Análise Semi-Automatizada de Amplitude de Pico e Latência para Formas de Onda de Resposta Auditiva de Tronco Encefálico Usando R

Resumo

Este artigo descreve a mensuração semi-automatizada das amplitudes e latências dos cinco primeiros picos e vales na forma de onda de resposta auditiva do tronco encefálico. Uma rotina adicional compila e anota os dados em uma planilha para análise do experimentador. Essas rotinas de computador gratuitas são executadas usando o pacote estatístico de código aberto R.

Resumo

Muitos relatos nos últimos 15 anos avaliaram mudanças na forma de onda da resposta auditiva do tronco encefálico (PEATE) após insultos como a exposição ao ruído. Mudanças comuns incluem reduções na amplitude do pico 1 e nas latências relativas dos picos posteriores, bem como aumento do ganho central, que é refletido por um aumento relativo nas amplitudes dos picos posteriores em comparação com a amplitude do pico 1. Muitos experimentadores identificam os picos e vales visualmente para avaliar suas alturas e latências relativas, o que é um processo trabalhoso quando as formas de onda são coletadas em incrementos de 5 dB em toda a faixa auditiva para cada frequência e condição. Este trabalho descreve rotinas livres que podem ser executadas na plataforma de código aberto R com a interface RStudio para semi-automatizar as medidas dos picos e vales das formas de onda da resposta auditiva do tronco encefálico (PEATE). As rotinas identificam as amplitudes e latências de picos e vales, as exibem em uma forma de onda gerada para inspeção, agrupam e anotam os resultados em uma planilha para análise estatística e geram formas de onda médias para figuras. Nos casos em que o processo automatizado identifica erroneamente a forma de onda ABR, há uma ferramenta adicional para auxiliar na correção. O objetivo é reduzir o tempo e o esforço necessários para analisar a forma de onda do PEATE para que mais pesquisadores incluam essas análises no futuro.

Introdução

A resposta auditiva do tronco encefálico (PEATE) é frequentemente usada para determinar limiares auditivos em animais e bebês humanos. Como o PEATE é um registro de eletroencefalograma (EEG) das primeiras respostas do sistema nervoso a estímulos auditivos, ele carrega informações adicionais que refletem o disparo coordenado de neurônios ganglionares espirais cocleares e o processamento precoce de sinais no tronco encefálico auditivo, incluindo o processamento bilateral¹. Essas respostas podem ser afetadas pelo trauma do ruído. Por exemplo, a exposição ao ruído que é suficiente para induzir uma mudança temporária do limiar em camundongos também pode reduzir permanentemente a amplitude do pico do PEATE 1². Além disso, esse trauma pode reduzir as latências interpicos e aumentar as amplitudes relativas dos picos posteriores³, possivelmente devido à perda da regulação inibitória⁴. Além desses achados, mutações genéticas específicas têm demonstrado alterar a forma de onda do PEATE na ausência de trauma ^5,6,7. Assim, a análise rotineira das formas de onda do PEATE pode fornecer informações sobre o sistema auditivo em modelos experimentais.

Também tem havido interesse em usar formas de onda do PEATE como uma ferramenta diagnóstica para os pacientes. Relatos prévios avaliaram se o pico 1 do PEATE está reduzido em pacientes humanos após exposição ao ruído ou em pacientes com^{zumbido 8,9}. Notavelmente, os ataques de enxaqueca têm sido relatados para aumentar temporariamente as latências interpicos por várias semanas, após o que a forma de onda do PEATE retorna ao normal em indivíduos afetados¹⁰. A COVID-19 tem sido relatada como impulsionando alterações de longo prazo nas latências interpicos do PEATE ^11,12, embora outro estudo tenha relatado resultados diferentes¹³. A perda auditiva é muitas vezes co-mórbida com a demência no envelhecimento, e indivíduos com maior perda auditiva tendem a experimentar demência que avança mais rapidamente¹⁴. Pesquisadores investigaram alterações na forma de onda do PEATE em doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson (revisada em Jafari et al.15) e a doença de Alzheimer (revisada em Swords et al.16), bem como no envelhecimento normal ¹⁷. À medida que mais pesquisadores e clínicos investigam déficits sensoriais como biomarcadores para doenças comuns no envelhecimento, técnicas como o PEATE podem se tornar rotineiras nos cuidados de saúde.

Um exame das seções de métodos na literatura revela que os laboratórios geralmente escrevem scripts personalizados no MatLab para analisar formas de onda ABR. A plataforma ABR feita pela Intelligent Hearing Systems tem uma função para análise de forma de onda, mas requer que um operador selecione manualmente os picos e vales. Aqui, escrevemos rotinas de análise semi-automatizadas para o ambiente estatístico de código aberto e disponível gratuitamente R e a interface RStudio. Este relatório compara os dados obtidos usando nossas rotinas com os dados obtidos por um experimentador identificar manualmente os picos e vales e mostra que os dados dos dois métodos estão fortemente correlacionados. É importante ressaltar que as rotinas incorporam uma função de cegamento, na qual os metadados das amostras são colocados em um arquivo separado que não é incorporado até o final. Essas funções simplificaram a análise de formas de onda para o nosso laboratório.

Protocolo

Todos os procedimentos realizados em animais foram previamente aprovados pelo Comitê de Pesquisa Animal da Universidade de Rochester. Os sujeitos experimentais foram 12 camundongos machos e fêmeas do tipo selvagem F1 com 1 mês de idade. Estes ratos F1 são o produto do acasalamento de uma barragem CBA/CaJ e de uma sire. Os ratos foram criados e alojados na instalação do biotério com um ciclo padrão de 12 h claro/escuro, comida e água ilimitadas e amplos suprimentos de nidificação. Não mais do que cinco irmãos do mesmo sexo foram alojados juntos em uma gaiola.

1. Obtenção de dados para análise

NOTA: Esta etapa deve estar em conformidade com as diretrizes institucionais e ser pré-aprovada pelo comitê institucional de bem-estar animal. O processo detalhado para a geração de dados ABR de camundongos foi descrito em outro lugar¹⁸.

1. Grave o ABR com a plataforma de sua preferência.
   NOTA: No exemplo mostrado aqui, as gravações foram realizadas em camundongos.
   1. Use um estímulo de clique de 5 ms começando em um nível de pressão sonora de 75 dB e diminuindo em etapas de 5 dB para 5 dB. Registre uma média de 512 varreduras para cada amplitude. Rejeite as respostas se o seu pico de amplitude mínima for superior a 31 μV em qualquer instância entre 1,3 ms e 12,5 ms após o estímulo.
      NOTA: Gravações de apresentações de pip de tom também podem ser usadas. Prevemos que a rotina de análise funcionará para outras espécies, incluindo os seres humanos.
2. Exporte a gravação ABR como um arquivo ASCII.
   1. Para IHS, abra o programa de computador.
   2. Carregue o arquivo de interesse e exiba as formas de onda desejadas em uma página.
   3. Na guia Dados , selecione Salvar página como ASCII para obter um arquivo .txt.
   4. Depois de nomear o arquivo de dados apropriadamente ("ID"), registre o ID e as informações do assunto em um arquivo de metadados intitulado "info.csv". Certifique-se de que o "ID" não inclua nenhuma informação, como genótipo, sexo, idade ou tratamento; em vez disso, essas informações são registradas em "info.csv".
      NOTA: Um baralho justo de cartas de baralho pode ser usado para atribuir aleatoriamente rótulos, se necessário.
   5. Repita com todos os arquivos a serem analisados como arquivos "ID" separados.

2. Instalando os pacotes necessários e carregando os dados no computador de trabalho

1. Baixe e instale o R (https://www.r-project.org) e o RStudio (https://www.rstudio.com).
   Observação : O protocolo descrito aqui usou R ≥ 4.0.0.
2. Instale as bibliotecas necessárias, tidyverse, shiny, plotly e zoo, digitando o seguinte comando na janela de comando do RStudio:
   Install.packages("tidyverse")
   Install.packages("brilhante")
   Install.packages("plotly")
   Install.packages("zoológico")
3. Baixe os scripts FindPeaks.R e See_trace_click. R do GitHub de laboratório branco (https://github.com/PWhiteLab/FindPeaks), bem como o arquivo associado "Time.csv".
4. Crie uma nova pasta para conter todos os arquivos ASCII, "info.csv" e "Time.csv". Para este exemplo, nomeie a pasta como "Test_Folder". Dentro de "Test_Folder", coloque os arquivos ASCII em uma subpasta intitulada "ASCII_Folder".

3. Obtenção da análise preliminar com FindPeaks.R

1. Abra o script FindPeaks.R no RStudio.
2. Clique com o botão direito do mouse na guia do script na barra de ferramentas para selecionar Definir diretório de trabalho e defina-o como Test_Folder (consulte Figura S1A Suplementar).
3. Na janela de script, clique em Source no canto superior direito da barra de ferramentas para carregar o programa (consulte a Figura S1B Suplementar).
4. Na janela de comando, use os seguintes comandos para analisar as formas de onda (consulte a Figura S2 Suplementar):
   FindPeaks_single("ASCII_folder/ID.txt") para arquivos individuais (consulte a Figura S2A Suplementar)
   FindPeaks_group("ASCII_Folder") para processamento em lote (ver figura suplementar S2B)
   NOTA: O script produzirá (1) arquivos pdf exibindo as formas de onda com picos e vales rotulados (consulte a Figura Suplementar S2C) e (2) um arquivo ID.csv contendo os dados numéricos para a amplitude (μV) e latência (ms). Ambos os arquivos serão colocados em "Test_Folder".

4. Verificação da análise preliminar

NOTA: Em baixos níveis de som, partes da forma de onda podem se tornar difíceis de distinguir do ruído, e FindPeaks.R pode identificar erroneamente os picos ou vales em comparação com a opinião do experimentador. Se houver uma discrepância, o arquivo de .csv pode ser alterado com dados obtidos do script See_trace_click.R.

1. Carregue os dados de forma de onda para o indivíduo específico usando o comando (consulte a Figura S3A Suplementar):
   < de forma de onda - ASCII_extract("ASCII_Folder/ID.txt")
2. Abra o See_trace_click. Script R no RStudio.
3. No cabeçalho à esquerda, clique no botão Executar aplicativo e aguarde a exibição de uma nova janela interativa (brilhante) (consulte Figura S3B suplementar).
4. Na caixa no canto superior esquerdo, insira o nível de som para a forma de onda que requer revisão e procure a forma de onda exibida na janela.
5. Mova o cursor ao redor da forma de onda para revelar a latência e a amplitude em qualquer ponto.
6. Clique no pico correto e no seguinte cavado para registrar os dados na tabela abaixo. Copie e cole os dados de latência no arquivo .csv (consulte Figura S3C suplementar).
7. Para calcular a medida de amplitude, subtraia a amplitude mínima a seguir da amplitude de pico na célula da planilha.

5. Compilando e visualizando o conjunto de dados

1. Transfira os arquivos de .csv verificados para uma nova subpasta no Test_Folder intitulada "Peak_Data".
2. Acrescente os dados em um único arquivo .csv e nomeie-o "Peak_Data.csv".
3. Use o seguinte comando:
   Compilar ("Peak_Data")
   Observação : esse script combina os metadados de info.csv com Peak_Data.csv para rotular os dados com informações de grupo. Ele também calcula automaticamente as latências entre picos e as razões de amplitude.
4. Realizar análise estatística nos dados compilados.
   1. Use um teste de normalidade, como o teste de Shapiro-Wilks, para avaliar a distribuição dos dados com a seguinte função:
      shapiro.test()
   2. Se o teste de Shapiro-Wilks não for significativo, o conjunto de dados tem uma distribuição normal; portanto, avalie os dados com um teste paramétrico como ANOVA com a seguinte função:
      aov()
   3. Se o teste de Shapiro-Wilks for menor que p = 0,05, use o teste de soma de postos de Kruskal-Wallis (com a função abaixo) ou outra medida não paramétrica apropriada (veja outras possibilidades na discussão).
      kruskal.test()
5. Para exibir formas de onda médias, use o seguinte comando:
   Average_Waveform("ASCII_Folder ", aes(x = Data_Pnt_ms, y = "dB", grupo = Genótipo, cor = Genótipo))
   NOTA: Este comando mostra as formas de onda médias para diferentes genótipos em cores diferentes. Para a variável y dB, insira o número que corresponde à amplitude desejada, como 75, sem as aspas. Para outras comparações, use o rótulo de grupo correspondente dos metadados.

Resultados

Testamos as rotinas nas respostas de forma de onda do PEATE a uma série de cliques, iniciando em 75 dB e descendo em incrementos de 5 dB para 5 dB. Esses dados foram obtidos conforme descrito anteriormente¹⁹. Também testamos a ferramenta em dados de pip de tom e obtivemos resultados semelhantes. Os dados ABR da maioria dos sistemas ABR podem ser exportados como arquivos .txt (ASCII). Nós carregamos arquivos ABR ASCII em um computador e os abrimos no RStudio conforme descrito no protocolo. Após a execução da rotina FindPeaks.R em forma de lote, obtivemos formas de onda de amostra com rotulagem automatizada (Figura 1) e um arquivo de .csv com os resultados. Os resultados foram revisados para remover picos irrelevantes. Para validar a rotulagem automatizada, também foi utilizada a capacidade do programa ABR para rotular manualmente os cinco primeiros picos e vales em cada forma de onda obtida com a série de cliques descrita acima. O experimentador que realizava essa tarefa tinha 2 anos de experiência registrando e analisando dados de PEATE. A Figura 2 mostra essa comparação, com os dados automatizados do FindPeaks.R em vermelho e os dados obtidos manualmente em preto. Cada rastreamento representa os dados de um único mouse. A média para ambos os métodos com um desvio padrão também é exibida. Os resultados obtidos pelo FindPeaks.R correlacionam-se fortemente com os resultados obtidos manualmente (ver Figura Suplementar S4).

Figura 1: Resposta representativa da forma de onda a um estímulo de clique de 75 dB para um rato F1 jovem. A latência em milissegundos é plotada no eixo x, e a amplitude em microvolts é plotada no eixo y. Os picos foram automaticamente identificados com FindPeaks.R e são rotulados em vermelho, enquanto os vales são rotulados em azul. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Comparação dos dados obtidos dos picos identificados manualmente com os dados fornecidos pela análise FindPeaks.R. (A,C,E,G,I) As amplitudes em microvolts e latências (B,D,F,H,J) em milissegundos são plotadas para níveis sonoros entre 5 dB e 75 dB (eixo x, todos os gráficos) para picos I-V nas formas de onda obtidas para estímulos de clique apresentados a 12 camundongos. Os valores obtidos manualmente (preto) são comparados com os mesmos conjuntos de dados analisados com o FindPeaks.R (vermelho). As médias são plotadas como linhas pesadas, com a região sombreada representando um desvio padrão. Não foram observadas diferenças entre os métodos quando avaliados com o teste de soma de postos de Kruskal-Wallis (A, diferença = 0,0547977 ± 0,0010028, máx = 0,96, p = 0,9216; B, diferença = −0,0001734 ± 0,0001214, max = 0,04, p = 0,8289; C, diferença = −0,0212209 ± 0,0006806, máx = 0,92, p = 0,9687; D, diferença = −0,0011047 ± 0,0001556, max = 0,06, p = 0,771; E, diferença = −0,0323077 ± 0,0006169, máx = 0,66, p = 0,899; F, diferença = −0,0072189 ± 0,0001460, max = 0,04, p = 0,8644; G, diferença = 0,201754 ± 0,0007407, máx = 0,64, p = 0,9312; H, diferença = −0,0007018 ± 0,0001717, max = 0,09, p = 0,8013; I, diferença = 0,0347561 ± 0,0007343, máx = 1,05, p = 0,8856; J, diferença = −0,0078049 ± 0,0002762, máx = 0,16, p = 0,886), e os resultados foram altamente correlacionados (valores qui-quadrados: A, 0,009696; B, 0,046684; C, 0,0015395; D, 0,084742; E, 0,016102; F, 0,029153; G, 0,0074604; H, 0,063322; I, 0,020699; J, 0,020544; diferenças apresentadas como média ± EPM; max = diferença máxima absoluta). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura Suplementar S1: Análise com FindPeaks.R. (A) Selecionar o diretório de trabalho (consulte a etapa 3.2 do protocolo); (B) carregar o programa (consulte a etapa 3.3 do protocolo). Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura S2 Suplementar: Script de saída e comandos para a análise das formas de onda. Comandos para (A) arquivos individuais e (B) processamento em lote. (C) Arquivo PDF de saída mostrando formas de onda com picos e vales rotulados. Consulte a etapa 3.4 do protocolo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Complementar S3: Verificação da análise. (A) Carregando os dados da forma de onda (ver etapa 4.1 do protocolo). (B) Localização do botão Executar Aplicativo . O arquivo de dados de exemplo também é indicado. (C) Janela brilhante com uma forma de onda. Neste caso, o nível de som é de 75 dB, conforme inserido na janela superior. Clicar em um pico desejado e no cavado a seguir registra os dados para a amplitude e latência na tabela (etapa do protocolo 4.6). Os dados do pico 3 são mostrados. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S4: Comparação dos dados individuais obtidos a partir dos picos identificados manualmente com os dados fornecidos pela análise FindPeaks.R. (A, C, E, G, I) Amplitudes em microvolts e latências (B,D,F,H,J) em milissegundos são plotadas para níveis sonoros entre 5 dB e 75 dB (eixo x, todos os gráficos) para picos I-V em formas de onda obtidas para estímulos de clique apresentados a 12 camundongos. Cada animal é rotulado com uma cor única, como mostrado na legenda. Os dados obtidos com o FindPeaks.R são rotulados com cores sólidas, enquanto os dados obtidos manualmente são rotulados com versões menos saturadas das mesmas cores. Embora ambos os conjuntos de dados sejam plotados nesta figura, quando são idênticos, apenas uma linha é aparente. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O protocolo descrito nesta publicação deve ajudar a agilizar a aquisição de dados que descrevem as razões de amplitude de tensão e os intervalos de latência de ABRs para cliques e pips de tom. Ao empregar comandos únicos no RStudio, um experimentador pode extrair, compilar e exibir essas informações em um único documento para análise estatística. Ao tornar essa análise rotineira, esperamos que o campo descubra novas maneiras pelas quais o PEATE pode ser alterado no desenvolvimento, no envelhecimento ou por insulto em diferentes espécies. Tais informações podem ser valiosas para a identificação de mecanismos importantes semelhantes à sinaptopatia a partir do ruído². Os ratos jovens utilizados para este experimento tiveram respostas altamente variáveis, provavelmente porque o tronco encefálico auditivo ainda está amadurecendo nesta idade²⁰. No entanto, os dois métodos de quantificação apresentaram correlações muito fortes (Figura 2).

O script usa um arquivo chamado "Time.csv" para definir intervalos dentro dos dados para identificação de pico. Resumidamente, uma amplitude de tensão máxima que ocorre em um intervalo de tempo especificado é rotulada como "pico 1", uma tensão mínima que ocorre no intervalo seguinte é rotulada como "vale 1" e assim por diante. Optou-se pelos intervalos para abranger as latências das respostas de clique e tone pip para camundongos CBA/CaJ com idade entre 1 mês e 12 meses de idade, usando frequências que abrangem 8 kHz a 32 kHz. Usamos com sucesso a ferramenta para também medir as respostas do pip de tom em camundongos. Outras espécies, incluindo os seres humanos, também têm respostas de PEATE dentro de janelas semelhantes, e antecipamos que essa ferramenta também possa ser usada para dados de outras espécies. Recomendamos o uso do novo método ABR paralelo para humanos²¹, que produz excelentes formas de onda. A limitação do intervalo de tempo restringe o uso dessa ferramenta para avaliar as respostas imediatas do PEATE. Observamos, no entanto, que os dados de intervalo neste arquivo podem ser alterados pelos usuários para automatizar as medidas das respostas do PEATE à fala ou dos potenciais relacionados a eventos (ERPs) que caracteristicamente ocorrem em momentos diferentes em resposta ao som.

Algumas características do tratamento estatístico desses dados merecem destaque. Até onde sabemos, o campo não possui um tratamento padronizado para distinguir progressões de amplitude. Os primeiros estudos utilizaram ANOVA^22,23. Os dados da série de cliques aqui (Figura 2) não foram paramétricos, levando à utilização do teste de soma de postos de Kruskal-Wallis. Semelhante à ANOVA, o teste de soma de postos de Kruskal-Wallis avalia as diferenças nos valores obtidos em um determinado nível de um estímulo; ou seja, compara as linhas obtidas no gráfico. No entanto, outros tratamentos também são possíveis. Biologicamente, as progressões de amplitude refletem o recrutamento adicional de neurônios de limiar mais alto à medida que o nível de estímulo aumenta. Isso sugere que a área sob a curva, que representa as integrais das linhas, poderia ser a medida mais relevante. Equações de estimação generalizada (GEE) podem ser utilizadas para modelar dados individuais para uma análise integral, como em Patel et ^al.5. Notavelmente, a análise GEE pode levar em consideração o projeto de medidas repetidas desses experimentos. À medida que mais pesquisadores discutem os métodos de análise de dados, antecipamos o surgimento de um consenso sobre as melhores práticas.

Em conclusão, este artigo apresenta ferramentas gratuitas e fáceis de usar para medir, compilar e visualizar formas de onda do PEATE. Essas ferramentas podem ser usadas por estudantes novatos do RStudio seguindo este protocolo, e incorporam um passo ofuscante para melhorar o rigor e a reprodutibilidade. Prevemos que a análise rotineira da forma de onda do PEATE permitirá a descoberta de insultos, variantes genéticas e outros tratamentos que podem afetar a função auditiva.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J  mice	Jackson Labs	664
CBA/CaJ mice	Jackson Labs	654
E-series PC	Dell	n/a (this equipment was discontinued)	This runs the IHS system.
Mini-anechoic chamber	Industrial Acoustics Company	Special order number 104306	This enclosure reduces noise levels for auditory testing of animals.
Optiplex 7040	Dell	i5-6500	Rstudio may also be run on a Mac or Linux system.
Universal Smart Box	Intelligent Hearing Systems	n/a (this equipment was discontinued)	Both TDT and IHS can output hearing data as ASCII files.