하여 제브라피쉬 장 및 신장 샘플에서 총 RNA를 추출합니다( 재료 표 참조).
7. 앞서 설명한 바와 같이 면역반응과 관련된 유전자의 발현을 제브라피쉬에서^30,32(프라이머 서열은 표 2 참조)로 분석하고^, 제조사의 지시에 따라 RT-qPCR에 대한 역전사 믹스를 이용하여 정량적 역전사-중합효소연쇄반응(RT-qPCR)을 수행하였다. D. rerio GAPDH에 대해 mRNA cT 값을 정규화하고 분산이 같지 않은 Student t-검정을 사용하여 그룹(타액으로 처리된 물고기, α-Gal 및 PBS 처리된 그룹) 간에 비교합니다.
8. 이전에 설명한 대로 혈청 샘플에서 제브라피쉬의 α-Gal을 인식하는 IgM 항체 역가를 결정합니다^27,30. 플레이트 리더를 사용하여 항체 역가를 OD _450nm 값으로 기록하고 분산이 같지 않은 Student t-test를 사용하여 그룹(타액으로 처리된 물고기, α-Gal 및 PBS 처리된 그룹) 간에 비교합니다.
   참고: IgM 항체 역가 측정 및 발현 유전자 분석은 선택 사항이며 면역학적 정보가 필요한 경우에만 수행됩니다. RT-qPCR mix는 real-time qPCR을 이용한 유전자 발현 분석을 위한 1가닥 cDNA 합성 키트입니다.

결과

여기에 제시된 프로토콜은 이전에 발표된 실험^27,30의 여러 측면과 인간과 제브라피쉬 모두 이 분자를 합성하지 않기 때문에 AGS 및 α-Gal에 대한 면역 반응에 대한 연구를 위해 제브라피쉬 모델이 확립되고 검증된 실험실에서 수행된 결과를 기반으로 합니다¹³. 이 모델을 사용하면 진드기 타액에 대한 숙주 반응(그림 4

토론

Zebrafish는 면역 반응, 병원체 질병, 신약 테스트, 예방 접종 및 감염 예방의 분자 메커니즘 연구를 위한 매우 실현 가능한 도구이기도 한 비용 효율적이고 다루기 쉬운 모델입니다^33,34,35. 제브라 피쉬의 행동에 대한 연구는 이전 연구에서 일부 물고기 종은 스트레스를 받으면 탱크 바닥에서 움직이지 않고 음식 소비에 영향을 미...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube	VWR	525-0990
All Prep DNA/RNA	Qiagen	80284
Aquatics facilities
BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Disection set	VWR	631-1279
Dog Food - Red Classic	Acana
ELISA plates-96 well	Thermo Fisher Scientific	10547781
Gala1-3Gal-BSA 3 (α-Gal)	Dextra	NGP0203
iScript Reverse Transcription Supermix	Supermix	1708840
Microliter syringes	Hamilton	7638-01
Plate reader	any
Phosphate buffered saline	Sigma	P4417-50TAB
pilocarpine hydrochloride	Sigma	P6503
Pipette tip P10	VWR	613-0364
Pipette tip P1000	VWR	613-0359
Premium food tropical fish	DAPC
Sponge Animal Holder			Made from scrap foam
Stereomicroscope	any
Thermal Cycler Real-Time PCR	any
Tricaine methanesulphonate (MS-222)	Sigma	E10521