Una tubería para caracterizar defectos cardíacos estructurales en el ratón fetal

Resumen

Este artículo detalla los métodos de diagnóstico de cardiopatía congénita (CHD) murina mediante ecocardiografía fetal, necropsia y captura de imágenes de fluorescencia episcópica (EFIC) mediante microscopía confocal episcópica (ECM) seguida de reconstrucción tridimensional (3D).

Resumen

Las enfermedades cardíacas congénitas (CHD, por sus siglas en inglés) son las principales causas de muerte infantil en los Estados Unidos. En la década de 1980 y antes, la mayoría de los pacientes con cardiopatía coronaria moderada o grave murieron antes de la edad adulta, con la mortalidad máxima durante la primera semana de vida. Los avances notables en las técnicas quirúrgicas, los enfoques de diagnóstico y el tratamiento médico han llevado a mejoras notables en los resultados. Para abordar las necesidades críticas de investigación para comprender los defectos cardíacos congénitos, los modelos murinos han proporcionado una plataforma de investigación ideal, ya que tienen una anatomía cardíaca muy similar a la de los humanos y tasas de gestación cortas. La combinación de ingeniería genética con herramientas de fenotipado de alto rendimiento ha permitido la replicación y el diagnóstico de defectos cardíacos estructurales para dilucidar aún más las vías moleculares detrás de las CHD. El uso de ecocardiografía fetal no invasiva para detectar los fenotipos cardíacos en modelos de ratón, junto con la alta fidelidad de la captura de imágenes de fluorescencia episcópica (EFIC) utilizando histopatología de microscopía confocal episcópica (ECM) con reconstrucciones tridimensionales (3D) permite una visión detallada de la anatomía de varios defectos cardíacos congénitos. Este protocolo describe un flujo de trabajo completo de estos métodos para obtener un diagnóstico preciso de defectos cardíacos congénitos murinos. La aplicación de este protocolo de fenotipado a organismos modelo permitirá un diagnóstico preciso de CHD, lo que proporcionará información sobre los mecanismos de CHD. La identificación de los mecanismos subyacentes de la cardiopatía coronaria brinda oportunidades para posibles terapias e intervenciones.

Introducción

Las cardiopatías congénitas (CHD) son el defecto congénito neonatal más común ^1,2, afectando alrededor del 0,8%-^1,7% de los neonatos y resultando en mortalidad y morbilidad neonatal significativa³. Una etiología genética está fuertemente indicada con CHD ^4,5. Los modelos de ratón modificados genéticamente se han utilizado ampliamente para comprender la complejidad de las CHD y los mecanismos que las causan debido a que los ratones tienen corazones de cuatro cámaras y secuencias de ADN de desarrollo cardíaco comparables en fetos de ratón y humanos⁶. La identificación del fenotipo de los mutantes de ratón es el primer paso fundamental para caracterizar la función del gen objetivo. Los modelos de ratón que expresan los efectos de la dosis génica, en los que una sola mutación genética puede dar lugar a un espectro de defectos cardíacos que imitan las CHD humanas, son importantes para comprender la complejidad de las CHD y los mecanismos que las causan.

Este artículo describe una tubería para caracterizar fenotipos cardíacos en modelos de ratón. Los métodos aplicados utilizan el ecocardiograma fetal 7, seguido de la necropsia y la histopatología de la MEC ^7,8, que puede mostrar la anatomía detallada del desarrollo de fenotipos cardíacos murinos. Un ecocardiograma fetal es una modalidad no invasiva que permite la visualización directa de múltiples embriones con una resolución de imagen razonable. Además, un ecocardiograma fetal proporciona una determinación rápida del número total de embriones en una camada, sus etapas de desarrollo y la orientación relativa y la ubicación en el cuerno uterino. Usando un flujo espectral Doppler/color, se pueden identificar embriones anormales en función de la estructura, la alteración hemodinámica, la restricción del crecimiento o el desarrollo de hidropesía. Dado que un estudio de ecocardiograma fetal es una técnica no invasiva, se puede utilizar para escanear en varios días y para observar los cambios en la hemodinámica o la morfología cardíaca. La obtención de imágenes de alta calidad de ecocardiogramas fetales requiere práctica y habilidad, ya que los defectos cardíacos específicos pueden pasarse por alto debido a la falta de experiencia y conocimiento. Debido a esto, se puede obtener un análisis más definitivo de la morfología cardíaca a través de una combinación de necropsia e histopatología de la MEC. La necropsia proporciona una visualización directa de la estructura del arco, las relaciones relativas de la aorta y la arteria pulmonar, el tamaño de los ventrículos y las aurículas, la posición del corazón en relación con el tórax y las estructuras broncopulmonares. Sin embargo, las características interiores, como las válvulas cardíacas y el grosor de la pared, pueden ser difíciles de evaluar solo con necropsia. Por lo tanto, se recomienda la histopatología de la ECM para un diagnóstico concluyente. La histopatología ECM es una técnica de visualización de alta resolución que permite la reconstrucción 2D y 3D de la pila de imágenes⁹. Estas imágenes se obtienen a través de imágenes fluorescentes episcópicas seriadas de una muestra incrustada en parafina, ya que está finamente seccionada a un intervalo constante por un micrótomo automático. A diferencia de la histología clásica, las imágenes se capturan como una sección antes de cortarse del bloque de modo que todas las imágenes se capturan dentro del mismo marco de referencia. Debido a esto, la pila de imágenes 2D producida por la histopatología ECM puede reconstruirse de manera fácil y confiable en tres dimensiones. Esto se hace utilizando un visor DICOM, que permite la visualización 3D de las imágenes en los tres planos anatómicos: coronal, sagital y transversal. A partir de estas reconstrucciones 3D de alta resolución, se puede hacer un diagnóstico cardíaco definitivo. La aplicación de estas tres modalidades de visualización diferentes, ya sea individualmente o en combinación, puede proporcionar caracterizaciones precisas de defectos cardíacos estructurales en embriones de ratón.

Protocolo

El uso de ratones para estos estudios es necesario ya que los ratones tienen corazones de cuatro cámaras que pueden imitar las CHD humanas. Los ratones recibieron atención veterinaria y se alojaron en el centro de cuidado de animales acreditado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC) de la institución. Se siguieron protocolos estrictos para minimizar la incomodidad, el estrés, el dolor y las lesiones de los ratones. Los ratones fueron sacrificados usando gas_CO2 , que es aceptable para roedores pequeños de acuerdo con las Pautas de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria sobre Eutanasia. Los estudios en ratones en este manuscrito se llevaron a cabo con un protocolo IACUC aprobado en la Universidad de Pittsburgh.

1. Ecocardiograma fetal

NOTA: Un ecocardiograma es una herramienta poderosa para identificar malformaciones cardiovasculares y defectos extracardíacos en ratones. Debido al pequeño tamaño de los embriones de ratón (alrededor de 1-2 mm en la mitad de la gestación, 3,5 mm al nacer), se requiere equipo ecocardiográfico de frecuencia ultra alta con biomicroscopía de ultrasonido (UBM). UBM proporciona diferentes sondas de alta frecuencia (30-50 MHz) con una pequeña ventana de imagen (15 mm x 14 mm) que proporciona la resolución (30 μm axial x 68 μm lateral) para visualizar un feto de ratón a la vez. Un transductor de 40 MHz proporciona imágenes de alta resolución para identificar fenotipos cardiovasculares⁷.

1. Encienda la máquina de ecocardiograma y seleccione el programa Cardiología.
   NOTA: El siguiente protocolo se puede utilizar para cualquier fondo de ratón desde el día embrionario (E)14.5 hasta el 19.5.
2. Anestesiar al ratón deseado en una cámara de inducción anestésica. Inducir la anestesia utilizando una concentración de 4% de isoflurano y oxígeno médico a un caudal de 1 L/min y reducirla a 2%-3% para el mantenimiento.
3. Coloque el ratón en la plataforma de imágenes rápidamente. La plataforma de imágenes tiene acero calentado para mantener el ratón caliente durante el procedimiento. Coloque la boca y la nariz del ratón en el cono nasal anestésico. Asegure las extremidades con cinta adhesiva para evitar el movimiento. Controle la frecuencia cardíaca para asegurarse de que se mantenga entre 400-450 lpm.
4. Controle la temperatura con una sonda de termómetro rectal y asegúrese de que descanse a 37 °C ± 0,5 °C. Controle la respiración para evitar la hipoxia. Mantenga una fuerza suave en la sonda para evitar daños.
   NOTA: Se puede colocar una lámpara de calor sobre el ratón para evitar la hipotermia mientras está bajo y para recuperarse de la anestesia. El ungüento oftálmico de vaselina se puede usar como lubricante para evitar la sequedad en los ojos.
5. Retire el pelaje del tórax y el abdomen con crema depilatoria. Aplicar la crema y esperar 3 min antes de retirarla. Limpie el área con etanol al 70%. El etanol funciona mejor que el agua como lubricante de afeitado.
6. Caliente el gel de ultrasonido a una temperatura corporal normal. Aplique el gel de ultrasonido generosamente y coloque el transductor en el abdomen para orientarlo en un plano horizontal e identificar la vejiga en la pantalla. Una vez que se identifica la vejiga, escanee cranealmente desde la vejiga y busque al feto. Mida la longitud de la corona a la grupa para determinar la edad gestacional¹⁰ (Figura 1 y Tabla 1).
   NOTA: Cambie las posiciones del transductor para visualizar diferentes planos, incluidos los planos transversales de imágenes de cuatro cámaras, sagitales y frontales/coronales⁷ (Figura 1).
7. Use el Doppler color para analizar el flujo sanguíneo del corazón.
8. Vuelva a colocar el ratón en la jaula si los embriones no han alcanzado la etapa prevista. De lo contrario, prepare el mouse para la cosecha.
   NOTA: Asegúrese de que el ratón ya esté despierto y recuperándose bien de la anestesia antes de volver a colocarlo en la jaula.
9. Apague el isoflurano y el oxígeno, limpie el área de trabajo y apague la máquina.
   NOTA: Es importante retirar el gel del transductor.

2. Necropsia

NOTA: Una vez que se sospechan fenotipos cardíacos anormales mediante ecocardiografía fetal, los fetos se recogen y fijan mediante inmersión de cuerpo completo en la solución fijadora: fosfato de formalina tamponado al 10% o paraformaldehído al 4% (PFA). Inspeccionar la morfología externa e interna de la muestra, en busca de anomalías o malformaciones anatómicas macroscópicas.

1. Prepare el ratón.
   1. Si el ratón es adulto, eutanasia al ratón utilizando un protocolo estándar de_CO2 . Use fórceps o tijeras de disección para hacer incisiones (aproximadamente 3 cm) en el tórax lateral y el abdomen para permitir la penetración del fijador en los órganos internos.
      NOTA: La muestra debe fijarse durante al menos 24 h antes de la necropsia si el embrión es mayor de E14.5.
2. Analiza el exterior del cuerpo.
   1. Configure el software para guardar las imágenes con un nombre, incluida la identificación de la muestra, el aumento del microscopio y el contenido de la imagen.
      NOTA: La ampliación de 1.0x a 3.2x debe ser adecuada para obtener imágenes de la mayoría de las estructuras en ratones E14.5 o mayores.
   2. Coloque el ratón sobre la placa debajo de la lente del microscopio estereoscópico. Llene la placa con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para cubrir completamente la muestra y evitar la deshidratación y la reflexión en las imágenes. Ajuste el aumento para que la pantalla incluya todo el embrión y luego tome una foto de los lados izquierdo y derecho del embrión.
      NOTA: La parte inferior de la placa debe estar recubierta con parafina, silicio u otro sustrato similar para facilitar la fijación.
   3. Fije la muestra a través de su garganta, mirando hacia arriba, y tome otra foto.
      NOTA: Oriente el pasador ligeramente hacia arriba para asegurarse de que no se perforen estructuras importantes de la cavidad torácica.
3. Analiza el pecho.
   1. Mientras levanta la piel en el medio del cuello con fórceps, corte la piel hacia ambas axilas con las tijeras antes de cortar la piel a lo largo del eje mediano hacia la cola. Luego, corte la piel desde el ombligo hasta las piernas. Fije la muestra a través de sus muñecas y tobillos.
      NOTA: Tenga cuidado de cortar sólo la piel. Se recomienda sostener las hojas de la tijera horizontalmente o en ángulo hacia arriba.
   2. Para romper el tejido conectivo, levante la piel con un par de fórceps mientras mantiene el tejido subyacente en su lugar con el otro par. Fije la muestra a través de la piel para ayudar a exponer el tórax y el abdomen (Figura 2).
      NOTA: Demasiado estiramiento al fijar, cortar o raspar puede provocar daños en los tejidos.
   3. Tome una foto de los músculos expuestos y luego raspe suavemente los músculos para exponer las costillas.
   4. Tome una foto de las costillas expuestas. Separe las costillas del diafragma y corte las costillas en ambos lados lo más lejos posible en el eje lateral hacia el cuello.
   5. Exponga el corazón quitando las costillas cortadas. Toma una foto del corazón.
   6. Retire el timo pelándolo con un par de fórceps. Use el otro par de pinzas para estabilizar la base del timo para evitar desgarrar cualquier vaso subyacente. Toma fotografías del corazón y de los grandes vasos.
      NOTA: El uso de pines para estirar algunas estructuras adyacentes puede ayudar a obtener mejores vistas de imágenes. Además, tome fotos separadas enfocadas en las grandes arterias, el corazón y otras estructuras de interés, ya que es posible que no estén enfocadas juntas.
4. Analizar el abdomen.
   1. Tire del diafragma para retirarlo y exponer el hígado. Toma una foto.
   2. Fije el hígado para exponer el estómago y el páncreas. Toma una foto.
   3. Cortar el esófago. Extirpe el colon y los intestinos sacándolos con fórceps. Corte justo por encima del hígado y retírelo para revelar los riñones y las glándulas suprarrenales. Toma una foto.
      NOTA: Los órganos extirpados deben mantenerse en la solución fijadora.
5. Aislar el tórax para el análisis de ECM.
   1. Corte la parte inferior del tórax a lo largo de una línea recta entre el hígado y los pulmones. Corte la cabeza lo suficientemente alta como para no cortar las ramificaciones de las arterias carótidas.
   2. Retire suavemente las costillas laterales mientras mantiene las costillas dorsales y la columna vertebral. Despegue y raspe la grasa dorsal.
   3. Separe el tórax del resto del cuerpo y colóquelo en una solución de fosfato de formalina tamponada al 10%.

3. Incrustación

1. Decantar el fijador en una botella de residuos peligrosos apropiada. Lave las muestras con 1x PBS durante 15 minutos tres veces.
2. Use concentraciones crecientes de etanol y xileno para deshidratar las muestras. La duración de todos los siguientes pasos depende de la etapa de los embriones. Consulte la Tabla 2 para obtener más detalles.
   NOTA: Se debe tener precaución al cambiar las soluciones para evitar dañar las muestras. Los parámetros óptimos para el procesamiento de muestras se pueden ajustar empíricamente. El xileno disolverá ciertos plásticos; Se deben utilizar instrumentos y recipientes de vidrio.
3. Reemplace el xileno con parafina durante el tiempo deseado. Dejar los frascos en una incubadora a 65 °C durante el tiempo adecuado (Tabla 2).
4. Use parafina fresca para incrustar las muestras en la posición deseada.
   NOTA: Se recomienda orientar la muestra hacia el centro del bloque de parafina, con su lado dorsal mirando hacia la parte superior y el lado posterior hacia el frente del bloque. Al orientar la muestra, recuerde que la muestra está incrustada con el bloque boca abajo.

4. Microscopía confocal episcópica (ECM)

NOTA: Después de una incrustación apropiada, los embriones se someten a la recolección de imágenes en serie a través de ECM para el análisis histopatológico. Los portaobjetos individuales se pueden recuperar del microtomo para estudios adicionales.

1. Saque el bloque de parafina del congelador a -20 °C y retire los moldes metálicos.
2. Use una cuchilla de afeitar para recortar la cera en los bordes y la parte posterior del cassette. Corte la cera que rodea la muestra hasta que quede encerrada en un pequeño cuadrado de cera unido al casete.
   NOTA: Tenga mucho cuidado al manipular cuchillas.
3. Use la palanca de metal para sujetar el bloque de parafina contra la etapa de corte del micrótomo. Seleccione la función MAN (manual) en el modo de ejecución, levante la superficie de la parafina cerca de la cuchilla y ejecute algunas diapositivas para asegurarse de que la cuchilla entre en contacto con el bloque de parafina.
4. Abra la aplicación LAS AF y seleccione MatrixScreener. Seleccione Matriz regular única y cargue la plantilla adecuada guardada previamente. Haga clic en el botón Quick LUT para cambiar a ombre blanco y naranja.
5. Seleccione Configurar trabajos y arrastre el láser visible de 405 nm al máximo. Haga coincidir el borde izquierdo del bloque de espectro con la línea de 405 nm y arrastre el borde derecho hasta la línea de 800 nm. Marque la opción Pinhole e inicie la vista en vivo .
6. Ajuste la posición de la proyección láser para centrar la muestra en la pantalla y ajuste la perilla de zoom a ~ 20x. Para optimizar la resolución, ajuste la ganancia a 1.250 V y maximice el área azul usando la perilla de enfoque; luego, restablezca la ganancia a aproximadamente 750 V para obtener imágenes.
   NOTA: Los valores específicos pueden variar dependiendo de la condición del embrión.
7. Cambie el método de corte a Automático, ajuste el grosor a unos 50 μm y ejecute las diapositivas. Deje de cortar cuando los pulmones y las vías respiratorias estén a la vista.
8. Elija un grosor de corte entre 8-10 μm y detenga la vista en vivo . Abra Microtome Communicator para iniciar la creación de imágenes. Asegúrese de que la carpeta de almacenamiento temporal esté vacía antes de recopilar imágenes.
9. Deje de cortar cuando no se visualice ninguna estructura cardíaca adicional. Cierre la aplicación Microtome Communicator y exporte el archivo temporal a una .tiff serie de imágenes a través del software de procesamiento de imágenes para reconstrucciones 3D posteriores.

5. Reconstrucción tridimensional (3D)

NOTA: El propósito de la reconstrucción 3D es procesar una pila de imágenes 2D de imágenes ECM en videos 3D en las orientaciones coronal, sagital y transversal y usar los videos 3D para el diagnóstico de las anomalías estructurales y anatómicas en las muestras.

1. Abra la pila de imágenes ECM en el software de procesamiento de imágenes.
   1. Arrastre y suelte los archivos de imagen en el software de procesamiento de imágenes. Voltea las imágenes de ECM horizontalmente seleccionando Imagen > Transformar > Voltear horizontalmente en la barra de menús.
   2. Guarde la imagen volteada y cierre el software de procesamiento de imágenes.
2. Importe la pila de imágenes ECM en el software de visualización DICOM.
   1. Arrastre y suelte las imágenes ECM volteadas horizontalmente en el software de visualización DICOM. Asegúrese de que haya un borde azul claro alrededor de la lista de muestra, o se pueden agregar imágenes a una carpeta de muestra existente.
   2. Seleccione los vínculos o los archivos que desea copiar en la base de datos cuando aparezca la ventana emergente. Aparecerá una nueva muestra en la lista de muestras con el mismo nombre que el archivo copiado en el software de visualización DICOM.
   3. Haga clic en el archivo recién agregado para abrirlo.
3. Realizar reconstrucción 3D.
   1. Una vez abierto el archivo, haga clic en el menú Herramientas de reconstrucción 2D/ 3D de la barra de herramientas y seleccione MPR 3D.
   2. Para Pixel X Resolution y Pixel Y Resolution (Resolución de píxel X) y Pixel Y, introduce la resolución de la imagen proporcionando el zoom utilizado durante las imágenes ECM. Para el intervalo de corte, introduzca el grosor del sector utilizado para cortar durante la creación de imágenes de ECM.
      NOTA: La resolución de la cámara cambia dependiendo del zoom de la cámara y puede diferir de una cámara a otra.
4. Utilice las diferentes herramientas de la pestaña Herramientas en el lado izquierdo para ajustar las pilas de imágenes como desee.
   1. Utilice la herramienta WW/WL para ajustar el ancho y el nivel de ventana. Haga clic y arrastre la herramienta en la imagen hacia arriba para disminuir el brillo de la imagen y hacia abajo para aumentarlo. Haga clic y arrastre la herramienta en la imagen hacia la derecha para disminuir el contraste de la imagen y hacia la izquierda para aumentarlo.
      NOTA: La configuración óptima de WW/WL para una estructura puede ser subóptima para otra. Por esta razón, se recomienda crear videos separados para ver diferentes estructuras.
   2. Utilice la herramienta Panorámica para arrastrar las imágenes a las posiciones deseadas. Utilice la herramienta Zoom para ampliar o reducir la imagen como desee y la herramienta Girar para rotar la imagen como desee.
      NOTA: La ampliación de las imágenes puede causar una disminución de la calidad de la imagen. Tenga cuidado al rotar imágenes, ya que hacerlo puede hacer que los ejes se volteen.
5. Haga clic y arrastre el eje de color del primer panel. Observe cómo la rotación de este eje cambia la orientación de los otros dos paneles. Gire los ejes de los tres paneles hasta que los tres paneles representen vistas coronales, sagitales y transversales de la muestra.
   NOTA: Al reorientar las muestras, mantenga la orientación anterior / posterior correcta.
6. Generar vídeos.
   1. Una vez que los tres paneles estén correctamente posicionados, orientados e iluminados, haga clic en el panel que representa la vista coronal.
   2. Haga clic en Exportación de películas en el lado derecho de la barra de menú. Haga clic en Lote y arrastre los controles deslizantes Desde y Hasta para abarcar toda la región de interés. En Intervalo, seleccione la opción Igual que espesor . Guarde el video indicando la orientación de la vista.
   3. Revise el video para ver si las estructuras de interés se pueden identificar adecuadamente. Si no es así, utilice las herramientas (paso 5.4) para reajustar los vídeos según sea necesario y volver a guardar el vídeo.
7. Repita el paso 5.6 para las vistas transversal y sagital. Diagnostique las muestras utilizando videos reconstruidos.
   NOTA: Observe cuidadosamente los videos en cada orientación para hacer una evaluación completa de si la muestra presenta alguna anomalía anatómica o fenotipos de enfermedad (Figura 3).

Resultados

Se observó que los embriones de ratón con defectos hemodinámicos significativos eran letales embrionarios. Se puede identificar una amplia variedad de CHD a través del ecocardiograma fetal no invasivo de alto rendimiento utilizando diferentes vistas (Figura 1).

Defectos septales: Los CHD más comunes son defectos septales como un defecto septal ventricular (VSD), un defecto septal auriculoventricular (AVSD) y un defecto septal auricular (ASD)<...

Discusión

Se han utilizado ratones modificados genéticamente para comprender los mecanismos patológicos de los defectos cardíacos congénitos. Los protocolos que proporcionamos en este estudio intentan simplificar y estandarizar el proceso de evaluación de los defectos cardíacos fetales murinos. Sin embargo, hay pasos críticos a tener en cuenta durante el protocolo. Los embriones de ratón crecen significativamente durante cada día de gestación, y el momento correcto para cosechar un ratón se puede determinar realizando u...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4	Sigma Aldrich	P3813
1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage)	SealRite	1615-5599
10% buffered formalin phosphate solution	Fisher Chemical	SF100-4
100% Ethanol	Decon Laboratories	2701
16% paraformaldehyde (PFA) fixative	ThermoScientific	28908	4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C
50 mL tubes	Falcon	352070
6–12 Well plate or 20 mL vial  for embryo storage	Falcon	353046
Dissecting microscope	Leica	MDG36
Dissecting Pins (A1 or A2 grade)	F.S.T	26002-15
Dissecting Plate	F.S.T	FB0875713	Petri dish with paraffin base
Embedding molds	Sakura	4133
Extra narrow scissors (10.5 cm)	F.S.T	14088-10	1–2 pairs
Fiji application/Image J	NIH		Fiji.sc
Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm)	F.S.T	11252-00	2 Pairs
Hot forceps	F.S.T	11252-00	For orientation of embryos
Industrial Marker for Wax Blocks	Sharpie	2003898	Formatted for labratory use
Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera	Jenoptik	017953-650-26
Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software	Jenoptik		jenoptik.com
Large glass beaker	Fisher Scientific	S111053	For melting paraffin
Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics)	Leica	M165 FC
OsiriX MD Version 12.0	OsiriX		osirix-viewer.com
Paraplast embedding paraffin wax	Millipore Sigma	1003230215
Small glass beaker	Fisher Scientific	S111045
Small, perforated spoon (14.5 cm)	F.S.T	10370-17
Straight Vannas Scissors (4–8 mm)	F.S.T	15018-10	A pair
Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope	FUJIFILM VisualSonics Inc.	Vevo2100
Xylene	Fisher Chemical	UN1307