Fetal Faredeki Yapısal Kalp Kusurlarını Karakterize Etmek İçin Bir Boru Hattı

Özet

Bu makalede fetal ekokardiyografi, nekropsi ve Episkopik floresan görüntü yakalama (EFIC) ve ardından üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyon kullanılarak yapılan murin konjenital kalp hastalığı (KKH) tanı yöntemleri detaylandırılmıştır.

Özet

Konjenital kalp hastalıkları (KKH) Amerika Birleşik Devletleri'nde bebek ölümlerinin başlıca nedenleridir. 1980'lerde ve daha öncesinde, orta veya şiddetli KKH'li hastaların çoğu, yaşamın ilk haftasında maksimum mortalite ile yetişkinlikten önce öldü. Cerrahi tekniklerdeki, tanısal yaklaşımlardaki ve tıbbi yönetimdeki dikkate değer ilerlemeler, sonuçlarda belirgin iyileşmelere yol açmıştır. Konjenital kalp kusurlarını anlamanın kritik araştırma ihtiyaçlarını karşılamak için, murin modelleri, insanlara çok benzer kalp anatomisine ve kısa gebelik oranlarına sahip oldukları için ideal bir araştırma platformu sağlamıştır. Genetik mühendisliğinin yüksek verimli fenotipleme araçlarıyla kombinasyonu, CHD'lerin arkasındaki moleküler yolları daha da aydınlatmak için yapısal kalp kusurlarının replikasyonuna ve teşhisine izin vermiştir. Fare modellerinde kardiyak fenotipleri taramak için noninvaziv fetal ekokardiyografinin kullanılması, üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyonlarla Piskoposik konfokal mikroskopi (ECM) histopatolojisi kullanılarak Piskoposluk floresan görüntü yakalamanın (EFIC) yüksek doğruluğu ile birleştiğinde, çeşitli konjenital kalp defektlerinin anatomisine ayrıntılı bir bakış açısı sağlar. Bu protokol, murin konjenital kalp kusurlarının doğru bir teşhisini elde etmek için bu yöntemlerin eksiksiz bir iş akışını özetlemektedir. Bu fenotipleme protokolünün organizmaları modellemek için uygulanması, doğru KKH tanısına izin verecek ve KKH'nin mekanizmaları hakkında fikir verecektir. KKH'nin altında yatan mekanizmaların belirlenmesi, potansiyel tedaviler ve müdahaleler için fırsatlar sağlar.

Giriş

Konjenital kalp hastalıkları (KKH) en sık görülen yenidoğan doğum defekti ^1,2 olup, yenidoğanların yaklaşık %0,8-%^1,7'sini etkileyerek önemli neonatal mortalite ve morbidite ile sonuçlanır ³. Genetik etiyoloji, CHD ^4,5 ile güçlü bir şekilde endikedir. Genetiği değiştirilmiş fare modelleri, CHD'lerin karmaşıklığını ve farelerin dört odacıklı kalplere ve fare ve insan fetüslerinde karşılaştırılabilir kardiyak gelişimsel DNA dizilerine sahip olmaları nedeniyle bunlara neden olan mekanizmaları anlamak için yaygın olarak kullanılmıştır⁶. Fare mutantlarının fenotipini tanımlamak, hedeflenen genin işlevini karakterize etmede temel ilk adımdır. Tek bir genetik mutasyonun insan KKH'lerini taklit eden bir kardiyak defekt spektrumuna neden olabileceği gen dozaj etkilerini ifade eden fare modelleri, KKH'lerin karmaşıklığını ve bunlara neden olan mekanizmaları anlamak için önemlidir.

Bu makalede, fare modellerinde kardiyak fenotipleri karakterize etmek için bir boru hattı özetlenmektedir. Uygulanan yöntemlerde fetal ekokardiyogram 7, ardından gelişen murin kardiyak fenotiplerinin ayrıntılı anatomisini gösterebilen nekropsi ve ECM histopatolojisi ^7,8 kullanılmaktadır. Fetal ekokardiyografi, makul görüntüleme çözünürlüğü ile çoklu embriyoların doğrudan görüntülenmesini sağlayan noninvaziv bir modalitedir. Ek olarak, bir fetal ekokardiyogram, bir çöpteki toplam embriyo sayısının, gelişim aşamalarının ve uterus boynuzundaki göreceli oryantasyonun ve yerin hızlı bir şekilde belirlenmesini sağlar. Spektral Doppler/renk akışı kullanılarak anormal embriyolar yapıya, hemodinamik bozulmaya, büyüme kısıtlamasına veya hidrops gelişimine bağlı olarak tanımlanabilir. Fetal ekokardiyogram çalışması noninvaziv bir teknik olduğundan, birden fazla günde tarama yapmak ve hemodinamik veya kardiyak morfolojideki değişiklikleri gözlemlemek için kullanılabilir. Fetal ekokardiyogramların yüksek kaliteli görüntülenmesi pratik ve beceri gerektirir, çünkü deneyim ve bilgi eksikliği nedeniyle spesifik kalp kusurları gözden kaçırılabilir. Bu nedenle, nekropsi ve ECM histopatolojisinin bir kombinasyonu ile kardiyak morfolojinin daha kesin bir analizi elde edilebilir. Nekropsi, ark yapısının, aort ve pulmoner arterin göreceli ilişkilerinin, ventriküllerin ve atriyumun büyüklüğünün, kalbin göğse göre konumunun ve bronkopulmoner yapıların doğrudan görselleştirilmesini sağlar. Bununla birlikte, kalp kapakçıkları ve duvar kalınlığı gibi iç özelliklerin tek başına nekropsi ile değerlendirilmesi zor olabilir. Bu nedenle, kesin bir tanı için ECM histopatolojisi önerilir. ECM histopatolojisi, görüntü yığını^9'un hem 2B hem de 3B rekonstrüksiyonuna izin veren yüksek çözünürlüklü bir görselleştirme tekniğidir. Bu görüntüler, parafine gömülü bir numunenin seri Episkopik floresan görüntülemesi yoluyla, otomatik bir mikrotom tarafından tutarlı bir aralıkta ince bir şekilde kesitlendiği için elde edilir. Klasik histolojiden farklı olarak, görüntüler bloktan kesilmeden önce bir bölüm olarak yakalanır, böylece tüm görüntüler aynı referans çerçevesi içinde yakalanır. Bu nedenle, ECM histopatolojisi tarafından üretilen 2D görüntü yığını üç boyutlu olarak kolayca ve güvenilir bir şekilde yeniden yapılandırılabilir. Bu, üç anatomik düzlemdeki görüntülerin 3D görselleştirilmesine izin veren bir DICOM görüntüleyici kullanılarak yapılır: koronal, sagital ve enine. Bu yüksek çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyonlardan kesin bir kardiyak tanı konulabilir. Bu üç farklı görselleştirme yönteminin ayrı ayrı veya kombinasyon halinde uygulanması, fare embriyolarındaki yapısal kalp defektlerinin doğru karakterizasyonunu sağlayabilir.

Protokol

Bu çalışmalar için farelerin kullanılması, farelerin insan KKH'lerini taklit edebilen dört odacıklı kalplere sahip olmaları nedeniyle gereklidir. Farelere veteriner bakımı sağlanmış ve kurumun Laboratuvar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından akredite edilmiş hayvan bakım tesisinde barındırılmıştır. Farelerin rahatsızlığını, stresini, ağrısını ve yaralanmasını en aza indirmek için sıkı protokoller izlendi. Fareler, Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği Ötenazi Kılavuzlarına göre küçük kemirgenler için kabul edilebilir olan CO₂ gazı kullanılarak ötenazi yapıldı. Bu makalede fareler üzerinde yapılan çalışmalar, Pittsburgh Üniversitesi'nde onaylanmış bir IACUC protokolü ile gerçekleştirilmiştir.

1. Fetal ekokardiyogram

NOT: Bir ekokardiyogram, farelerde kardiyovasküler malformasyon ve ekstrakardiyak defektlerin tanımlanması için güçlü bir araçtır. Fare embriyolarının küçük boyutu nedeniyle (orta gebelikte yaklaşık 1-2 mm, doğumda 3.5 mm), ultrason biyomikroskopisi (UBM) ile ultra yüksek frekanslı ekokardiyografik ekipman gereklidir. UBM, bir seferde bir fare fetüsünü görselleştirmek için çözünürlük (30 μm eksenel x 68 μm yanal) sağlayan küçük bir görüntüleme penceresine (15 mm x 14 mm) sahip farklı yüksek frekanslı (30-50 MHz) problar sağlar. 40 MHz'lik bir dönüştürücü, kardiyovasküler fenotipleri⁷ tanımlamak için yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlar.

1. Ekokardiyogram makinesini açın ve Kardiyoloji programını seçin.
   NOT: Aşağıdaki protokol, embriyonik gün (E)14,5 ila 19,5 arasındaki herhangi bir fare arka planı için kullanılabilir.
2. İstenilen fareyi anestezik indüksiyon odasında anestezi altına alın. % 4'lük bir izofluran konsantrasyonu ve 1 L / dak akış hızında tıbbi oksijen kullanarak anesteziyi indükleyin ve bakım için% 2-3'e düşürün.
3. Fareyi hızlı bir şekilde görüntüleme platformuna yerleştirin. Görüntüleme platformu, işlem sırasında fareyi sıcak tutmak için ısıtılmış çeliğe sahiptir. Farenin ağzını ve burnunu anestezik burun konisine koyun. Hareketi önlemek için uzuvları bantla sabitleyin. Kalp atış hızını 400-450 bpm arasında kaldığından emin olmak için izleyin.
4. Bir rektal termometre probu kullanarak sıcaklığı izleyin ve 37 ° C'de ± 0,5 ° C'de durduğundan emin olun. Hipoksiyi önlemek için nefes almayı izleyin. Zararı önlemek için prob üzerinde nazik bir kuvvet tutun.
   NOT: Altındayken hipotermiyi önlemek ve anesteziden kurtulmak için farenin üzerine bir ısı lambası ayarlanabilir. Petrolatum oftalmik merhem, kuru gözlerden kaçınmak için bir kayganlaştırıcı olarak kullanılabilir.
5. Tüy dökücü krem kullanarak kürkü göğüs kafesinden ve karından çıkarın. Kremayı uygulayın ve çıkarmadan önce 3 dakika bekleyin. Bölgeyi% 70 etanol ile temizleyin. Etanol, tıraş yağlayıcısı olarak sudan daha iyi çalışır.
6. Ultrason jelini normal vücut sıcaklığına ısıtın. Ultrason jelini cömertçe uygulayın ve dönüştürücüyü yatay bir düzlemde yönlendirmek ve ekrandaki mesaneyi tanımlamak için karın üzerine yerleştirin. Mesane tanımlandıktan sonra, mesaneden kraniyal olarak tarayın ve fetüsü arayın. Gebelik yaşı^10'u belirlemek için taç-yumru uzunluğunu ölçün (Şekil 1 ve Tablo 1).
   NOT: Enine dört odacıklı, sagital ve ön/koronal görüntüleme düzlemleri⁷ dahil olmak üzere farklı düzlemleri görselleştirmek için dönüştürücü konumlarını değiştirin (Şekil 1).
7. Kalpten kan akışını analiz etmek için renkli Doppler'i kullanın.
8. Embriyolar amaçlanan aşamaya ulaşmamışsa fareyi tekrar kafese koyun. Aksi takdirde, fareyi hasat için hazırlayın.
   NOT: Fareyi tekrar kafese koymadan önce uyanık olduğundan ve anesteziden iyi bir şekilde kurtulduğundan emin olun.
9. İzofluran ve oksijeni kapatın, çalışma alanını temizleyin ve makineyi kapatın.
   NOT: Jeli dönüştürücüden çıkarmak önemlidir.

2. Nekropsi

NOT: Fetal ekokardiyografi kullanılarak anormal kardiyak fenotiplerden şüphelenildiğinde, fetüsler toplanır ve fiksatif çözeltiye tam vücut daldırma yoluyla sabitlenir: % 10 tamponlanmış formalin fosfat veya% 4 paraformaldehit (PFA). Makroskopik anatomik anormallikler veya malformasyonlar arayarak numunenin dış ve iç morfolojisini inceleyin.

1. Fareyi hazırlayın.
   1. Fare bir yetişkinse, standart bir CO₂ protokolü kullanarak fareyi ötenazi yapın. Fiksatifin iç organlara nüfuz etmesine izin vermek için lateral toraks ve karın bölgesinde insizyonlar (yaklaşık 3 cm) yapmak için forseps veya diseksiyon makası kullanın.
      NOT: Embriyo E14.5'ten büyükse, numune nekropsiden önce en az 24 saat sabitlenmelidir.
2. Vücudun dışını analiz edin.
   1. Fotoğrafları, numunenin tanımlanması, mikroskop büyütmesi ve resmin içeriği dahil olmak üzere bir adla kaydetmek için yazılımı ayarlayın.
      NOT: 1,0x ila 3,2x büyütme, E14.5 farelerde veya daha büyük farelerde çoğu yapıyı görüntülemek için yeterli olmalıdır.
   2. Fareyi stereomikroskop merceğinin altındaki plakaya yerleştirin. Resimlerde dehidrasyon ve yansımayı önlemek amacıyla numuneyi tamamen örtmek için plakayı fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurun. Büyütmeyi, ekran tüm embriyoyu içerecek şekilde ayarlayın ve ardından embriyonun hem sol hem de sağ taraflarının fotoğrafını çekin.
      NOT: Sabitlemeyi kolaylaştırmak için plakanın tabanı parafin, silikon veya başka bir substratla kaplanmalıdır.
   3. Numuneyi boğazından yukarı bakacak şekilde sabitleyin ve başka bir fotoğraf çekin.
      NOT: Torasik boşluğun önemli yapılarının delinmediğinden emin olmak için pimi hafifçe yukarı doğru yönlendirin.
3. Göğsü analiz edin.
   1. Boynun ortasındaki cildi forseps ile kaldırırken, deriyi medyan eksen boyunca kuyruğa doğru kesmeden önce deriyi makasla her iki koltuk altlarına doğru kesin. Ardından, cildi göbek kemiğinden bacaklara kadar kesin. Numuneyi bileklerinden ve ayak bileklerinden sabitleyin.
      NOT: Sadece cildi kesmeye dikkat edin. Makasın bıçaklarının yatay veya yukarı doğru açılı tutulması önerilir.
   2. Bağ dokusunu kırmak için, altta yatan dokuyu diğer çiftle yerinde tutarken cildi bir çift forseps ile kaldırın. Göğsün ve karnın açığa çıkmasına yardımcı olmak için numuneyi deriden geçirin (Şekil 2).
      NOT: Sabitleme, kesme veya kazıma sırasında çok fazla germe doku hasarına neden olabilir.
   3. Açıkta kalan kasların fotoğrafını çekin ve ardından kaburgaları ortaya çıkarmak için kasları yavaşça kazıyın.
   4. Açıkta kalan kaburgaların fotoğrafını çekin. Kaburgaları diyaframdan ayırın ve her iki taraftaki kaburgaları yanal eksende boyuna doğru mümkün olduğunca kesin.
   5. Kesilmiş kaburgaları çıkararak kalbi açığa çıkarın. Kalbin fotoğrafını çekin.
   6. Timüsü bir çift forseps ile soyarak çıkarın. Altta yatan damarların yırtılmasını önlemek için timus tabanını stabilize etmek için diğer forseps çiftini kullanın. Kalbin ve büyük kapların fotoğraflarını çekin.
      NOT: Bazı bitişik yapıları germek için pimlerin kullanılması, daha iyi görüntüleme görünümleri elde etmenize yardımcı olabilir. Ek olarak, büyük arterlere, kalbe ve diğer ilgi çekici yapılara odaklanmış ayrı fotoğraflar çekin, çünkü bunlar birlikte odaklanmayabilir.
4. Karnı analiz edin.
   1. Diyaframı çıkarmak ve karaciğeri açığa çıkarmak için çekin. Fotoğraf çekin.
   2. Mide ve pankreası açığa çıkarmak için karaciğeri geri sabitleyin. Fotoğraf çekin.
   3. Yemek borusunu kesin. Kolonu ve bağırsakları forseps ile çekerek çıkarın. Karaciğerin hemen üstünde kesin ve böbrekleri ve adrenal bezleri ortaya çıkarmak için çıkarın. Fotoğraf çekin.
      NOT: Çıkarılan organlar fiksatif solüsyonda tutulmalıdır.
5. ECM analizi için toraksı izole edin.
   1. Alt toraksı karaciğer ve akciğerler arasındaki düz bir çizgi boyunca kesin. Başını, karotis arterlerin dallarını kesmeyecek kadar yüksek kesin.
   2. Dorsal kaburgaları ve omurgayı korurken yanal kaburgaları yavaşça çıkarın. Sırt yağını soyun ve kazıyın.
   3. Toraksı vücudun geri kalanından ayırın ve% 10 tamponlu formalin fosfat çözeltisine yerleştirin.

3. Katıştırma

1. Fiksatifi uygun bir tehlikeli atık şişesine boşaltın. Numuneleri 15 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez yıkayın.
2. Numuneleri kurutmak için artan konsantrasyonlarda etanol ve ksilen kullanın. Aşağıdaki adımların tümünün süresi embriyoların aşamasına bağlıdır. Ayrıntılar için lütfen Tablo 2'ye bakın.
   NOT: Numunelere zarar vermemek için çözeltileri değiştirirken dikkatli olunmalıdır. Numune işleme için en uygun parametreler ampirik olarak ayarlanabilir. Ksilen bazı plastikleri çözecektir; cam aletler ve kaplar kullanılmalıdır.
3. Ksilen'i istenen süre boyunca parafin ile değiştirin. Şişeleri uygun süre boyunca 65 °C'lik bir inkübatörde bırakın (Tablo 2).
4. Numuneleri istenen konuma yerleştirmek için taze parafin kullanın.
   NOT: Numunenin parafin bloğun ortasına, dorsal tarafı üste ve arka tarafı bloğun önüne bakacak şekilde yönlendirilmesi önerilir. Numuneyi yönlendirirken, numunenin blok baş aşağı bakacak şekilde gömüldüğünü unutmayın.

4. Episkopik konfokal mikroskopi (ECM)

NOT: Uygun gömme işleminden sonra, embriyolar histopatoloji analizi için ECM aracılığıyla seri olarak görüntü toplamaya tabi tutulur. Daha ileri çalışmalar için mikrotomdan bireysel slaytlar kurtarılabilir.

1. Parafin bloğunu -20 °C dondurucudan çıkarın ve metal kalıpları çıkarın.
2. Kasetin kenarlarındaki ve arkasındaki balmumunu kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Numuneyi çevreleyen balmumunu, kasete tutturulmuş küçük bir balmumu karesi içine alınana kadar kesin.
   NOT: Bıçakları tutarken çok dikkatli olun.
3. Parafin bloğunu mikrotomun dilimleme aşamasına karşı sıkıştırmak için metal kolu kullanın. Çalıştırma Modu'nda MAN (manuel) işlevini seçin, parafinin yüzeyini bıçağa yakın bir yere kaldırın ve bıçağın parafin bloğuna temas ettiğinden emin olmak için birkaç slayt çalıştırın.
4. LAS AF uygulamasını açın ve MatrixScreener'ı seçin. Tek Normal Matris'i seçin ve önceden kaydedilmiş uygun şablonu yükleyin. Beyaz ve turuncu ombre'ye geçmek için Hızlı LUT düğmesine tıklayın.
5. İşleri Ayarla'yı seçin ve 405 nm görünür lazeri maksimuma sürükleyin. Spektrum bloğunun sol kenarını 405 nm çizgisiyle eşleştirin ve sağ kenarı 800 nm çizgisine sürükleyin. İğne Deliği seçeneğini işaretleyin ve Canlı görünümü başlatın.
6. Numuneyi ekranda ortalamak için lazer projeksiyonun konumunu ayarlayın ve Yakınlaştırma düğmesini ~ 20x olarak ayarlayın. Çözünürlüğü optimize etmek için kazancı 1.250 V'a ayarlayın ve odak düğmesini kullanarak mavi alanı en üst düzeye çıkarın; Ardından, görüntüleme için kazancı yaklaşık 750 V'a sıfırlayın.
   NOT: Spesifik değerler embriyonun durumuna bağlı olarak değişebilir.
7. Kesme yöntemini Otomatik olarak değiştirin, kalınlığı yaklaşık 50 μm'ye ayarlayın ve slaytları çalıştırın. Akciğerler ve hava yolu göründüğünde kesmeyi bırakın.
8. 8-10 μm arasında bir kesme kalınlığı seçin ve Canlı görüntüyü durdurun. Görüntülemeye başlamak için Microtome Communicator'ı açın. Görüntüleri toplamadan önce geçici depolama klasörünün boş olduğundan emin olun.
9. Ek bir kalp yapısı görselleştirilmediğinde kesmeyi bırakın. Microtome Communicator uygulamasını kapatın ve geçici dosyayı daha sonra 3D rekonstrüksiyonlar için görüntü işleme yazılımı aracılığıyla bir .tiff görüntü serisine aktarın.

5. Üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyon

NOT: 3D rekonstrüksiyonun amacı, ECM görüntülemeden koronal, sagital ve enine oryantasyonlarda 3D videolara bir 2D görüntü yığınını işlemek ve örneklerdeki yapısal ve anatomik anormalliklerin teşhisi için 3D videoları kullanmaktır.

1. Görüntü işleme yazılımında ECM görüntü yığınını açın.
   1. Görüntü dosyalarını görüntü işleme yazılımına sürükleyip bırakın. Menü çubuğunda Görüntü > Dönüştür > Yatay Çevir'i seçerek ECM görüntülerini yatay olarak çevirin .
   2. Çevrilen görüntüyü kaydedin ve görüntü işleme yazılımını kapatın.
2. ECM görüntü yığınını DICOM görüntüleme yazılımına aktarın.
   1. Yatay olarak çevrilmiş ECM görüntülerini DICOM görüntüleme yazılımına sürükleyip bırakın. Örnek listesinin etrafında açık mavi bir kenarlık olduğundan emin olun, aksi takdirde görüntüler varolan bir örnek klasöre eklenebilir.
   2. Açılır pencere göründüğünde veritabanına kopyalanacak bağlantıları veya dosyaları seçin. Örnek listesinde, DICOM görüntüleme yazılımına kopyalanan dosyayla aynı ada sahip yeni bir örnek görünür.
   3. Açmak için yeni eklenen dosyaya tıklayın.
3. 3B rekonstrüksiyon gerçekleştirin.
   1. Dosya açıldıktan sonra, araç çubuğundan 2D / 3D Yeniden Yapılandırma Araçları menüsüne tıklayın ve 3D MPR'yi seçin.
   2. Pixel X Çözünürlük ve Piksel Y Çözünürlüğü için, ECM görüntüleme sırasında kullanılan yakınlaştırmayı vererek görüntü çözünürlüğünü girin. Dilim Aralığı için, ECM görüntüleme sırasında kesmek için kullanılan dilim kalınlığını girin.
      NOT: Kamera çözünürlüğü kameranın yakınlığına bağlı olarak değişir ve fotoğraf makinesinden kameraya farklılık gösterebilir.
4. Görüntü yığınlarını istediğiniz gibi ayarlamak için sol taraftaki Araçlar sekmesindeki farklı araçları kullanın.
   1. Pencere Genişliğini ve Pencere Düzeyini ayarlamak için WW/WL aracını kullanın. Görüntü parlaklığını azaltmak için görüntü üzerindeki aracı tıklayıp yukarıya, artırmak için aşağı doğru sürükleyin. Görüntü kontrastını azaltmak için görüntüdeki aracı tıklayıp sağa ve artırmak için sola doğru sürükleyin.
      NOT: Bir yapı için en uygun WW/WL ayarları başka bir yapı için yetersiz olabilir. Bu nedenle, farklı yapıları görüntülemek için ayrı videolar oluşturmanız önerilir.
   2. Görüntüleri istediğiniz konumlara sürüklemek için Pan aracını kullanın. Görüntüyü istediğiniz gibi büyütmek veya küçültmek için Yakınlaştırma aracını ve görüntüyü istediğiniz gibi döndürmek için Döndürme aracını kullanın.
      NOT: Görüntülerin büyütülmesi, görüntü kalitesinin düşmesine neden olabilir. Görüntüleri döndürürken dikkatli olun, çünkü bunu yapmak eksenlerin dönmesine neden olabilir.
5. İlk panelin renkli eksenini tıklatıp sürükleyin. Bu ekseni döndürmenin diğer iki panelin yönünü nasıl değiştirdiğine dikkat edin. Üç panelin eksenlerini, üç panel numunenin koronal, sagital ve enine görünümlerini temsil edene kadar döndürün.
   NOT: Numuneleri yeniden yönlendirirken, doğru anterior/posterior oryantasyonu koruyun.
6. Videolar oluşturun.
   1. Her üç panel de düzgün bir şekilde konumlandırıldıktan sonra, yönlendirildikten ve aydınlatıldıktan sonra, koronal görünümü temsil eden panele tıklayın.
   2. Menü çubuğunun sağ tarafındaki Film Dışa Aktarma'ya tıklayın. Toplu İşlem'e tıklayın ve ilgilenilen tüm bölgeyi kapsayacak şekilde Kimden ve Kime kaydırıcılarını sürükleyin. Aralık için, Kalınlıkla Aynı seçeneğini belirleyin. Görünümün yönünü belirten videoyu kaydedin.
   3. İlgilenilen yapıların yeterince tanımlanıp tanımlanamayacağını görmek için videoyu inceleyin. Değilse, videoları gerektiği gibi yeniden ayarlamak ve videoyu yeniden kaydetmek için araçları (adım 5.4) kullanın.
7. Enine ve sagital görünümler için adım 5.6'yı yineleyin. Yeniden yapılandırılmış videoları kullanarak örnekleri tanılayın.
   NOT: Numunenin herhangi bir anatomik anormallik veya hastalık fenotipi sergileyip sergilemediğine dair eksiksiz bir değerlendirme yapmak için her yöndeki videoları dikkatlice izleyin (Şekil 3).

Sonuçlar

Önemli hemodinamik defektlere sahip fare embriyolarının embriyonik ölümcül olduğu kaydedildi. Çok çeşitli KKH'ler, farklı görüşler kullanılarak yüksek çıkışlı, noninvaziv fetal ekokardiyogram ile tanımlanabilir (Şekil 1).

Septal defektler: En sık görülen KKH'ler ventriküler septal defekt (VSD), atriyoventriküler septal defekt (AVSD) ve atriyal septal defekt (ASD)¹ gibi septal defektlerdir. VSD ve...

Tartışmalar

Genetiği değiştirilmiş fareler, konjenital kalp defektlerinin patomekanizmalarını anlamak için kullanılmıştır. Bu çalışmada sunduğumuz protokoller, murin fetal kalp defektlerini değerlendirme sürecini kolaylaştırmaya ve standartlaştırmaya çalışmaktadır. Ancak, protokol sırasında dikkat edilmesi gereken kritik adımlar vardır. Fare embriyoları gebeliğin her gününde önemli ölçüde büyür ve bir fareyi hasat etmek için doğru zaman, fetal ekokardiyogramın doğru bir şekilde yapılması...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4	Sigma Aldrich	P3813
1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage)	SealRite	1615-5599
10% buffered formalin phosphate solution	Fisher Chemical	SF100-4
100% Ethanol	Decon Laboratories	2701
16% paraformaldehyde (PFA) fixative	ThermoScientific	28908	4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C
50 mL tubes	Falcon	352070
6–12 Well plate or 20 mL vial  for embryo storage	Falcon	353046
Dissecting microscope	Leica	MDG36
Dissecting Pins (A1 or A2 grade)	F.S.T	26002-15
Dissecting Plate	F.S.T	FB0875713	Petri dish with paraffin base
Embedding molds	Sakura	4133
Extra narrow scissors (10.5 cm)	F.S.T	14088-10	1–2 pairs
Fiji application/Image J	NIH		Fiji.sc
Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm)	F.S.T	11252-00	2 Pairs
Hot forceps	F.S.T	11252-00	For orientation of embryos
Industrial Marker for Wax Blocks	Sharpie	2003898	Formatted for labratory use
Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera	Jenoptik	017953-650-26
Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software	Jenoptik		jenoptik.com
Large glass beaker	Fisher Scientific	S111053	For melting paraffin
Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics)	Leica	M165 FC
OsiriX MD Version 12.0	OsiriX		osirix-viewer.com
Paraplast embedding paraffin wax	Millipore Sigma	1003230215
Small glass beaker	Fisher Scientific	S111045
Small, perforated spoon (14.5 cm)	F.S.T	10370-17
Straight Vannas Scissors (4–8 mm)	F.S.T	15018-10	A pair
Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope	FUJIFILM VisualSonics Inc.	Vevo2100
Xylene	Fisher Chemical	UN1307