Análisis semiautomatizado de la amplitud y latencia máximas para formas de onda de respuesta auditiva del tronco encefálico utilizando R

Resumen

Este artículo describe la medición semiautomática de las amplitudes y latencias de los primeros cinco picos y valles en la forma de onda de respuesta auditiva del tronco encefálico. Una rutina adicional compila y anota los datos en una hoja de cálculo para el análisis del experimentador. Estas rutinas informáticas gratuitas se ejecutan utilizando el paquete estadístico de código abierto R.

Resumen

Muchos informes en los últimos 15 años han evaluado los cambios en la forma de onda de la respuesta auditiva del tronco encefálico (ABR) después de insultos como la exposición al ruido. Los cambios comunes incluyen reducciones en la amplitud del pico 1 y las latencias relativas de los picos posteriores, así como una mayor ganancia central, que se refleja en un aumento relativo en las amplitudes de los picos posteriores en comparación con la amplitud del pico 1. Muchos experimentadores identifican los picos y valles visualmente para evaluar sus alturas y latencias relativas, que es un proceso laborioso cuando las formas de onda se recogen en incrementos de 5 dB en todo el rango de audición para cada frecuencia y condición. Este documento describe rutinas libres que pueden ejecutarse en la plataforma de código abierto R con la interfaz RStudio para semiautomatizar las mediciones de los picos y valles de las formas de onda de la respuesta auditiva del tronco encefálico (ABR). Las rutinas identifican las amplitudes y latencias de los picos y valles, las muestran en una forma de onda generada para su inspección, recopilan y anotan los resultados en una hoja de cálculo para el análisis estadístico y generan formas de onda promediadas para las figuras. En los casos en que el proceso automatizado identifica erróneamente la forma de onda ABR, existe una herramienta adicional para ayudar en la corrección. El objetivo es reducir el tiempo y el esfuerzo necesarios para analizar la forma de onda ABR para que más investigadores incluyan estos análisis en el futuro.

Introducción

La respuesta auditiva del tronco encefálico (ABR) se utiliza con frecuencia para determinar los umbrales de audición en sujetos animales y bebés humanos. Como el ABR es un registro de electroencefalograma (EEG) de las primeras respuestas del sistema nervioso a los estímulos auditivos, lleva información adicional que refleja el disparo coordinado de las neuronas ganglionares espirales cocleares y el procesamiento temprano de señales en el tronco cerebral auditivo, incluido el procesamiento bilateral¹. Estas respuestas pueden verse afectadas por el trauma del ruido. Por ejemplo, la exposición al ruido que es suficiente para inducir un cambio temporal del umbral en ratones también puede reducir permanentemente la amplitud del pico ABR 1². Además, tal trauma puede reducir las latencias entre picos y aumentar las amplitudes relativas de los picos posteriores³, posiblemente debido a una pérdida de regulación inhibitoria⁴. Además de estos hallazgos, se ha demostrado que mutaciones genéticas específicas alteran la forma de onda ABR en ausencia de trauma ^5,6,7. Por lo tanto, el análisis rutinario de las formas de onda ABR puede proporcionar información sobre el sistema auditivo en modelos experimentales.

También ha habido interés en el uso de formas de onda ABR como una herramienta de diagnóstico para los pacientes. Informes anteriores han evaluado si el pico 1 de ABR se reduce en pacientes humanos después de la exposición al ruido o en pacientes con tinnitus ^8,9. En particular, se ha informado que los ataques de migraña aumentan temporalmente las latencias entre picos durante varias semanas, después de lo cual la forma de onda ABR vuelve a la normalidad en los individuos afectados¹⁰. Se ha informado que COVID-19 impulsa alteraciones a largo plazo en las latencias interpico ABR^11,12, aunque otro estudio reportó resultados diferentes ¹³. La pérdida de audición es a menudo comórbida con la demencia en el envejecimiento, y las personas con mayor pérdida auditiva tienden a experimentar demencia que avanza más rápidamente¹⁴. Los investigadores han investigado los cambios en la forma de onda ABR en enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Parkinson (revisada en Jafari et al.15) y la enfermedad de Alzheimer (revisada en Swords et al.16), así como en el envejecimiento normal ¹⁷. A medida que más investigadores y médicos investigan los déficits sensoriales como biomarcadores de enfermedades comunes en el envejecimiento, técnicas como ABR pueden convertirse en rutina en la atención médica.

Un examen de las secciones de métodos en la literatura revela que los laboratorios a menudo escriben scripts personalizados en MatLab para analizar formas de onda ABR. La plataforma ABR fabricada por Intelligent Hearing Systems tiene una función para el análisis de forma de onda, pero requiere que un operador seleccione manualmente los picos y valles. Aquí, hemos escrito rutinas de análisis semiautomatizadas para el entorno estadístico de código abierto y disponible gratuitamente R y la interfaz RStudio. Este informe compara los datos obtenidos utilizando nuestras rutinas con los datos obtenidos al hacer que un experimentador identifique manualmente los picos y valles y muestra que los datos de los dos métodos están fuertemente correlacionados. Es importante destacar que las rutinas incorporan una función de cegamiento, en la que los metadatos de las muestras se colocan en un archivo separado que no se incorpora hasta el final. Estas funciones han simplificado el análisis de forma de onda para nuestro laboratorio.

Protocolo

Todos los procedimientos realizados en animales fueron aprobados de antemano por el Comité de Investigación Animal de la Universidad de Rochester. Los sujetos experimentales fueron 12 ratones machos y hembras F1 de tipo salvaje a 1 mes de edad. Estos ratones F1 son el producto del apareamiento de una presa CBA / CaJ y un padre C57BL / 6J. Los ratones fueron criados y alojados en las instalaciones del vivero con un ciclo estándar de luz / oscuridad de 12 h, comida y agua ilimitadas y amplios suministros de anidación. No más de cinco hermanos del mismo sexo fueron alojados juntos en una jaula.

1. Obtención de datos para análisis

NOTA: Este paso debe cumplir con los lineamientos institucionales y ser aprobado previamente por el comité institucional de bienestar animal. El proceso detallado para generar datos ABR de ratones se ha descrito en otra parte¹⁸.

1. Grabe el ABR con la plataforma de su elección.
   NOTA: En el caso que se muestra aquí, las grabaciones se realizaron en ratones.
   1. Utilice un estímulo de clic de 5 ms comenzando con un nivel de presión sonora de 75 dB y disminuyendo en pasos de 5 dB a 5 dB. Registre un promedio de 512 barridos para cada amplitud. Rechazar respuestas si su amplitud pico a valle es mayor que 31 μV en cualquier instancia entre 1,3 ms y 12,5 ms después del estímulo.
      NOTA: También se pueden utilizar grabaciones de presentaciones de pip de tono. Anticipamos que la rutina de análisis funcionará para otras especies, incluidos los humanos.
2. Exporte la grabación ABR como un archivo ASCII.
   1. Para IHS, abra el programa informático.
   2. Cargue el archivo de interés y muestre las formas de onda deseadas en una página.
   3. En la pestaña Datos , seleccione Guardar página como ASCII para obtener un archivo .txt.
   4. Después de nombrar el archivo de datos correctamente ("ID"), registre la información del ID y del asunto en un archivo de metadatos titulado "info.csv". Asegúrese de que la "identificación" no incluya ninguna información como el genotipo, el sexo, la edad o el tratamiento; En cambio, esta información se registra en "Info.csv".
      NOTA: Se puede usar una baraja justa de cartas para asignar etiquetas al azar si es necesario.
   5. Repita con todos los archivos que se analizarán como archivos "ID" separados.

2. Instalar los paquetes necesarios y cargar los datos en el ordenador de trabajo

1. Descargue e instale R (https://www.r-project.org) y RStudio (https://www.rstudio.com).
   Nota: El protocolo descrito aquí utiliza R ≥ 4.0.0.
2. Instale las bibliotecas necesarias, tidyverse, shiny, plotly y zoo, escribiendo el siguiente comando en la ventana de comandos de RStudio:
   Install.packages("tidyverse")
   Install.packages("shiny")
   Install.packages("plotly")
   Install.packages("zoo")
3. Descargue los scripts FindPeaks.R y See_trace_click. R del laboratorio blanco GitHub (https://github.com/PWhiteLab/FindPeaks), así como el archivo asociado "Time.csv".
4. Cree una nueva carpeta que contenga todos los archivos ASCII, "info.csv" y "Time.csv". Para este ejemplo, asigne a la carpeta el nombre "Test_Folder". Dentro de "Test_Folder", coloque los archivos ASCII en una subcarpeta titulada "ASCII_Folder".

3. Obtención del análisis preliminar con FindPeaks.R

1. Abra el script FindPeaks.R en RStudio.
2. Haga clic con el botón derecho en la ficha del script en la barra de herramientas para seleccionar Establecer directorio de trabajo y configúrelo en Test_Folder (consulte la figura complementaria S1A).
3. En la ventana de script , haga clic en Fuente en la parte superior derecha de la barra de herramientas para cargar el programa (consulte la Figura suplementaria S1B).
4. En la ventana de comandos, utilice los siguientes comandos para analizar las formas de onda (consulte la figura suplementaria S2):
   FindPeaks_single("ASCII_folder/ID.txt") para expedientes individuales (véase la figura complementaria S2A)
   FindPeaks_group("ASCII_Folder") para el procesamiento por lotes (véase la figura suplementaria S2B)
   NOTA: El script generará (1) archivos pdf que muestran las formas de onda con picos y valles etiquetados (consulte la Figura suplementaria S2C) y (2) un archivo ID.csv que contiene los datos numéricos para la amplitud (μV) y la latencia (ms). Ambos archivos se colocarán en "Test_Folder".

4. Verificación del análisis preliminar

NOTA: A niveles de sonido bajos, partes de la forma de onda pueden llegar a ser difíciles de distinguir del ruido, y FindPeaks.R puede identificar erróneamente los picos o valles en comparación con la opinión del experimentador. Si hay una discrepancia, entonces el archivo .csv se puede modificar con los datos obtenidos del script See_trace_click.R.

1. Cargue los datos de forma de onda para el individuo específico utilizando el comando (consulte la figura suplementaria S3A):
   Forma de onda <- ASCII_extract("ASCII_Folder/ID.txt")
2. Abra el See_trace_click. Script R en RStudio.
3. En el encabezado de la izquierda, haga clic en el botón Ejecutar aplicación y espere a que aparezca una nueva ventana interactiva (brillante) (consulte la figura complementaria S3B).
4. En el cuadro de la parte superior izquierda, introduzca el nivel de sonido de la forma de onda que requiere revisión y busque la forma de onda que se muestra en la ventana.
5. Mueva el cursor alrededor de la forma de onda para revelar la latencia y la amplitud en cualquier punto.
6. Haga clic en el pico correcto y en el siguiente valle para registrar los datos en la tabla a continuación. Copie y pegue los datos de latencia en el archivo .csv (consulte la figura complementaria S3C).
7. Para calcular la medición de amplitud, reste la siguiente amplitud mínima de la amplitud máxima en la celda de la hoja de cálculo.

5. Compilación y visualización del conjunto de datos

1. Transfiera los archivos .csv verificados a una nueva subcarpeta en Test_Folder titulada "Peak_Data".
2. Agregue los datos en un solo archivo .csv y asígnele el nombre "Peak_Data.csv".
3. Utilice el siguiente comando:
   Compilar ("Peak_Data")
   Nota: Este script combina los metadatos de info.csv con Peak_Data.csv para etiquetar los datos con información de grupo. También calcula automáticamente las latencias entre picos y las relaciones de amplitud.
4. Realizar análisis estadísticos sobre los datos compilados.
   1. Utilice una prueba de normalidad, como la prueba de Shapiro-Wilks, para evaluar la distribución de los datos con la siguiente función:
      shapiro.test()
   2. Si la prueba de Shapiro-Wilks no es significativa, el conjunto de datos tiene una distribución normal; por lo tanto, evalúe los datos con una prueba paramétrica como ANOVA con la siguiente función:
      aov()
   3. Si la prueba de Shapiro-Wilks es menor que p = 0.05, use la prueba de suma de rangos de Kruskal-Wallis (con la función a continuación) u otra medida no paramétrica apropiada (ver otras posibilidades en la discusión).
      kruskal.test()
5. Para mostrar formas de onda promedio, use el siguiente comando:
   Average_Waveform("ASCII_Folder ", aes(x = Data_Pnt_ms, y = "dB", grupo = Genotipo, color = Genotipo))
   NOTA: Este comando muestra las formas de onda promedio para diferentes genotipos en diferentes colores. Para la variable y dB, inserte el número que corresponde a la amplitud deseada, como 75, sin comillas. Para otras comparaciones, utilice la etiqueta de grupo correspondiente de los metadatos.

Resultados

Probamos las rutinas en respuestas de forma de onda ABR a una serie de clics, comenzando en 75 dB y disminuyendo en incrementos de 5 dB a 5 dB. Estos datos fueron obtenidos como se describió anteriormente¹⁹. También probamos la herramienta en datos de pip de tono y obtuvimos resultados similares. Los datos ABR de la mayoría de los sistemas ABR se pueden exportar como archivos .txt (ASCII). Cargamos archivos ABR ASCII en una computadora y los abrimos en RStudio como se describe en el protocolo. Después de ejecutar la rutina FindPeaks.R en forma de lote, obtuvimos formas de onda de muestra con etiquetado automatizado (Figura 1) y un archivo .csv con los resultados. Los resultados se revisaron para eliminar picos irrelevantes. Para validar el etiquetado automatizado, también utilizamos la capacidad del programa ABR para etiquetar manualmente los primeros cinco picos y valles en cada forma de onda obtenida con la serie de clics descrita anteriormente. El experimentador que realiza esta tarea tenía 2 años de experiencia registrando y analizando datos ABR. La Figura 2 muestra esta comparación, con los datos automatizados de FindPeaks.R en rojo y los datos obtenidos manualmente en negro. Cada seguimiento representa los datos de un solo ratón. También se muestra el promedio de ambos métodos con una desviación estándar. Los resultados obtenidos por FindPeaks.R se correlacionan fuertemente con los resultados obtenidos manualmente (ver Figura Suplementaria S4).

Figura 1: Respuesta representativa de la forma de onda a un estímulo de clic de 75 dB para un ratón F1 joven. La latencia en milisegundos se traza en el eje x, y la amplitud en microvoltios se traza en el eje y. Los picos se identificaron automáticamente con FindPeaks.R y se etiquetaron en rojo, mientras que los valles se etiquetan en azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Comparación de los datos obtenidos de los picos identificados manualmente con los datos proporcionados por el análisis FindPeaks.R. (A, C, E, G, I) Las amplitudes en microvoltios y latencias (B, D, F, H, J) en milisegundos se representan para niveles de sonido entre 5 dB y 75 dB (eje x, todos los gráficos) para picos I-V en las formas de onda obtenidas para estímulos de clic presentados a 12 ratones. Los valores obtenidos manualmente (negro) se comparan con los mismos conjuntos de datos analizados con FindPeaks.R (rojo). Los promedios se trazan como líneas pesadas, con la región sombreada representando una desviación estándar. No se observaron diferencias entre los métodos cuando se evaluaron con la prueba de suma de rangos de Kruskal-Wallis (A, diferencia = 0,0547977 ± 0,0010028, max = 0,96, p = 0,9216; B, diferencia = −0,0001734 ± 0,0001214, máximo = 0,04, p = 0,8289; C, diferencia = −0,0212209 ± 0,0006806, max = 0,92, p = 0,9687; D, diferencia = −0,0011047 ± 0,0001556, max = 0,06, p = 0,771; E, diferencia = −0,0323077 ± 0,0006169, max = 0,66, p = 0,899; F, diferencia = −0,0072189 ± 0,0001460, máximo = 0,04, p = 0,8644; G, diferencia = 0,201754 ± 0,0007407, máximo = 0,64, p = 0,9312; H, diferencia = −0,0007018 ± 0,0001717, máximo = 0,09, p = 0,8013; I, diferencia = 0,0347561 ± 0,0007343, máximo = 1,05, p = 0,8856; J, diferencia = −0,0078049 ± 0,0002762, max = 0,16, p = 0,886), y los resultados estuvieron altamente correlacionados (valores chi-cuadrado: A, 0,009696; B, 0,046684; C, 0,0015395; D, 0,084742; E, 0,016102; F, 0,029153; G, 0,0074604; H, 0,063322; I, 0,020699; J, 0,020544; diferencias presentadas como media ± SEM; max = diferencia máxima absoluta). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria S1: Análisis con FindPeaks.R. (A) Selección del directorio de trabajo (ver paso de protocolo 3.2); (B) cargar el programa (ver protocolo paso 3.3). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2: Salida de script y comandos para el análisis de las formas de onda. Comandos para (A) archivos individuales y (B) procesamiento por lotes. (C) Archivo PDF de salida que muestra formas de onda con picos y valles etiquetados. Consulte el paso 3.4 del protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria S3: Verificación del análisis. (A) Carga de los datos de forma de onda (consulte el paso 4.1 del protocolo). (B) Ubicación del botón Ejecutar aplicación . También se indica el archivo de datos de ejemplo. (C) Ventana brillante con una forma de onda. En este caso, el nivel de sonido es de 75 dB, como se indica en la ventana superior. Al hacer clic en un pico deseado y en el siguiente valle, se registran los datos de amplitud y latencia en la tabla (paso de protocolo 4.6). Se muestran los datos del pico 3. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria S4: Comparación de los datos individuales obtenidos de los picos identificados manualmente con los datos proporcionados por el análisis FindPeaks.R. (A, C, E, G, I) Las amplitudes en microvoltios y latencias (B, D, F, H, J) en milisegundos se representan para niveles de sonido entre 5 dB y 75 dB (eje x, todos los gráficos) para picos I-V en formas de onda obtenidas para estímulos de clic presentados a 12 ratones. Cada animal está etiquetado con un color único, como se muestra en la leyenda. Los datos obtenidos con FindPeaks.R se etiquetan con colores sólidos, mientras que los datos obtenidos manualmente se etiquetan con versiones menos saturadas de los mismos colores. Si bien ambos conjuntos de datos se trazan en esta figura, cuando son idénticos, solo una línea es aparente. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El protocolo descrito en esta publicación debería ayudar a agilizar la adquisición de datos que describen las relaciones de amplitud de voltaje y los intervalos de latencia para ABR a clics y pips de tono. Al emplear comandos individuales en RStudio, un experimentador puede extraer, compilar y mostrar esta información en un solo documento para el análisis estadístico. Al hacer que este análisis sea rutinario, esperamos que el campo descubra nuevas formas en que el ABR puede ser alterado en el desarrollo, en el envejecimiento o por insulto en diferentes especies. Tal información podría ser valiosa para identificar mecanismos importantes similares a la sinaptopatía del ruido². Los ratones jóvenes utilizados para este experimento tuvieron respuestas muy variables, probablemente porque el tronco cerebral auditivo todavía está madurando a esta edad^{de 20} años. No obstante, los dos métodos de cuantificación mostraron correlaciones muy fuertes (Figura 2).

El script utiliza un archivo llamado "Time.csv" para establecer intervalos dentro de los datos para la identificación de picos. Brevemente, una amplitud de voltaje máxima que ocurre en un intervalo de tiempo especificado se etiqueta como "pico 1", un voltaje mínimo que ocurre en el siguiente intervalo se etiqueta como "valle 1", y así sucesivamente. Elegimos los intervalos para abarcar las latencias de las respuestas de pip de clic y tono para ratones CBA / CaJ de 1 mes a 12 meses de edad utilizando frecuencias que abarcan 8 kHz a 32 kHz. Utilizamos con éxito la herramienta para medir también las respuestas de pip de tono en ratones. Otras especies, incluidos los humanos, también tienen respuestas ABR dentro de ventanas similares, y anticipamos que esta herramienta también se puede usar para datos de otras especies. Recomendamos utilizar el nuevo método ABR paralelo para humanos²¹, que produce excelentes formas de onda. La limitación del intervalo de tiempo restringe el uso de esta herramienta a la evaluación de las respuestas inmediatas de ABR. Sin embargo, observamos que los datos de intervalo en este archivo podrían ser alterados por los usuarios para automatizar las mediciones de las respuestas ABR al habla o de los potenciales relacionados con eventos (ERP) que ocurren característicamente en diferentes momentos en respuesta al sonido.

Cabe destacar algunas características del tratamiento estadístico de estos datos. Hasta donde sabemos, el campo no tiene un tratamiento estandarizado para distinguir las progresiones de amplitud. Los primeros estudios utilizaron ANOVA^22,23. Los datos de la serie de clics aquí (Figura 2) no fueron paramétricos, lo que llevó al uso de la prueba de suma de rangos de Kruskal-Wallis. Similar al ANOVA, la prueba de suma de rangos de Kruskal-Wallis evalúa las diferencias en los valores obtenidos en un nivel dado de un estímulo; es decir, compara las líneas obtenidas en el gráfico. Sin embargo, otros tratamientos también son posibles. Biológicamente, las progresiones de amplitud reflejan el reclutamiento adicional de neuronas de umbral más alto a medida que aumenta el nivel de estímulo. Esto sugiere que el área bajo la curva, que representa las integrales de las líneas, podría ser la medida más relevante. Las ecuaciones de estimación generalizadas (GEE) pueden utilizarse para modelar datos individuales para un análisis integral, como en Patel et ^al.5. En particular, el análisis GEE puede tener en cuenta el diseño de medidas repetidas de estos experimentos. A medida que más investigadores discutan los métodos de análisis de datos, anticipamos el surgimiento de un consenso sobre las mejores prácticas.

En conclusión, este documento presenta herramientas gratuitas y fáciles de usar para medir, compilar y visualizar formas de onda ABR. Estas herramientas pueden ser utilizadas por estudiantes novatos de RStudio siguiendo este protocolo, e incorporan un paso cegador para mejorar el rigor y la reproducibilidad. Prevemos que el análisis rutinario de la forma de onda ABR permitirá el descubrimiento de insultos, variantes genéticas y otros tratamientos que pueden afectar la función auditiva.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J  mice	Jackson Labs	664
CBA/CaJ mice	Jackson Labs	654
E-series PC	Dell	n/a (this equipment was discontinued)	This runs the IHS system.
Mini-anechoic chamber	Industrial Acoustics Company	Special order number 104306	This enclosure reduces noise levels for auditory testing of animals.
Optiplex 7040	Dell	i5-6500	Rstudio may also be run on a Mac or Linux system.
Universal Smart Box	Intelligent Hearing Systems	n/a (this equipment was discontinued)	Both TDT and IHS can output hearing data as ASCII files.