Técnicas y prácticas de cultivo celular para evitar la contaminación por hongos y bacterias en el laboratorio de investigación de cultivos celulares

Resumen

Este protocolo presenta técnicas y prácticas esenciales de cultivo celular para ser utilizadas en el laboratorio de investigación de cultivos celulares para evitar la contaminación por hongos y bacterias. Dentro de la categoría de bacterias, se hará especial hincapié en la prevención de la contaminación por micoplasma.

Resumen

El cultivo celular es una habilidad delicada necesaria para cultivar células humanas, animales e insectos, u otros tejidos, en un ambiente controlado. El objetivo del protocolo es enfatizar las técnicas correctas utilizadas en un laboratorio de investigación para prevenir la contaminación por hongos y bacterias. Se hace especial hincapié en evitar la contaminación por micoplasma, una preocupación importante en la sala de cultivo celular debido a su pequeño tamaño y resistencia a la mayoría de los antibióticos utilizados para el cultivo celular. Estas mismas técnicas aseguran el crecimiento continuo y mantienen las células sanas. Tanto para los usuarios nuevos como para los experimentados de cultivos celulares, es importante adherirse constantemente a estas mejores prácticas para mitigar el riesgo de contaminación. Una vez al año, los laboratorios deben revisar las mejores prácticas de cultivo celular y hacer un seguimiento con una discusión o capacitación adicional si es necesario. Tomar medidas tempranas para prevenir la contaminación en primer lugar ahorrará tiempo y dinero, en comparación con la limpieza después de que ocurra la contaminación. Las mejores prácticas universales mantienen los cultivos celulares saludables, reduciendo así la necesidad de descongelar constantemente nuevas células, comprar costosos medios de cultivo celular y reducir la cantidad de descontaminación de la incubadora y el tiempo de inactividad.

Introducción

El cultivo celular tiene muchos usos en el laboratorio de investigación. Desde los orígenes del cultivo celular a principios del siglo 20, las líneas celulares han ayudado a avanzar en la ciencia. Las líneas celulares tienen varias ventajas; Varias líneas celulares pueden ayudar a los investigadores a estudiar la biología celular, producir baculovirus para estudios posteriores o producir grandes cantidades de una proteína de interés, por nombrar algunas¹. Algunos usos adicionales incluyen el estudio del crecimiento de tejidos, ayudar a avanzar en el desarrollo de vacunas, la investigación toxicológica, el estudio del papel de los genes en organismos sanos y modelos enfermos, y la producción de líneas celulares híbridas ^2,3. Las líneas celulares también pueden permitir la producción de fármacos³. Las técnicas asépticas adecuadas son necesarias cuando se trabaja con líneas celulares; Las prácticas y técnicas descritas en este manuscrito son aplicables a los laboratorios de investigación donde se realiza el trabajo de cultivo celular. No se discuten otros entornos de laboratorio.

La contaminación es a menudo la principal preocupación cuando se realiza el trabajo de cultivo celular. En el contexto de este documento, la contaminación generalmente se refiere a hongos y bacterias. El objetivo general del método descrito en este documento es describir a fondo las mejores prácticas para evitar la contaminación. Todos los miembros del laboratorio deben adherirse a estas prácticas cuando trabajen en la sala de cultivo celular de un laboratorio de investigación. Los laboratorios deben asegurarse de que todos los trabajadores participen activamente en el uso de estas mejores prácticas para prevenir la contaminación. El conocimiento de las prácticas y técnicas correctas ayudará a garantizar que los cultivos celulares permanezcan viables, sanos y libres de contaminación. El desarrollo de esta técnica se basa en la investigación de la literatura, siete años de experiencia trabajando con cultivos celulares y la necesidad de un método al que tanto los principiantes como los trabajadores experimentados de cultivos celulares puedan consultar anualmente.

Existe la necesidad de una técnica clara y estandarizada que todos los laboratorios de cultivo celular de investigación deben seguir. Gran parte de la literatura sobre contaminación por cultivos celulares discute la detección de micoplasma, técnicas asépticas, fuentes de contaminación, eliminación de contaminantes y prevención mediante el uso de antibióticos y pruebas regulares 4,5,6,7,8. Si bien esta información es útil, no hay videos presentes en la literatura que demuestren las técnicas adecuadas de cultivo celular que uno debe seguir. La ventaja de las prácticas presentadas sobre las técnicas alternativas es un enfoque en prevenir la contaminación antes de que ocurra, en lugar de detectar y corregir errores más tarde. Además, una demostración exhaustiva de técnicas asépticas, una discusión sobre la prevención del crecimiento de hongos y bacterias, e información sobre el flujo de aire del gabinete de bioseguridad son valiosos tanto para los trabajadores de cultivos celulares novatos como para los experimentados.

Las bacterias y los hongos son los dos tipos más comunes de contaminantes. Dentro de la categoría de bacterias, el micoplasma es una preocupación importante debido a su pequeño tamaño y capacidad para proliferar sin ser notado. Son organismos autorreplicantes sin pared celular rígida que dependen de las células eucariotas para crecer. Tienen capacidades metabólicas reducidas y pueden multiplicarse en gran medida mientras permanecen sin ser reconocidos en la inspección visual rutinaria de cultivos celulares y análisis microscópicos regulares, aunque la microscopía electrónica de transmisión puede detectar micoplasma ^9,10. Además, pueden pasar a través de filtros microbiológicos¹⁰. El medio de cultivo celular proporciona nutrientes al micoplasma, aunque desafortunadamente la suplementación de los medios con antibióticos no afecta al micoplasma¹⁰. Se debe tener en cuenta que, en general, no es necesario complementar los medios con antibióticos; Las técnicas adecuadas deberían ser suficientes para mantener a raya la contaminación. La infección con micoplasma no conduce a la muerte celular inmediata, pero es preocupante para los investigadores, ya que afecta la reproducibilidad y la calidad de los datos.

Todo el personal de laboratorio debe adherirse estrictamente a las buenas prácticas de cultivo celular. Los cultivos deben analizarse para detectar micoplasma después de que se hayan comprado recientemente, mientras se cultivan actualmente, antes de la criopreservación y cuando se descongelan del nitrógeno líquido ^2,10. Hay diferentes pruebas disponibles en el mercado utilizando reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o inmunotinción. ³ La literatura indica que "los aislados humanos representan un gran porcentaje de los contaminantes de micoplasma encontrados en el cultivo celular"⁵. Aunque se han descrito más de 200 especies de micoplasmas, alrededor de seis de ellas representan la mayoría de las infecciones. Estas seis especies son M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale y Acholeplasma laidlawii¹⁰. Al igual que con otros tipos de contaminación, el aire y los aerosoles los llevan a los cultivos celulares⁵. Esto se repite en otros documentos, ya que el "operador humano es potencialmente el mayor peligro en el laboratorio"⁷. Aunque esto se hace a través de un error humano, el riesgo puede eliminarse si se sigue un procedimiento estándar. El desprendimiento del personal no se limita solo a la contaminación por micoplasma; Los cultivos celulares en un laboratorio generalmente están infectados con la misma especie de micoplasma, lo que indica que la contaminación se propaga de un matraz a otro debido a técnicas inadecuadas de cultivo celular¹⁰.

La prevención de la contaminación cruzada es también otra razón por la que se deben seguir las técnicas adecuadas de cultivo celular. Se observa que al menos entre el 15% y el 18% de las líneas celulares en todo el mundo pueden estar contaminadas o identificadas erróneamente^11,12. Además de analizar las líneas celulares para detectar contaminación por micoplasma, también deben analizarse para detectar contaminación cruzada¹⁰. Para las líneas celulares humanas, la autenticación de líneas celulares mediante una técnica económica basada en el ADN llamada perfil de repetición corta en tándem (STR) es el estándar de referencia internacional actual, ya que es una manera fácil de confirmar la identidad de la línea celular 2,10,13,14. STR puede identificar líneas celulares mal etiquetadas o contaminadas de forma cruzada, pero no puede detectar el origen incorrecto del tejido^10,13,14. La validez de los datos de la investigación puede verse comprometida si las líneas celulares están mal etiquetadas, identificadas erróneamente o contaminadas¹³. Al igual que otros tipos de contaminación, la contaminación cruzada puede ocurrir debido a una técnica deficiente que hace que los aerosoles se propaguen, un contacto erróneo que conduce a que el tipo de célula incorrecto ingrese a un matraz, o el uso de la misma botella de medios y reactivos con diferentes líneas celulares¹⁰. No se debe compartir botellas de medios; Compartir una botella de medios entre dos líneas celulares diferentes puede permitir que esas poblaciones celulares se mezclen, lo que lleva al tipo de célula de crecimiento más rápido a hacerse cargo completamente del matraz. Este reemplazo no se nota y conduce a un etiquetado incorrecto y una identificación errónea². Una línea celular también puede confundirse con otra si se confunden cultivos durante la manipulación o el etiquetado¹⁰. Se debe prestar especial atención a mantener los reactivos, medios y frascos separados entre sí. Cada miembro del laboratorio debe tener sus propias botellas de medios; No se debe compartir entre los miembros del laboratorio. Las líneas celulares deben comprarse a un banco de células y proveedor calificado. Los laboratorios no deben compartir células. Los estudios muestran que, aunque las pruebas de STR y micoplasma se utilizan regularmente, muchos trabajos de investigación en la literatura ya han utilizado líneas celulares mal identificadas o contaminadas¹⁵. Examinar la investigación para encontrar estos documentos problemáticos e informar retroactivamente a los lectores sobre este asunto es engorroso. La prevención es la mejor manera de garantizar que este problema no ocurra en primer lugar.

La simple acción de rociar artículos con 70% de EtOH puede matar organismos; 70% EtOH actúa desnaturalizando proteínas y disolviendo lípidos en los organismos más comúnmente contaminantes, incluyendo bacterias y hongos¹⁶. Los estudios han demostrado que el 70% es la concentración más efectiva; Las proteínas de superficie no coagulan rápidamente con un 70% de EtOH para que puedan entrar en la célula, mientras que el agua que contiene es necesaria para el proceso de desnaturalización de las proteínas. Debido a la diferencia de concentración de agua y alcohol a ambos lados de la pared celular, el 70% de EtOH ingresa a la célula para desnaturalizar las proteínas enzimáticas y estructurales. Si se observa crecimiento de moho en matrazs, toda la incubadora debe descontaminarse rociándola primero con EtOH al 70% y secándola, seguida de una incubación nocturna de 16 h a 60 °C¹⁷. Esto mata la mayoría del moho y cualquier bacteria.

La principal ventaja de las prácticas de prevención sobre las técnicas alternativas para eliminar la contaminación después de que ocurra es que al prevenir la contaminación desde el principio, los trabajadores de laboratorio pueden estar seguros de que sus cultivos celulares están sanos y no habrá altos costos asociados con la descontaminación de incubadoras o el descarte de cultivos celulares. La eliminación de contaminantes de micoplasma después, por ejemplo, no es eficiente⁷. Tomarse el tiempo desde el principio para garantizar que el personal del laboratorio esté debidamente capacitado, que la sala de cultivo celular sea autónoma y que se utilice un procedimiento estándar ahorrará tiempo y dinero.

Protocolo

1. Preparativos

1. General
   1. Use una bata de laboratorio limpia designada para usarse solo en la sala de cultivo celular y no en otras partes del laboratorio.
      NOTA: La bata de laboratorio no necesita ser estéril.
   2. Use guantes nuevos que no hayan tocado ninguna otra superficie. Asegúrese de que los guantes queden bien. Los guantes de nitrilo sin polvo son los mejores.
      NOTA: Los guantes no necesitan ser estériles.
   3. Para prepararse para el trabajo, rocíe los guantes, las mangas de la bata de laboratorio y el interior del gabinete de seguridad biológica con 70% de EtOH. Limpie la superficie de trabajo y el panel de vidrio con una toalla de papel sin pelusa.
      NOTA: El uso de EtOH al 70% mata las bacterias con la mayor eficiencia¹⁶. La toalla de papel no necesita ser estéril.
   4. Mantenga baños de agua dentro de la sala de cultivo celular y solo utilícelos para calentar medios de cultivo o descongelar células. Drene y lave los baños maríacos una vez a la semana, siguiendo las instrucciones del fabricante para la limpieza.
2. Dentro del armario de seguridad biológica
   1. Limite el número de artículos traídos al gabinete. No interrumpa el flujo de aire dentro del gabinete de seguridad biológica bloqueando las rejillas delanteras o traseras.
      NOTA: Consulte la Figura 1 para obtener una explicación de cómo fluye el aire dentro de un gabinete.
   2. Rocíe todos los artículos colocados dentro del gabinete con 70% de EtOH y séquelos. Comience rociando la parte superior de la botella de medios y trabajando hacia abajo. Del mismo modo, con una toalla de papel limpia, séquela, trabajando progresivamente hasta el fondo. No vuelva a subir hacia la tapa.
   3. Si el gabinete es lo suficientemente grande como para acomodar pipetas serológicas, se pueden colocar en el interior, de lo contrario se pueden almacenar en un recipiente montado en el exterior del gabinete. Compruebe si hay agujeros, rasgaduras o pinchazos en el envase a ambos lados de la pipeta revestida antes de usarlos. No arranque el envoltorio. En su lugar, despegue suavemente los extremos de la envoltura, inserte la pipeta serológica en una ayuda de pipeta y retire la envoltura con un movimiento fluido.
   4. No pase el cursor sobre botellas o frascos abiertos; Alcance sobre botellas o frascos abiertos, o abra artículos sobre la parte superior de los artículos ya abiertos en el gabinete de seguridad biológica.
      NOTA: El flujo de aire dentro del gabinete empuja hacia abajo la superficie de trabajo, por lo que cualquier contaminación presente en el manguito, por ejemplo, puede ingresar a los cultivos celulares.
   5. No vierta líquidos. En su lugar, añádalos con una pipeta serológica. Después de complementar los medios, mezcle bien el contenido e inicie la botella. Además, asegúrese de incluir una etiqueta para lo que se complementó con los medios.

2. Trabajo con líneas celulares adherentes

1. Si se necesita un matraz de plástico, rocíe toda la bolsa y colóquela dentro del gabinete.
2. Use pipetas de vidrio esterilizadas en autoclave o pipetas de plástico estériles desechables para aspirar los medios o las soluciones de lavado. Retire con cuidado la tapa metálica del recipiente de almacenamiento. Aísle una pipeta de vidrio agitando suavemente el recipiente en ángulo. Al meter la mano en el recipiente, evite tocar cualquier otra pipeta.
   NOTA: Manipule la pipeta elegida desde un solo extremo.
3. Reemplace rápidamente las tapas de las botellas lo antes posible. Coloque las tapas en la superficie de trabajo boca abajo para que la llanta no toque la superficie de trabajo. No agarre la tapa desde la parte superior o inferior; En su lugar, toque las tapas desde los lados.
4. Al aspirar líquidos, utilice un matraz de vacío situado fuera del armario en un recipiente secundario en el suelo.
   NOTA: No arroje ningún residuo líquido en bolsas de residuos de riesgo biológico ya que las bolsas tendrán fugas. Los residuos se crearán mientras se trabaja dentro del gabinete. Mover las manos dentro y fuera del gabinete con demasiada frecuencia interrumpirá el flujo de aire. Deje cualquier residuo dentro del gabinete temporalmente. Colóquelo a un lado para que no interrumpa el trabajo.
5. Rocíe generosamente los guantes con 70% de EtOH cada vez que se sequen. Frote las manos para que los guantes no se mojen.
6. Si una pipeta serológica toca por error algo en el gabinete, no dude en tirarla. Comience de nuevo con una pipeta serológica limpia en lugar de usar una que pueda estar contaminada.

4. Comprobación y almacenamiento de celdas

1. Antes de colocar células en la incubadora, verifique cómo se ven bajo el microscopio. Si las células han sido completamente suspendidas, se deben observar células individuales.
2. No hable, estornude, tosa ni respire pesadamente en las incubadoras. Abra y cierre rápidamente las puertas de la incubadora. Dejar las puertas abiertas durante más tiempo del necesario puede permitir que los contaminantes presentes en el aire entren en las incubadoras.
   NOTA: Usar una máscara mientras se trabaja en la sala de cultivo celular puede ayudar ya que el micoplasma puede estar presente en la boca humana. Evite el uso de teléfonos celulares en la sala de cultivo celular, ya que no se recomienda hablar.
3. Asegúrese de que las tapas de todas las botellas estén bien cerradas antes de retirarlas del gabinete.
4. Almacene los medios de cultivo celular en la oscuridad a 4 °C cuando no estén en uso, ya que son sensibles a la luz.
5. Rocíe el interior del gabinete con EtOH al 70% nuevamente después de que se complete el trabajo de cultivo celular y seque la superficie con una toalla de papel. Vacíe las bolsas de basura de riesgo biológico. Repita este proceso y reemplace los guantes cuando cambie a una línea celular diferente.

5. Trabajo con líneas celulares de suspensión

1. Para las células de suspensión cultivadas en matraces de vidrio, asegúrese de que los guantes estén bien rociados con 70% de EtOH, luego toque el papel de aluminio con los guantes húmedos y rocíe solo la parte inferior del matraz antes de colocarlo dentro del gabinete.
2. Cuando tome una muestra para el recuento celular, retire solo un tubo de 1,5 ml de su recipiente. No toque ningún otro tubo. Coloque la tapa boca abajo sobre la superficie de trabajo. No toque el borde interior. Manéjelo con cuidado desde los lados y reemplácelo una vez terminado.
3. Retire con cuidado la pieza de papel de aluminio doblada doble que cubre todo el cuello del matraz. Manipule el matraz de vidrio solo desde la parte inferior, no lo toque desde el cuello, una vez que la lámina esté apagada. Utilice una pipeta serológica de 1 ml para tomar una muestra para el recuento celular.
4. No deje que los medios goteen por el costado de los matraces ; si lo hace, rocíe una toalla de papel con 70% de EtOH y límpiela de inmediato.
5. Asegúrese de que las tapas y el papel de aluminio estén apretados antes de retirar las botellas o frascos de los gabinetes de seguridad biológica.

6. Incubación celular

1. Utilice incubadoras separadas para diferentes tipos de células para evitar la contaminación cruzada de los diferentes tipos de células.

7. Recogida de residuos líquidos

1. Recoger los residuos líquidos en un matraz trampa de vacío situado fuera del armario en el suelo en un recipiente secundario etiquetado como «Residuos».
   NOTA: La manguera está conectada a un filtro absorbente de partículas de alta eficiencia (HEPA), que se reemplaza mensualmente.

8. Limpieza

1. Retire la bolsa de residuos de riesgo biológico y lave los frascos de vidrio lo antes posible. Mantenga un protocolo de lavado de vidrio junto al fregadero. Consulte el archivo complementario 1 para conocer el protocolo de lavado.
2. Autoclave la cristalería de cultivo celular en lugar de enviarla a una instalación de lavado de vidrio. Manténgalo separado de la cristalería en el área principal del laboratorio.
   NOTA: Las células SF-9 dejan un borde de células muertas en el lado de los matraces si el vidrio no se frota bien. Consulte Archivo complementario 1 para el protocolo de autoclave.

9. Organización

1. Organice la sala de cultivo celular para que todos los suministros estén ubicados en un área, minimizando así la necesidad de que los miembros del laboratorio salgan de la sala en busca de suministros.
2. Etiquete cualquier botella de plástico utilizada para cosechar células y reutilizada en cultivo celular después como "Solo para uso de cultivo celular". Utilice los frascos de cultivo celular designados para un tipo de célula específico. Guarde las botellas en la sala de cultivo celular para facilitar el acceso.

10. Identificación de bacterias, hongos y contaminación por micoplasma

NOTA: No seguir el flujo de trabajo anterior puede provocar contaminación bacteriana, por hongos y micoplasma.

1. Siempre antes de comenzar a trabajar, observe los frascos para detectar turbidez pesada, crecimiento adicional en forma de bolas borrosas y acumulaciones densas de células en el costado, todos los cuales son indicadores de contaminación.
   NOTA: Un ojo experimentado puede diferenciar entre la turbidez causada por la contaminación microbiana y las células reales. Mientras que las células hacen que los medios normalmente claros aparezcan turbios, la contaminación bacteriana causa una gran turbidez con color blanco.
   1. Identifique visualmente la contaminación por moho observando la aparición de bolas redondas y borrosas flotando en los medios (consulte la Figura 2).
   2. Identifique visualmente la contaminación bacteriana si el medio está turbio, blanco o turbulento (ver Figura 2).
   3. Identifique la contaminación por micoplasma haciendo una prueba mensual de micoplasma. Una prueba basada en PCR indica a los usuarios que tomen una muestra de células de 1,5 ml, realicen un recuento de células utilizando 10 μL, diluyan a 0,08 x 10⁶ células/ml, disminuyan las células, lisen las células utilizando el tampón contenido en el kit y giren una última vez. El sobrenadante se incuba con cebadores que amplifican una variedad de especies de micoplasma. Ejecute un gel de ADN para visualizar las bandas. Sin bandas significa que el micoplasma no está identificado.
      NOTA: Este contaminante importante puede estar presente en la boca humana. Es una buena práctica probar la contaminación por micoplasma en las células después de descongelarlas y antes de usarlas para experimentos. Después, controle las células para detectar contaminación por micoplasma una vez al mes. Muchas compañías ofrecen kits de prueba de micoplasma. Elija uno que sea adecuado.

Resultados

Si no se siguen las técnicas y prácticas adecuadas de cultivo celular descritas en este documento, puede ocurrir contaminación por hongos y bacterias en el laboratorio de cultivo celular de investigación. La figura 2 muestra matraces que contienen contaminación tanto en la suspensión como en los cultivos adherentes.

Cuando no se siguen técnicas asépticas, la contaminación por moho puede ocurrir 2-3 días después. Las bolas redondas y difusas que flotan e...

Discusión

Si bien la contaminación es una de las principales preocupaciones al realizar trabajos de cultivo celular, las prácticas y técnicas descritas en este manuscrito ayudarán a mitigar los riesgos. Los pasos críticos incluyen usar una bata de laboratorio limpia, que solo se usa en la sala de cultivo celular, usar guantes limpios y sin polvo que se rocían con 70% de EtOH a menudo y que se cambian al cambiar entre líneas celulares, alentar a cada individuo a no compartir botellas de medios, limpiar el gabinete a fondo an...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS	Gibco	14-190-144
DMEM F-12 Media	ATCC	30-2006
Glass Baffled Flask	Pyrex	09-552-40
Glass Pipettes	Fisher	13-678-6B
Pipette Aid	Drummond	13-681-15A
Serological Pipette	Corning	07-200-573
T75 flask	Corning	07-202-004
Trypsin	Gibco	25-300-054
*Items may vary because this video is about general cell culture techniques