Analyse semi-automatisée de l’amplitude et de la latence des pics de réponse auditive du tronc cérébral à l’aide de R

Résumé

Cet article décrit la mesure semi-automatisée des amplitudes et des latences des cinq premiers pics et creux de la forme d’onde de réponse auditive du tronc cérébral. Une routine supplémentaire compile et annote les données dans une feuille de calcul pour l’analyse de l’expérimentateur. Ces routines informatiques gratuites sont exécutées à l’aide du progiciel statistique open source R.

Résumé

De nombreux rapports au cours des 15 dernières années ont évalué les changements dans la forme d’onde de la réponse auditive du tronc cérébral (ABR) après des insultes telles que l’exposition au bruit. Les changements courants incluent des réductions de l’amplitude du pic 1 et des latences relatives des pics ultérieurs, ainsi qu’un gain central accru, qui se traduit par une augmentation relative des amplitudes des pics ultérieurs par rapport à l’amplitude du pic 1. De nombreux expérimentateurs identifient visuellement les pics et les creux pour évaluer leurs hauteurs et latences relatives, ce qui est un processus laborieux lorsque les formes d’onde sont collectées par incréments de 5 dB dans toute la plage auditive pour chaque fréquence et condition. Cet article décrit des routines libres qui peuvent être exécutées dans la plate-forme open source R avec l’interface RStudio pour semi-automatiser les mesures des pics et des creux des formes d’onde de réponse auditive du tronc cérébral (ABR). Les routines identifient les amplitudes et les latences des pics et des creux, les affichent sur une forme d’onde générée pour inspection, rassemblent et annotent les résultats dans une feuille de calcul pour l’analyse statistique et génèrent des formes d’onde moyennes pour les chiffres. Dans les cas où le processus automatisé identifie mal la forme d’onde ABR, il existe un outil supplémentaire pour aider à la correction. L’objectif est de réduire le temps et les efforts nécessaires pour analyser la forme d’onde ABR afin que davantage de chercheurs incluent ces analyses à l’avenir.

Introduction

La réponse auditive du tronc cérébral (ABR) est fréquemment utilisée pour déterminer les seuils auditifs chez les sujets animaux et les nourrissons humains. Comme l’ABR est un enregistrement par électroencéphalogramme (EEG) des premières réponses du système nerveux aux stimuli auditifs, il contient des informations supplémentaires qui reflètent le déclenchement coordonné des neurones ganglionnaires en spirale cochléaire et le traitement précoce du signal dans le tronc cérébral auditif, y compris le traitement bilatéral¹. Ces réponses peuvent être affectées par un traumatisme sonore. Par exemple, une exposition au bruit suffisante pour induire un déplacement temporaire du seuil chez les souris peut également réduire de façon permanente l’amplitude du pic ABR 1². De plus, un tel traumatisme peut réduire les latences entre pics et augmenter les amplitudes relatives des pics ultérieurs³, peut-être en raison d’une perte de régulation inhibitrice⁴. En plus de ces résultats, il a été démontré que des mutations génétiques spécifiques modifient la forme d’onde ABR en l’absence de traumatisme ^5,6,7. Ainsi, l’analyse de routine des formes d’onde ABR peut fournir un aperçu du système auditif dans les modèles expérimentaux.

L’utilisation des formes d’onde ABR comme outil de diagnostic pour les patients a également suscité un intérêt. Des rapports antérieurs ont évalué si le pic ABR 1 est réduit chez les patients humains après une exposition au bruit ou chez les patients souffrant d’acouphènes ^8,9. Notamment, les crises de migraine ont été signalées pour augmenter temporairement les latences interpeak pendant plusieurs semaines, après quoi la forme d’onde ABR revient à la normale chez les personnes touchées¹⁰. Il a été signalé que la COVID-19 entraînait des modifications à long terme des latences ABR entre les pics 11,12^, bien qu’une autre étude ait rapporté des résultats différents¹³. La perte auditive est souvent comorbide avec la démence liée au vieillissement, et les personnes ayant une perte auditive plus importante ont tendance à souffrir d’une démence qui progresse plus rapidement¹⁴. Les chercheurs ont étudié les changements de forme d’onde ABR dans les maladies neurodégénératives, telles que la maladie de Parkinson (examinée dans Jafari et al.15) et la maladie d’Alzheimer (revue dans Swords et al.16), ainsi que dans le vieillissement normal ¹⁷. Alors que de plus en plus de chercheurs et de cliniciens étudient les déficits sensoriels en tant que biomarqueurs de maladies courantes au cours du vieillissement, des techniques telles que l’ABR pourraient devenir courantes dans les soins de santé.

Un examen des sections de méthodes dans la littérature révèle que les laboratoires écrivent souvent des scripts personnalisés dans MatLab pour analyser les formes d’onde ABR. La plate-forme ABR fabriquée par Intelligent Hearing Systems a une fonction d’analyse de forme d’onde, mais elle nécessite un opérateur pour sélectionner manuellement les pics et les creux. Ici, nous avons écrit des routines d’analyse semi-automatisées pour l’environnement statistique open source et disponible gratuitement R et l’interface RStudio. Ce rapport compare les données obtenues à l’aide de nos routines aux données obtenues en demandant à un expérimentateur d’identifier manuellement les pics et les creux et montre que les données des deux méthodes sont fortement corrélées. Il est important de noter que les routines intègrent une fonction d’insu, dans laquelle les métadonnées des échantillons sont placées dans un fichier séparé qui n’est incorporé qu’à la fin. Ces fonctions ont rationalisé l’analyse de la forme d’onde pour notre laboratoire.

Protocole

Toutes les procédures effectuées sur les animaux ont été approuvées à l’avance par le Comité de recherche animale de l’Université de Rochester. Les sujets expérimentaux étaient 12 souris mâles et femelles F1 de type sauvage à l’âge de 1 mois. Ces souris F1 sont le produit de l’accouplement d’une digue CBA/CaJ et d’un taureau C57BL/6J. Les souris ont été élevées et logées dans le vivarium avec un cycle lumière/obscurité standard de 12 heures, de la nourriture et de l’eau illimitées et de nombreuses fournitures de nidification. Pas plus de cinq frères et sœurs de même sexe étaient logés ensemble dans une cage.

1. Obtention de données à des fins d’analyse

REMARQUE : Cette étape doit être conforme aux lignes directrices de l’établissement et être approuvée au préalable par le comité de bien-être animal de l’établissement. Le processus détaillé de génération de données ABR à partir de souris a été décrit ailleurs¹⁸.

1. Enregistrez l’ABR avec la plateforme de votre choix.
   REMARQUE: Dans le cas montré ici, les enregistrements ont été effectués sur des souris.
   1. Utilisez un stimulus de clic de 5 ms commençant à un niveau de pression acoustique de 75 dB et diminuant par pas de 5 dB à 5 dB. Enregistrez en moyenne 512 balayages pour chaque amplitude. Rejeter les réponses si leur amplitude maximale à la creux est supérieure à 31 μV à tout moment entre 1,3 ms et 12,5 ms après le stimulus.
      REMARQUE: Les enregistrements des présentations de pip de tonalité peuvent également être utilisés. Nous prévoyons que la routine d’analyse fonctionnera pour d’autres espèces, y compris les humains.
2. Exportez l’enregistrement ABR en tant que fichier ASCII.
   1. Pour IHS, ouvrez le programme informatique.
   2. Chargez le fichier qui vous intéresse et affichez les formes d’onde souhaitées sur une seule page.
   3. Sous l’onglet Données , sélectionnez Enregistrer la page au format ASCII pour obtenir un fichier .txt.
   4. Après avoir nommé le fichier de données de manière appropriée (« ID »), enregistrez l’ID et les informations sur le sujet dans un fichier de métadonnées intitulé « info .csv ». S’assurer que la « DI » ne comprend aucune information telle que le génotype, le sexe, l’âge ou le traitement; Ces informations sont plutôt enregistrées dans « Info.csv ».
      REMARQUE: Un jeu de cartes à jouer équitable peut être utilisé pour attribuer des étiquettes au hasard si nécessaire.
   5. Répétez avec tous les fichiers à analyser en tant que fichiers « ID » séparés.

2. Installation des paquets requis et chargement des données sur l’ordinateur de travail

1. Téléchargez et installez R (https://www.r-project.org) et RStudio (https://www.rstudio.com).
   Remarque : Le protocole décrit ici utilisé R ≥ 4.0.0.
2. Installez les bibliothèques requises, tidyverse, shiny, plotly et zoo, en tapant la commande suivante dans la fenêtre de commande de RStudio :
   Install.packages(« tidyverse »)
   Install.packages(« shiny »)
   Install.packages(« plotly »)
   Install.packages(« zoo »)
3. Téléchargez les scripts FindPeaks.R et See_trace_click. R du GitHub (https://github.com/PWhiteLab/FindPeaks) du laboratoire blanc, ainsi que le fichier associé « Time.csv ».
4. Créez un nouveau dossier contenant tous les fichiers ASCII, « info.csv » et « Time.csv ». Pour cet exemple, nommez le dossier « Test_Folder ». Dans « Test_Folder », placez les fichiers ASCII dans un sous-dossier intitulé « ASCII_Folder ».

3. Obtenir l’analyse préliminaire avec FindPeaks.R

1. Ouvrez le script FindPeaks.R dans RStudio.
2. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’onglet du script dans la barre d’outils pour sélectionner Définir le répertoire de travail et définissez-le sur Test_Folder (voir la figure supplémentaire S1A).
3. Dans la fenêtre de script , cliquez sur Source dans le coin supérieur droit de la barre d’outils pour charger le programme (voir la figure supplémentaire S1B).
4. Dans la fenêtre de commande, utilisez les commandes suivantes pour analyser les formes d’onde (voir Figure supplémentaire S2) :
   FindPeaks_single(« ASCII_folder/ID.txt ») pour les dossiers individuels (voir figure supplémentaire S2A)
   FindPeaks_group(« ASCII_Folder ») pour le traitement par lots (voir figure supplémentaire S2B)
   REMARQUE: Le script produira (1) des fichiers pdf affichant les formes d’onde avec des pics et des creux étiquetés (voir Figure supplémentaire S2C) et (2) un fichier ID.csv contenant les données numériques pour l’amplitude (μV) et la latence (ms). Les deux fichiers seront placés dans « Test_Folder ».

4. Vérification de l’analyse préliminaire

REMARQUE: À de faibles niveaux sonores, certaines parties de la forme d’onde peuvent devenir difficiles à distinguer du bruit, et FindPeaks.R peut mal identifier les pics ou les creux par rapport à l’opinion de l’expérimentateur. S’il y a une divergence, le fichier .csv peut être modifié avec les données obtenues à partir du script See_trace_click.R.

1. Chargez les données de forme d’onde pour l’individu spécifique à l’aide de la commande (voir la figure supplémentaire S3A) :
   Forme d’onde <- ASCII_extract(« ASCII_Folder/ID.txt »)
2. Ouvrez le See_trace_click. Script R dans RStudio.
3. Dans l’en-tête de gauche, cliquez sur le bouton Exécuter l’application et attendez qu’une nouvelle fenêtre interactive (brillante) apparaisse (voir la figure supplémentaire S3B).
4. Dans la zone en haut à gauche, entrez le niveau sonore de la forme d’onde qui nécessite une révision et recherchez la forme d’onde affichée dans la fenêtre.
5. Déplacez le curseur autour de la forme d’onde pour révéler la latence et l’amplitude en tout point.
6. Cliquez sur le pic correct et le creux suivant pour enregistrer les données dans le tableau ci-dessous. Copiez et collez les données de latence dans le fichier .csv (voir la figure supplémentaire S3C).
7. Pour calculer la mesure de l’amplitude, soustrayez l’amplitude minimale suivante de l’amplitude de crête dans la cellule de feuille de calcul.

5. Compilation et visualisation de l’ensemble de données

1. Transférez les fichiers .csv vérifiés dans un nouveau sous-dossier dans Test_Folder intitulé « Peak_Data ».
2. Ajoutez les données dans un seul fichier .csv et nommez-le « Peak_Data.csv ».
3. Utilisez la commande suivante :
   Compiler (« Peak_Data »)
   Remarque : Ce script combine les métadonnées de info.csv avec Peak_Data.csv pour étiqueter les données avec des informations de groupe. Il calcule également automatiquement les latences interpics et les rapports d’amplitude.
4. Effectuer une analyse statistique sur les données compilées.
   1. Utilisez un test de normalité, tel que le test de Shapiro-Wilks, pour évaluer la distribution des données avec la fonction suivante :
      shapiro.test()
   2. Si le test de Shapiro-Wilks n’est pas significatif, l’ensemble de données a une distribution normale; par conséquent, évaluez les données avec un test paramétrique tel que l’ANOVA avec la fonction suivante:
      aov()
   3. Si le test de Shapiro-Wilks est inférieur à p = 0,05, utilisez le test de somme des rangs de Kruskal-Wallis (avec la fonction ci-dessous) ou une autre mesure non paramétrique appropriée (voir d’autres possibilités dans la discussion).
      kruskal.test()
5. Pour afficher les formes d’onde moyennes, utilisez la commande suivante :
   Average_Waveform(« ASCII_Folder », aes(x = Data_Pnt_ms, y = « dB », group = Génotype, couleur = Génotype))
   REMARQUE: Cette commande affiche les formes d’onde moyennes pour différents génotypes dans différentes couleurs. Pour la variable y dB, insérez le nombre qui correspond à l’amplitude souhaitée, par exemple 75, sans guillemets. Pour d’autres comparaisons, utilisez l’étiquette de groupe correspondante à partir des métadonnées.

Résultats

Nous avons testé les routines sur les réponses de forme d’onde ABR à une série de clics, en commençant à 75 dB et en diminuant par incréments de 5 dB à 5 dB. Ces données ont été obtenues comme décrit précédemment¹⁹. Nous avons également testé l’outil sur les données de pip de tonalité et obtenu des résultats similaires. Les données ABR de la plupart des systèmes ABR peuvent être exportées sous forme de fichiers .txt (ASCII). Nous avons chargé les fichiers ABR ASCII sur un ordinateur et les avons ouverts dans RStudio comme décrit dans le protocole. Après avoir exécuté la routine FindPeaks.R sous forme de lots, nous avons obtenu des échantillons de formes d’onde avec étiquetage automatisé (Figure 1) et un fichier .csv avec les résultats. Les résultats ont été examinés pour éliminer les pics non pertinents. Pour valider l’étiquetage automatisé, nous avons également utilisé la capacité du programme ABR pour étiqueter manuellement les cinq premiers pics et creux sur chaque forme d’onde obtenue avec la série de clics décrite ci-dessus. L’expérimentateur effectuant cette tâche avait 2 ans d’expérience dans l’enregistrement et l’analyse des données ABR. La figure 2 montre cette comparaison, avec les données automatisées de FindPeaks.R en rouge et les données obtenues manuellement en noir. Chaque trace représente les données d’une seule souris. La moyenne pour les deux méthodes avec un écart-type est également affichée. Les résultats obtenus par FindPeaks.R sont fortement corrélés avec les résultats obtenus manuellement (voir figure supplémentaire S4).

Figure 1 : Réponse représentative de la forme d’onde à un stimulus de clic de 75 dB pour une jeune souris F1. La latence en millisecondes est tracée sur l’axe des abscisses, et l’amplitude en microvolts est tracée sur l’axe des y. Les pics ont été automatiquement identifiés avec FindPeaks.R et sont étiquetés en rouge, tandis que les creux sont étiquetés en bleu. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2: Comparaison des données obtenues à partir des pics identifiés manuellement aux données fournies par l’analyse FindPeaks.R. (A,C,E,G,I) Les amplitudes en microvolts et les latences (B,D,F,H,J) en millisecondes sont tracées pour des niveaux sonores compris entre 5 dB et 75 dB (axe x, tous les graphiques) pour les pics I-V dans les formes d’onde obtenues pour les stimuli de clic présentés à 12 souris. Les valeurs obtenues manuellement (noir) sont comparées aux mêmes jeux de données analysés avec FindPeaks.R (rouge). Les moyennes sont tracées sous forme de lignes lourdes, la région ombrée représentant un écart-type. Aucune différence n’a été observée entre les méthodes lorsqu’elles ont été évaluées avec le test de somme des rangs de Kruskal-Wallis (A, différence = 0,0547977 ± 0,0010028, max = 0,96, p = 0,9216; B, différence = −0,0001734 ± 0,0001214, max = 0,04, p = 0,8289; C, différence = −0,0212209 ± 0,0006806, max = 0,92, p = 0,9687; D, différence = −0,0011047 ± 0,0001556, max = 0,06, p = 0,771; E, différence = −0,0323077 ± 0,0006169, max = 0,66, p = 0,899; F, différence = −0,0072189 ± 0,0001460, max = 0,04, p = 0,8644; G, différence = 0,201754 ± 0,0007407, max = 0,64, p = 0,9312; H, différence = −0,0007018 ± 0,0001717, max = 0,09, p = 0,8013; I, différence = 0,0347561 ± 0,0007343, max = 1,05, p = 0,8856; J, différence = −0,0078049 ± 0,0002762, max = 0,16, p = 0,886), et les résultats étaient fortement corrélés (valeurs du chi carré : A, 0,009696 ; B, 0,046684; C, 0,0015395; D, 0,084742; E, 0,016102; F, 0,029153; G, 0,0074604; H, 0,063322; I, 0,020699; J, 0,020544; les différences présentées sous forme de moyenne ± SEM; max = différence maximale absolue). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1 : Analyse avec FindPeaks.R. (A) Sélection du répertoire de travail (voir l’étape 3.2 du protocole) ; (B) chargement du programme (voir l’étape 3.3 du protocole). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2 : Sortie du script et commandes pour l’analyse des formes d’onde. Commandes pour (A) les fichiers individuels et (B) le traitement par lots. (C) Fichier PDF de sortie montrant les formes d’onde avec des pics et des creux étiquetés. Voir l’étape 3.4 du protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S3 : Vérification de l’analyse. (A) Chargement des données de forme d’onde (voir l’étape 4.1 du protocole). (B) Emplacement du bouton Exécuter l’application . L’exemple de fichier de données est également indiqué. (C) Fenêtre brillante avec une forme d’onde. Dans ce cas, le niveau sonore est de 75 dB, comme indiqué dans la fenêtre supérieure. Cliquez sur un pic souhaité et le creux suivant pour enregistrer les données d’amplitude et de latence dans le tableau (étape de protocole 4.6). Les données du pic 3 sont affichées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S4: Comparaison des données individuelles obtenues à partir des pics identifiés manuellement aux données fournies par l’analyse FindPeaks.R. (A,C,E,G,I) Les amplitudes en microvolts et les latences (B, D, F, H, J) en millisecondes sont tracées pour des niveaux sonores compris entre 5 dB et 75 dB (axe x, tous les graphiques) pour les pics I-V dans les formes d’onde obtenues pour les stimuli de clic présentés à 12 souris. Chaque animal est étiqueté avec une couleur unique, comme le montre la légende. Les données obtenues avec FindPeaks.R sont étiquetées avec des couleurs unies, tandis que les données obtenues manuellement sont étiquetées avec des versions moins saturées des mêmes couleurs. Bien que les deux ensembles de données soient représentés dans cette figure, lorsqu’ils sont identiques, une seule ligne est apparente. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le protocole décrit dans cette publication devrait aider à rationaliser l’acquisition de données décrivant les rapports d’amplitude de tension et les intervalles de latence pour les ABR aux clics et aux pips de tonalité. En utilisant des commandes uniques dans RStudio, un expérimentateur peut extraire, compiler et afficher ces informations dans un seul document pour l’analyse statistique. En faisant de cette analyse une routine, nous espérons que le domaine découvrira de nouvelles façons de modifier l’ABR dans le développement, le vieillissement ou par insulte chez différentes espèces. De telles informations pourraient être utiles pour identifier des mécanismes importants similaires à la synaptopathie à partir du bruit². Les jeunes souris utilisées pour cette expérience ont eu des réponses très variables, probablement parce que le tronc cérébral auditif est encore en maturation à cet âge^{de 20} ans. Néanmoins, les deux méthodes de quantification ont montré de très fortes corrélations (Figure 2).

Le script utilise un fichier appelé « Time.csv » pour définir des intervalles dans les données pour l’identification des pics. En bref, une amplitude de tension maximale se produisant dans un intervalle de temps spécifié est étiquetée « crête 1 », un minimum de tension se produisant dans l’intervalle suivant est étiqueté « creux 1 », et ainsi de suite. Nous avons choisi les intervalles pour englober les latences des réponses pip clic et tonalité pour les souris CBA/CaJ âgées de 1 mois à 12 mois en utilisant des fréquences allant de 8 kHz à 32 kHz. Nous avons utilisé avec succès l’outil pour mesurer également les réponses de pip de tonalité chez la souris. D’autres espèces, y compris les humains, ont également des réponses ABR dans des fenêtres similaires, et nous prévoyons que cet outil peut également être utilisé pour les données d’autres espèces. Nous recommandons d’utiliser la nouvelle méthode parallèle ABR pour les humains²¹, qui produit d’excellentes formes d’onde. La limite d’intervalle de temps limite l’utilisation de cet outil à l’évaluation des réponses ABR immédiates. Nous notons, cependant, que les données d’intervalle dans ce fichier pourraient être modifiées par les utilisateurs pour automatiser les mesures des réponses ABR à la parole ou des potentiels liés à l’événement (ERP) qui se produisent de manière caractéristique à différents moments en réponse au son.

Certaines caractéristiques du traitement statistique de ces données méritent d’être soulignées. À notre connaissance, le domaine ne dispose pas d’un traitement standardisé pour distinguer les progressions d’amplitude. Les premières études ont utilisé l’ANOVA^22,23. Les données de la série de clics ici (Figure 2) n’étaient pas paramétriques, ce qui a conduit à l’utilisation du test de somme de rang de Kruskal-Wallis. Semblable à l’ANOVA, le test de somme de rang de Kruskal-Wallis évalue les différences dans les valeurs obtenues à un niveau donné d’un stimulus; c’est-à-dire qu’il compare les lignes obtenues sur le graphique. Cependant, d’autres traitements sont également possibles. Biologiquement, les progressions d’amplitude reflètent le recrutement supplémentaire de neurones à seuil plus élevé à mesure que le niveau de stimulus augmente. Cela suggère que l’aire sous la courbe, qui représente les intégrales des droites, pourrait être la mesure la plus pertinente. Les équations d’estimation généralisées (GEE) peuvent être utilisées pour modéliser des données individuelles pour une analyse intégrale, comme dans Patel et ^al.5. Notamment, l’analyse GEE peut prendre en considération la conception de mesures répétées de ces expériences. Au fur et à mesure que de plus en plus de chercheurs discutent des méthodes d’analyse des données, nous anticipons l’émergence d’un consensus sur les meilleures pratiques.

En conclusion, cet article présente des outils gratuits et faciles à utiliser pour mesurer, compiler et visualiser les formes d’onde ABR. Ces outils peuvent être utilisés par les étudiants novices de RStudio en suivant ce protocole, et ils intègrent une étape de mise en aveugle pour améliorer la rigueur et la reproductibilité. Nous prévoyons que l’analyse de routine de la forme d’onde ABR permettra de découvrir des insultes, des variantes génétiques et d’autres traitements pouvant affecter la fonction auditive.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J  mice	Jackson Labs	664
CBA/CaJ mice	Jackson Labs	654
E-series PC	Dell	n/a (this equipment was discontinued)	This runs the IHS system.
Mini-anechoic chamber	Industrial Acoustics Company	Special order number 104306	This enclosure reduces noise levels for auditory testing of animals.
Optiplex 7040	Dell	i5-6500	Rstudio may also be run on a Mac or Linux system.
Universal Smart Box	Intelligent Hearing Systems	n/a (this equipment was discontinued)	Both TDT and IHS can output hearing data as ASCII files.