Конвейер для характеристики структурных пороков сердца у плодной мыши

Резюме

В этой статье подробно описываются методы диагностики врожденных пороков сердца у мышей (ИБС) с использованием эхокардиографии плода, некропсии и эпископического флуоресцентного изображения (EFIC) с использованием эпископической конфокальной микроскопии (ECM) с последующей трехмерной (3D) реконструкцией.

Аннотация

Врожденные пороки сердца (ИБС) являются основными причинами младенческой смертности в Соединенных Штатах. В 1980-х годах и ранее большинство пациентов с умеренной или тяжелой ИБС умерли до совершеннолетия, с максимальной смертностью в течение первой недели жизни. Замечательные достижения в хирургических методах, диагностических подходах и медицинском управлении привели к заметному улучшению результатов. Для удовлетворения критических исследовательских потребностей в понимании врожденных пороков сердца мышиные модели обеспечили идеальную исследовательскую платформу, поскольку они имеют очень похожую анатомию сердца с людьми и короткие показатели беременности. Сочетание генной инженерии с высокопроизводительными инструментами фенотипирования позволило воспроизвести и диагностировать структурные пороки сердца для дальнейшего выяснения молекулярных путей, стоящих за ИБС. Использование неинвазивной эхокардиографии плода для скрининга сердечных фенотипов в мышиных моделях в сочетании с высокой точностью эпископического флуоресцентного захвата изображения (EFIC) с использованием эпископической конфокальной микроскопии (ECM) гистопатологии с трехмерными (3D) реконструкциями позволяет детально взглянуть на анатомию различных врожденных пороков сердца. Этот протокол описывает полный рабочий процесс этих методов для получения точного диагноза врожденных пороков сердца у мышей. Применение этого протокола фенотипирования к модельным организмам позволит проводить точную диагностику ИБС, давая представление о механизмах ИБС. Выявление основных механизмов ИБС предоставляет возможности для потенциальных методов лечения и вмешательств.

Введение

Врожденные пороки сердца (ИБС) являются наиболее распространенным врожденным дефектом новорожденных ^1,2, затрагивающим около 0,8-1,7% новорожденных и приводящим к значительной неонатальной смертности и заболеваемости³. Генетическая этиология сильно показана при ИБС ^4,5. Генетически модифицированные мышиные модели широко использовались для понимания сложности ИБС и механизмов, которые их вызывают из-за того, что мыши имеют четырехкамерные сердца и сопоставимые последовательности ДНК развития сердца у мышей и человеческих плодов⁶. Идентификация фенотипа мышиных мутантов является фундаментальным первым шагом в характеристике функции гена-мишени. Мышиные модели, выражающие эффекты дозирования генов, в которых одна генетическая мутация может привести к спектру сердечных дефектов, имитирующих ИБС человека, важны для понимания сложности ИБС и механизмов, которые их вызывают.

В этой статье описывается конвейер для характеристики сердечных фенотипов в мышиных моделях. Применяемые методы используют эхокардиограмму плода⁷, за которой следуют некропсия и гистопатология ECM ^7,8, которая может отображать подробную анатомию развивающихся мышиных сердечных фенотипов. Эхокардиограмма плода является неинвазивной модальностью, которая позволяет напрямую визуализировать несколько эмбрионов с разумным разрешением изображения. Кроме того, эхокардиограмма плода обеспечивает быстрое определение общего количества эмбрионов в помете, стадий их развития, а также относительной ориентации и расположения в роге матки. Используя спектральный допплеровский / цветовой поток, аномальные эмбрионы могут быть идентифицированы на основе структуры, гемодинамического нарушения, ограничения роста или развития водянки. Поскольку исследование эхокардиограммы плода является неинвазивным методом, его можно использовать для сканирования в течение нескольких дней и наблюдения за изменениями гемодинамики или морфологии сердца. Получение качественной визуализации эхокардиограмм плода требует практики и мастерства, так как специфические пороки сердца могут быть пропущены из-за отсутствия опыта и знаний. Из-за этого более точный анализ морфологии сердца может быть получен путем сочетания некропсии и гистопатологии ECM. Некропсия обеспечивает прямую визуализацию структуры дуги, относительных отношений аорты и легочной артерии, размера желудочков и предсердий, положения сердца относительно грудной клетки и бронхолегочных структур. Тем не менее, внутренние особенности, такие как сердечные клапаны и толщина стенки, могут быть трудно оценить только с помощью некропсии. Таким образом, Гистопатология ECM рекомендуется для окончательного диагноза. Гистопатология ECM - это метод визуализации с высоким разрешением, который позволяет как 2D, так и 3D-реконструкцию стека изображений⁹. Эти изображения получаются с помощью последовательной эпископической флуоресцентной визуализации образца, встроенного в парафин, поскольку он тонко секционируется через последовательный интервал автоматическим микротомом. В отличие от классической гистологии, изображения захватываются в виде сечения, прежде чем он будет вырезан из блока, так что все изображения захватываются в одной системе отсчета. Из-за этого стек 2D-изображений, созданный гистопатологией ECM, может быть легко и надежно реконструирован в трех измерениях. Это делается с помощью средства просмотра DICOM, которое позволяет 3D-визуализацию изображений в трех анатомических плоскостях: корональной, сагиттальной и поперечной. Из этих 3D-реконструкций с высоким разрешением может быть поставлен окончательный сердечный диагноз. Применение этих трех различных модальностей визуализации, по отдельности или в комбинации, может обеспечить точную характеристику структурных пороков сердца у эмбрионов мышей.

протокол

Использование мышей для этих исследований необходимо, так как мыши имеют четырехкамерные сердца, которые могут имитировать человеческие ИБС. Мышам была оказана ветеринарная помощь и размещена в аккредитованном Ассоциацией по оценке и аккредитации лабораторного ухода за животными (AAALAC). Соблюдались строгие протоколы, чтобы свести к минимуму дискомфорт, стресс, боль и травмы мышей. Мышей усыпляли с использованием газа CO₂ , который приемлем для мелких грызунов в соответствии с Руководством Американской ветеринарной медицинской ассоциации по эвтаназии. Исследования на мышах в этой рукописи были проведены с утвержденным протоколом IACUC в Университете Питтсбурга.

1. Эхокардиограмма плода

ПРИМЕЧАНИЕ: Эхокардиограмма является мощным инструментом для выявления сердечно-сосудистых мальформаций и экстракардиальных дефектов у мышей. Из-за небольших размеров эмбрионов мыши (около 1-2 мм при среднем приеме, 3,5 мм при рождении) требуется ультравысокочастотное эхокардиографическое оборудование с ультразвуковой биомикроскопией (УБМ). UBM обеспечивает различные высокочастотные (30-50 МГц) зонды с небольшим окном визуализации (15 мм x 14 мм), которое обеспечивает разрешение (30 мкм осевой x 68 мкм боковой) для визуализации одного плода мыши за раз. Преобразователь 40 МГц обеспечивает изображения с высоким разрешением для идентификации сердечно-сосудистых фенотипов⁷.

1. Включите аппарат эхокардиограммы и выберите программу Кардиология.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол может быть использован для любого фона мыши от эмбрионального дня (E)14,5 до 19,5.
2. Обезболить желаемую мышь в анестетической индукционной камере. Индуцируют анестезию с использованием концентрации 4% изофлурана и медицинского кислорода со скоростью потока 1 л/мин и уменьшают его до 2%-3% для поддержания.
3. Быстро поместите мышь на платформу обработки изображений. Платформа визуализации имеет нагретую сталь, чтобы держать мышь в тепле во время процедуры. Поместите рот и нос мыши в анестезирующий носовой конус. Закрепите конечности скотчем, чтобы избежать движения. Контролируйте частоту сердечных сокращений, чтобы убедиться, что она остается между 400-450 ударами в минуту.
4. Контролируйте температуру с помощью ректального термометра и убедитесь, что она находится при температуре 37 °C ± 0,5 °C. Следите за дыханием, чтобы избежать гипоксии. Держите мягкое усилие на зонде, чтобы предотвратить вред.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тепловая лампа может быть установлена над мышью, чтобы предотвратить переохлаждение, находясь под анестезией, и восстановиться после анестезии. Вазелиновую офтальмологическую мазь можно использовать в качестве смазки во избежание сухости глаз.
5. Удалите мех с грудной клетки и живота с помощью крема для депиляции. Нанесите крем и подождите 3 минуты перед удалением. Очистите участок 70% этанолом. Этанол работает лучше, чем вода, в качестве смазки для бритья.
6. Разогрейте ультразвуковой гель до нормальной температуры тела. Обильно нанесите ультразвуковой гель и поместите датчик на живот, чтобы сориентировать его в горизонтальной плоскости и идентифицировать мочевой пузырь на экране. Как только мочевой пузырь идентифицирован, сканируйте краниально из мочевого пузыря и ищите плод. Измерьте длину коронки до крестца, чтобы определить гестационный возраст¹⁰ лет (рисунок 1 и таблица 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение положения преобразователей для визуализации различных плоскостей, включая поперечную четырехкамерную, сагиттальную и фронтальную/корональную плоскости^{визуализации 7} (фиг.1).
7. Используйте цветной допплер для анализа кровотока от сердца.
8. Поместите мышь обратно в клетку, если эмбрионы не достигли намеченной стадии. В противном случае подготовьте мышь к сбору урожая.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что мышь уже проснулась и хорошо восстанавливается после анестезии, прежде чем помещать ее обратно в клетку.
9. Выключите изофлуран и кислород, очистите рабочую зону и выключите машину.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно удалить гель из датчика.

2. Некропсия

ПРИМЕЧАНИЕ: При подозрении на аномальные сердечные фенотипы с помощью эхокардиографии плода, плоды собирают и фиксируют путем погружения всего тела в фиксирующий раствор: либо 10% буферизованный формалинфосфат, либо 4% параформальдегид (PFA). Осмотрите внешнюю и внутреннюю морфологию образца, ища макроскопические анатомические аномалии или пороки развития.

1. Подготовьте мышь.
   1. Если мышь является взрослой, усыпьте мышь, используя стандартный протокол CO₂ . Используйте щипцы или рассекающие ножницы, чтобы сделать разрезы (около 3 см) в боковой грудной клетке и брюшной полости, чтобы обеспечить проникновение фиксатора во внутренние органы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образец должен быть зафиксирован в течение не менее 24 ч до некропсии, если эмбрион старше E14.5.
2. Проанализируйте внешний вид кузова.
   1. Настройте программное обеспечение для сохранения изображений с именем, включая идентификацию образца, увеличение микроскопа и содержание изображения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение от 1,0x до 3,2x должно быть достаточным для визуализации большинства структур у мышей E14.5 или старше.
   2. Поместите мышь на пластину под объектив стереомикроскопа. Заполните пластину фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), чтобы полностью покрыть образец, чтобы предотвратить обезвоживание и отражение на снимках. Отрегулируйте увеличение так, чтобы экран включал весь эмбрион, а затем сфотографируйте как левую, так и правую стороны эмбриона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нижняя часть пластины должна быть покрыта парафином, кремнием или другой подобной подложкой для облегчения закрепления.
   3. Проткните образец через горло, лицом вверх, и сделайте еще один снимок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Направьте штифт немного вверх, чтобы убедиться, что важные структуры грудной полости не прокалываются.
3. Проанализируйте грудную клетку.
   1. Поднимая кожу в середине шеи щипцами, срежьте ножницами кожу к обеим подмышкам, прежде чем разрезать кожу вдоль срединной оси к хвосту. Затем срежьте кожу от пупка до ног. Проткните образец через запястья и лодыжки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы разрезать только кожу. Рекомендуется держать лезвия ножниц горизонтально или под углом вверх.
   2. Чтобы разорвать соединительную ткань, поднимите кожу одной парой щипцов, удерживая подлежащую ткань на месте с другой парой. Проткните образец через кожу, чтобы помочь обнажить грудь и живот (рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком большое растяжение при закреплении, разрезании или соскоблении может привести к повреждению тканей.
   3. Сфотографируйте открытые мышцы, а затем аккуратно соскоблите мышцы, чтобы обнажить ребра.
   4. Сфотографируйте открытые ребра. Отделите ребра от диафрагмы и отрежьте ребра с обеих сторон как можно дальше по боковой оси к шее.
   5. Обнажите сердце, удалив разрезанные ребра. Сфотографируйте сердце.
   6. Удалите тимус, отшелушивая его одной парой щипцов. Используйте другую пару щипцов для стабилизации основания тимуса, чтобы избежать разрыва каких-либо нижележащих сосудов. Сфотографируйте сердце и сосуды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование штифтов для растяжения некоторых смежных структур может помочь получить лучшие изображения. Кроме того, сделайте отдельные фотографии, сфокусированные на больших артериях, сердце и других структурах, представляющих интерес, поскольку они могут не быть в фокусе вместе.
4. Проанализируйте живот.
   1. Потяните диафрагму, чтобы удалить ее и обнажить печень. Сфотографируйтесь.
   2. Зажмите обратно печень, чтобы обнажить желудок и поджелудочную железу. Сфотографируйтесь.
   3. Разрезать пищевод. Удалите толстую кишку и кишечник, вытащив их щипцами. Отрежьте чуть выше печени и удалите ее, чтобы раскрыть почки и надпочечники. Сфотографируйтесь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удаленные органы следует держать в фиксаторном растворе.
5. Изолируйте грудную клетку для анализа ECM.
   1. Разрезайте нижнюю часть грудной клетки по прямой линии между печенью и легкими. Отрежьте голову достаточно высоко, чтобы не перерезать ветвления сонных артерий.
   2. Аккуратно удалите боковые ребра, сохранив при этом спинные ребра и позвоночник. Очистите и соскоблите спинной жир.
   3. Отделите грудную клетку от остальной части тела и поместите ее в 10% буферный раствор формалинфосфата.

3. Встраивание

1. Декантируйте фиксатор в соответствующую бутылку с опасными отходами. Промывайте образцы с 1x PBS в течение 15 минут три раза.
2. Используйте увеличивающиеся концентрации этанола и ксилола для обезвоживания образцов. Продолжительность всех следующих этапов зависит от стадии эмбрионов. Подробную информацию можно найти в таблице 2 .
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность при смене растворов, чтобы избежать повреждения образцов. Оптимальные параметры обработки образцов могут быть скорректированы эмпирически. Ксилол растворяет определенные пластмассы; следует использовать стеклянные инструменты и контейнеры.
3. Замените ксилол парафином на нужную продолжительность. Оставьте флаконы в инкубаторе при температуре 65 °C на соответствующую продолжительность (таблица 2).
4. Используйте свежий парафин, чтобы встроить образцы в нужное положение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется ориентировать образец в середину парафинового блока, причем его спинная сторона обращена к верхней, а задняя сторона обращена к передней части блока. При ориентации образца помните, что образец встроен в блок, обращенный вверх ногами.

4. Эпископическая конфокальная микроскопия (ECM)

ПРИМЕЧАНИЕ: После соответствующего встраивания эмбрионы проходят сбор изображений последовательно через ECM для гистопатологического анализа. Отдельные слайды могут быть извлечены из микротома для дальнейших исследований.

1. Выньте парафиновый блок из морозильной камеры при температуре -20 °C и удалите металлические формы.
2. Используйте лезвие бритвы, чтобы обрезать воск по краям и обратной стороне кассеты. Нарежьте воск, окружающий образец, пока он не будет заключен в небольшой квадрат воска, прикрепленный к кассете.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте крайнюю осторожность при обращении с лезвиями.
3. Используйте металлический рычаг для зажима парафинового блока против стадии нарезки микротома. Выберите функцию MAN (ручная) в режиме выполнения, поднимите поверхность парафина близко к лезвию и выполните несколько слайдов, чтобы убедиться, что лезвие контактирует с блоком парафина.
4. Откройте приложение автофокусировки LAS и выберите MatrixScreener. Выберите Единая регулярная матрица и загрузите соответствующий ранее сохраненный шаблон. Нажмите кнопку Quick LUT , чтобы переключиться на белый и оранжевый омбр.
5. Выберите «Настроить задания» и перетащите видимый лазер 405 нм до максимума. Сопоставьте левый край блока спектра с линией 405 нм и перетащите правый край на линию 800 нм. Отметьте параметр Pinhole и запустите интерактивный просмотр.
6. Отрегулируйте положение лазерной проекции, чтобы центрировать образец на экране, и отрегулируйте ручку Zoom до ~20x. Чтобы оптимизировать разрешение, установите коэффициент усиления на 1 250 В и максимизируйте синюю область с помощью ручки фокусировки; затем сбросьте коэффициент усиления примерно до 750 В для получения изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретные значения могут варьироваться в зависимости от состояния эмбриона.
7. Переключите метод резки на Автоматический, установите толщину около 50 мкм и запустите слайды. Прекратите резку, когда легкие и дыхательные пути находятся в поле зрения.
8. Выберите толщину резки от 8 до 10 мкм и остановите интерактивный просмотр. Откройте Microtome Communicator , чтобы начать визуализацию. Перед сбором изображений убедитесь, что папка временного хранилища пуста.
9. Прекратите резку, когда не визуализируется дополнительная структура сердца. Закройте приложение Microtome Communicator и экспортируйте временный файл в один .tiff серии изображений с помощью программного обеспечения для обработки изображений для последующей 3D-реконструкции.

5. Трехмерная (3D) реконструкция

ПРИМЕЧАНИЕ: Целью 3D-реконструкции является обработка стека 2D-изображений из ECM-визуализации в 3D-видео в корональной, сагиттальной и поперечной ориентациях и использование 3D-видео для диагностики структурных и анатомических аномалий в образцах.

1. Откройте стек изображений ECM в программном обеспечении для обработки изображений.
   1. Перетащите файлы изображений в программное обеспечение для обработки изображений. Переверните изображения ECM по горизонтали, выбрав в строке меню «Изображение > «Преобразовать > «Перевернуть по горизонтали ».
   2. Сохраните перевернутое изображение и закройте программное обеспечение для обработки изображений.
2. Импортируйте стек изображений ECM в программное обеспечение для просмотра DICOM.
   1. Перетащите горизонтально перевернутые изображения ECM в программное обеспечение для просмотра DICOM. Убедитесь, что вокруг списка образцов есть светло-синяя рамка, иначе изображения могут быть добавлены в существующую папку примера.
   2. Выберите ссылки или файлы для копирования в базу данных при появлении всплывающего окна. Новый образец появится в списке образцов с тем же именем, что и файл, скопированный в программное обеспечение для просмотра DICOM.
   3. Нажмите на недавно добавленный файл, чтобы открыть его.
3. Выполните 3D реконструкцию.
   1. Как только файл будет открыт, нажмите на меню Инструменты реконструкции 2D / 3D на панели инструментов и выберите 3D MPR.
   2. Для Pixel X Resolution и Pixel Y Resolution введите разрешение изображения, предоставив зум, используемый во время ECM-изображения. В поле Интервал среза введите толщину среза, используемую для вырезания во время визуализации ECM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разрешение камеры изменяется в зависимости от зума камеры и может отличаться от камеры к камере.
4. Используйте различные инструменты на вкладке Инструменты слева, чтобы настроить стеки изображений по своему усмотрению.
   1. Используйте инструмент WW/WL для настройки ширины окна и уровня окна. Щелкните и перетащите инструмент на изображении вверх, чтобы уменьшить яркость изображения, и вниз, чтобы увеличить его. Щелкните и перетащите инструмент на изображении вправо, чтобы уменьшить контрастность изображения, и влево, чтобы увеличить его.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальные настройки WW/WL для одной структуры могут быть неоптимальными для другой. По этой причине рекомендуется создавать отдельные видео для просмотра разных структур.
   2. Используйте инструмент « Панорама » для перетаскивания изображений в нужные позиции. Используйте инструмент «Масштаб» для увеличения или сжатия изображения по своему усмотрению, а инструмент «Поворот» — для поворота изображения по своему усмотрению.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение изображений может привести к снижению качества изображения. Будьте осторожны при повороте изображений, так как это может привести к переворачиванию осей.
5. Щелкните и перетащите цветную ось первой панели. Обратите внимание, как поворот этой оси изменяет ориентацию двух других панелей. Поверните оси трех панелей до тех пор, пока три панели не представят корональный, сагиттальный и поперечный виды образца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При переориентации образцов поддерживайте правильную переднюю/заднюю ориентацию.
6. Создание видео.
   1. После того, как все три панели правильно расположены, ориентированы и освещены, нажмите на панель, представляющую корональный вид.
   2. Нажмите «Экспорт фильма» в правой части строки меню. Нажмите «Пакетная обработка» и перетащите ползунки «От» и «До», чтобы охватить всю интересующую область. В поле Интервал выберите параметр «То же, что и толщина». Сохраните видео с указанием ориентации представления.
   3. Просмотрите видео, чтобы увидеть, можно ли адекватно идентифицировать интересующие структуры. Если нет, используйте инструменты (шаг 5.4), чтобы перенастроить видео по мере необходимости и повторно сохранить видео.
7. Повторите шаг 5.6 для поперечного и сагиттального видов. Диагностируйте образцы с помощью реконструированных видео.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Внимательно посмотрите видео в каждой ориентации, чтобы сделать полную оценку того, демонстрирует ли образец какие-либо анатомические аномалии или фенотипы заболевания (рисунок 3).

Результаты

Эмбрионы мышей со значительными гемодинамическими дефектами были отмечены как эмбриональные летальные. Широкий спектр ИБС может быть идентифицирован с помощью высокопроизводительной, неинвазивной эхокардиограммы плода с использованием различных видов (рисунок 1).

...

Обсуждение

Генетически модифицированные мыши были использованы для понимания патомеханизмов врожденных пороков сердца. Протоколы, которые мы предоставляем в этом исследовании, направлены на оптимизацию и стандартизацию процесса оценки пороков сердца плода мышей. Тем не менее, есть критические...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4	Sigma Aldrich	P3813
1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage)	SealRite	1615-5599
10% buffered formalin phosphate solution	Fisher Chemical	SF100-4
100% Ethanol	Decon Laboratories	2701
16% paraformaldehyde (PFA) fixative	ThermoScientific	28908	4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C
50 mL tubes	Falcon	352070
6–12 Well plate or 20 mL vial  for embryo storage	Falcon	353046
Dissecting microscope	Leica	MDG36
Dissecting Pins (A1 or A2 grade)	F.S.T	26002-15
Dissecting Plate	F.S.T	FB0875713	Petri dish with paraffin base
Embedding molds	Sakura	4133
Extra narrow scissors (10.5 cm)	F.S.T	14088-10	1–2 pairs
Fiji application/Image J	NIH		Fiji.sc
Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm)	F.S.T	11252-00	2 Pairs
Hot forceps	F.S.T	11252-00	For orientation of embryos
Industrial Marker for Wax Blocks	Sharpie	2003898	Formatted for labratory use
Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera	Jenoptik	017953-650-26
Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software	Jenoptik		jenoptik.com
Large glass beaker	Fisher Scientific	S111053	For melting paraffin
Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics)	Leica	M165 FC
OsiriX MD Version 12.0	OsiriX		osirix-viewer.com
Paraplast embedding paraffin wax	Millipore Sigma	1003230215
Small glass beaker	Fisher Scientific	S111045
Small, perforated spoon (14.5 cm)	F.S.T	10370-17
Straight Vannas Scissors (4–8 mm)	F.S.T	15018-10	A pair
Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope	FUJIFILM VisualSonics Inc.	Vevo2100
Xylene	Fisher Chemical	UN1307