Técnicas e práticas de cultura celular para evitar a contaminação por fungos e bactérias no laboratório de cultura de células de pesquisa

Resumo

Este protocolo apresenta técnicas e práticas essenciais de cultura de células a serem utilizadas no laboratório de cultura de células de pesquisa para evitar a contaminação por fungos e bactérias. Dentro da categoria de bactérias, será dada ênfase especial à prevenção da contaminação por micoplasmas.

Resumo

A cultura de células é uma habilidade delicada necessária para o crescimento de células humanas, animais e de insetos, ou outros tecidos, em um ambiente controlado. O objetivo do protocolo é enfatizar as técnicas corretas utilizadas em um laboratório de pesquisa para evitar a contaminação por fungos e bactérias. Ênfase especial é dada à prevenção da contaminação por micoplasma, uma grande preocupação na sala de cultura celular devido ao seu pequeno tamanho e resistência à maioria dos antibióticos usados para cultura celular. Essas mesmas técnicas garantem o crescimento contínuo e mantêm as células saudáveis. Para usuários de cultura de células novos e experientes, é importante aderir consistentemente a essas práticas recomendadas para mitigar o risco de contaminação. Uma vez por ano, os laboratórios devem rever as melhores práticas de cultura celular e fazer o acompanhamento com uma discussão ou treinamento adicional, se necessário. Tomar medidas precoces para evitar a contaminação em primeiro lugar economizará tempo e dinheiro, em comparação com a limpeza após a contaminação ocorrer. As melhores práticas universais mantêm as culturas de células saudáveis, reduzindo assim a necessidade de descongelar constantemente novas células, comprar meios de cultura de células caros e reduzir a quantidade de descontaminação e tempo de inatividade da incubadora.

Introdução

A cultura de células tem muitos usos no laboratório de pesquisa. Desde as origens da cultura de células no início do século 20, as linhagens celulares ajudaram a avançar a ciência. As linhagens celulares têm várias vantagens; Várias linhagens celulares podem ajudar os pesquisadores a estudar a biologia celular, produzir baculovírus para estudos posteriores ou produzir grandes quantidades de uma proteína de interesse, para citar alguns¹. Alguns usos adicionais incluem o estudo do crescimento tecidual, ajudando a avançar o desenvolvimento de vacinas, a pesquisa toxicológica, o estudo do papel de genes em organismos saudáveis e modelos doentes, e a produção de linhagens celulares híbridas ^2,3. As linhagens celulares também podem possibilitar a produção de fármacos³. Técnicas assépticas adequadas são necessárias ao trabalhar com linhagens celulares; As práticas e técnicas descritas neste manuscrito são aplicáveis aos laboratórios de pesquisa onde o trabalho de cultura celular é realizado. Outros cenários laboratoriais não são discutidos.

A contaminação é muitas vezes a principal preocupação ao realizar o trabalho de cultura celular. No contexto deste artigo, a contaminação geralmente se refere a fungos e bactérias. O objetivo geral do método descrito neste artigo é descrever detalhadamente as melhores práticas para evitar a contaminação. Todos os membros do laboratório devem aderir a essas práticas ao trabalhar na sala de cultura celular de um laboratório de pesquisa. Os laboratórios devem garantir que todos os trabalhadores participem ativamente no uso dessas melhores práticas para evitar a contaminação. O conhecimento das práticas e técnicas corretas ajudará a garantir que as culturas de células permaneçam viáveis, saudáveis e livres de contaminação. O desenvolvimento dessa técnica é baseado em pesquisas da literatura, sete anos de experiência trabalhando com culturas de células e a necessidade de um método ao qual tanto novatos quanto experientes em cultura de células possam se referir anualmente.

Há necessidade de uma técnica clara e padronizada que todos os laboratórios de cultura de células de pesquisa devem seguir. Grande parte da literatura sobre contaminação em cultura celular discute a detecção de micoplasma, técnicas assépticas, fontes de contaminação, eliminação de contaminantes, prevenção por meio de antibióticos e testes regulares 4,5,6,7,8. Embora essas informações sejam úteis, não há vídeos presentes na literatura que demonstrem as técnicas adequadas de cultura celular que se deve seguir. A vantagem das práticas apresentadas sobre as técnicas alternativas é o foco na prevenção da contaminação antes que ela aconteça, em vez de detectar e corrigir erros posteriormente. Além disso, uma demonstração completa de técnicas assépticas, uma discussão sobre a prevenção do crescimento de fungos e bactérias e informações sobre o fluxo de ar do gabinete de biossegurança são valiosas tanto para trabalhadores iniciantes quanto experientes em cultura de células.

Bactérias e fungos são os dois tipos mais comuns de contaminantes. Dentro da categoria de bactérias, o micoplasma é uma grande preocupação devido ao seu pequeno tamanho e capacidade de proliferar enquanto permanece despercebido. São organismos auto-replicantes, sem parede celular rígida, que dependem de células eucarióticas para crescer. Apresentam capacidades metabólicas reduzidas e podem se multiplicar muito, permanecendo não reconhecidos na inspeção visual rotineira de culturas de células e análises microscópicas regulares, embora a microscopia eletrônica de transmissão possa detectar^{micoplasma9,10}. Além disso, podem passar através de filtros microbiológicos¹⁰. O meio de cultura celular fornece nutrientes ao micoplasma, embora, infelizmente, a suplementação do meio com antibióticos não afete o^micoplasma10. Deve-se notar que, em geral, não é necessário suplementar os meios com antibióticos; Técnicas adequadas devem ser suficientes para manter a contaminação afastada. A infecção por micoplasma não leva à morte celular imediata, mas é preocupante para os pesquisadores, pois afeta a reprodutibilidade e a qualidade dos dados.

Todo o pessoal do laboratório deve aderir estritamente às boas práticas de cultura celular. As culturas devem ser testadas para micoplasma após a compra recente, enquanto estão sendo cultivadas, antes da criopreserva e quando descongeladas a partir de nitrogênio líquido ^2,10. Diferentes testes estão disponíveis no mercado usando reação em cadeia da polimerase (PCR), ensaio imunoenzimático (ELISA) ou imunomarcação. ³ A literatura indica que "isolados humanos representam uma grande porcentagem dos contaminantes de micoplasma encontrados em cultura celular"⁵. Embora mais de 200 espécies de micoplasma tenham sido descritas, cerca de seis delas são responsáveis pela maioria das infecções. Essas seis espécies são M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale e Acholeplasma laidlawii¹⁰. Assim como outros tipos de contaminação, o ar e os aerossóis os trazem para as culturas celulares⁵. Isso encontra eco em outros trabalhos, uma vez que o "operador humano é potencialmente o maior perigo em laboratório"⁷. Embora isso seja feito através de erro humano, o risco pode ser eliminado se um procedimento padrão for seguido. A eliminação de pessoal não se restringe apenas à contaminação por micoplasma; Culturas de células em um laboratório geralmente estão infectadas com a mesma espécie de micoplasma, indicando que a contaminação se espalha de um frasco para outro devido a técnicas inadequadas de cultura celular¹⁰.

A prevenção da contaminação cruzada também é outra razão pela qual técnicas adequadas de cultura celular devem ser seguidas. Observa-se que pelo menos 15%–18% das linhagens celulares no mundo podem estar contaminadas ou mal identificadas^11,12. Além de testar linhagens celulares para contaminação por micoplasma, elas também devem ser testadas para contaminação cruzada¹⁰. Para linhagens celulares humanas, a autenticação de linhagens celulares por uma técnica barata baseada em DNA chamada short tandem repeat (STR) profiling é o padrão de referência internacional atual, pois é uma maneira fácil de confirmar a identidade da linhagem celular 2,10,13,14. A RTS pode identificar linhagens celulares marcadas incorretamente ou contaminadas cruzadamente, mas não pode detectar origem tecidual incorreta^10,13,14. A validade dos dados de pesquisa pode ser comprometida se linhagens celulares forem rotuladas incorretamente, identificadas erroneamente ou contaminadas¹³. Assim como outros tipos de contaminação, a contaminação cruzada pode ocorrer devido à má técnica que provoca a disseminação de aerossóis, ao contato equivocado que leva à entrada do tipo de célula errado em um frasco, ou ao uso do mesmo frasco e reagentes com linhagens celulares diferentes¹⁰. Não deve ocorrer compartilhamento de garrafas de mídia; O compartilhamento de um frasco de mídia entre duas linhagens celulares diferentes pode permitir que essas populações de células sejam misturadas, levando o tipo de célula de crescimento mais rápido a assumir completamente o frasco. Essa substituição não é perceptível e leva a erros de rotulagem e identificação². Uma linhagem celular também pode ser confundida com outra se as culturas forem confundidas durante o manuseio ou marcação¹⁰. Deve-se prestar muita atenção para manter reagentes, meios e frascos separados uns dos outros. Cada membro do laboratório deve ter seus próprios frascos de mídia; Nenhum compartilhamento deve ocorrer entre os membros do laboratório. As próprias linhas celulares devem ser compradas de um banco de células qualificado e provedor. Os laboratórios não devem compartilhar células. Estudos mostram que, embora os testes de STR e micoplasma sejam regularmente utilizados, muitos trabalhos de pesquisa na literatura já utilizaram linhagens celulares mal identificadas ou^{contaminadas15}. Examinar a pesquisa para encontrar esses artigos problemáticos e informar retroativamente os leitores sobre esse assunto é complicado. A prevenção é a melhor maneira de garantir que esse problema não ocorra em primeiro lugar.

A simples ação de pulverizar itens com 70% de EtOH pode matar organismos; A EtOH a 70% atua desnaturando proteínas e dissolvendo lipídios nos organismos mais comumente contaminantes, incluindo bactérias e fungos¹⁶. Estudos têm mostrado que 70% é a concentração mais eficaz; As proteínas de superfície não coagulam rapidamente com 70% de EtOH para que possam entrar na célula, enquanto a água que contém é necessária para o processo de desnaturação das proteínas. Devido à diferença de concentração de água e álcool em ambos os lados da parede celular, 70% de EtOH entra na célula para desnaturar proteínas enzimáticas e estruturais. Se o crescimento de mofo for observado nos frascos, toda a incubadora deve ser descontaminada pulverizando-a primeiro com EtOH 70% e limpando-a, seguida de uma incubação noturna de 16 h a 60 °C¹⁷. Isso mata a maioria dos mofos e quaisquer bactérias.

A principal vantagem das práticas de prevenção sobre as técnicas alternativas de eliminação da contaminação após sua ocorrência é que, prevenindo a contaminação precocemente, os trabalhadores de laboratório podem ter certeza de que suas culturas de células estão saudáveis e não haverá altos custos associados à descontaminação de incubadoras ou ao descarte de culturas celulares. A eliminação de contaminantes de micoplasma após, por exemplo, não ser eficiente⁷. Dedicar tempo desde o início para garantir que o pessoal do laboratório seja devidamente treinado, a sala de cultura de células seja autocontida e um procedimento padrão seja usado economizará tempo e dinheiro.

Protocolo

1. Preparações

1. Geral
   1. Use um jaleco limpo designado para ser usado apenas na sala de cultura de células e nenhuma outra parte do laboratório.
      NOTA: O jaleco não precisa ser estéril.
   2. Use luvas novas que não tenham tocado em nenhuma outra superfície. Certifique-se de que as luvas se encaixam bem. Luvas sem nitrilo e sem pó são as melhores.
      NOTA: As luvas não precisam ser estéreis.
   3. Para se preparar para o trabalho, borrife as luvas, as mangas do jaleco e o interior do armário de segurança biológica com 70% de EtOH. Limpe a superfície de trabalho e o painel de vidro com uma toalha de papel sem fiapos.
      OBS: O uso de 70% de EtOH mata bactérias com a mais alta eficiência¹⁶. O papel toalha não precisa ser estéril.
   4. Mantenha banhos de água dentro da sala de cultura de células e use-os apenas para aquecer meios de cultura ou descongelar células. Escorra e lave os banhos-maria uma vez por semana, seguindo as instruções de limpeza do fabricante.
2. Dentro do armário de segurança biológica
   1. Limite o número de itens trazidos para o gabinete. Não interrompa o fluxo de ar dentro do armário de segurança biológica bloqueando as grades dianteiras ou traseiras.
      NOTA: Consulte a Figura 1 para obter uma explicação de como o ar flui dentro de um gabinete.
   2. Borrife todos os itens colocados dentro do armário com 70% de EtOH e limpe-os secos. Comece borrifando a parte superior da garrafa de mídia e trabalhando para baixo. Da mesma forma, com uma toalha de papel limpa, limpe-a secamente, trabalhando progressivamente o caminho até o fundo. Não volte para cima em direção à tampa.
   3. Se o armário for grande o suficiente para acomodar pipetas sorológicas, elas podem ser colocadas no interior, caso contrário, podem ser armazenadas em um recipiente montado na parte externa do armário. Verifique se há furos, rasgos ou perfurações na embalagem em ambos os lados da pipeta antes de usar. Não rasgue o embrulho. Em vez disso, descasque suavemente as extremidades do invólucro, insira a pipeta sorológica em um auxiliar de pipeta e remova o invólucro em um movimento fluido.
   4. Não passe o mouse sobre garrafas ou frascos abertos; alcance sobre garrafas ou frascos abertos, ou itens abertos sobre as partes superiores de itens já abertos no armário de segurança biológica.
      NOTA: O fluxo de ar dentro do gabinete empurra para baixo na superfície de trabalho, de modo que qualquer contaminação presente na manga, por exemplo, pode entrar nas culturas celulares.
   5. Não despeje líquidos. Em vez disso, adicione-os usando uma pipeta sorológica. Depois de suplementar o meio, misture bem o conteúdo e inicie o frasco. Além disso, certifique-se de incluir um rótulo para o que a mídia foi complementada com.

2. Trabalhando com linhagens celulares aderentes

1. Se for necessário um frasco plástico, borrife todo o saco e coloque-o dentro do armário.
2. Use pipetas de vidro autoclavadas ou pipetas plásticas estéreis descartáveis para aspirar o meio ou as soluções de lavagem. Retire cuidadosamente a tampa metálica do recipiente de armazenamento. Isole uma pipeta de vidro agitando suavemente o recipiente em um ângulo. Ao entrar no recipiente, evite tocar em outras pipetas.
   NOTA: Manuseie a pipeta escolhida a partir de apenas uma extremidade.
3. Substitua rapidamente as tampas dos frascos o mais rápido possível. Coloque as tampas na superfície de trabalho de cabeça para baixo para que o aro não toque na superfície de trabalho. Não pegue a tampa de cima ou de baixo; em vez disso, toque nas tampas pelas laterais.
4. Ao aspirar líquidos, use um frasco de armadilha de vácuo localizado fora do gabinete em um recipiente secundário no chão.
   NOTA: Não jogue nenhum resíduo líquido em sacos de lixo de risco biológico, pois os sacos vazarão. Os resíduos serão criados enquanto se trabalha dentro do gabinete. Mover as mãos para dentro e para fora do gabinete com muita frequência interromperá o fluxo de ar. Deixe qualquer resíduo dentro do armário temporariamente. Coloque-o ao lado para que não interrompa o trabalho.
5. Borrife generosamente as luvas com EtOH 70% sempre que ficarem secas. Esfregue as mãos juntas para que as luvas não fiquem molhadas.
6. Se uma pipeta sorológica tocar por engano em algo no armário, não hesite em jogá-la fora. Comece de novo com uma pipeta sorológica limpa em vez de usar uma que possa estar contaminada.

4. Verificação e armazenamento de células

1. Antes de colocar as células na incubadora, verifique como elas ficam sob o microscópio. Se as células tiverem sido completamente suspensas, células únicas devem ser observadas.
2. Não fale, espirre, tosse ou respire muito nas incubadoras. Abra e feche rapidamente as portas da incubadora. Deixar as portas abertas por mais tempo do que o necessário pode permitir que contaminantes presentes no ar entrem nas incubadoras.
   NOTA: Usar uma máscara enquanto trabalha na sala de cultura de células pode ajudar, uma vez que o micoplasma pode estar presente na boca humana. Evite o uso de celulares na sala de cultura celular, pois falar não é recomendado.
3. Certifique-se de que as tampas de todas as garrafas estejam bem fechadas antes de removê-las do armário.
4. Conservar os meios de cultura celular no escuro a 4 °C quando não estiverem a ser utilizados, uma vez que são sensíveis à luz.
5. Borrife o interior do gabinete com EtOH 70% novamente após o término do trabalho de cultura celular e limpe a superfície com um papel toalha. Esvazie os sacos de lixo de risco biológico. Repita esse processo e substitua as luvas ao mudar para uma linha celular diferente.

5. Trabalhando com linhas de células de suspensão

1. Para células de suspensão cultivadas em frascos de vidro, certifique-se de que as luvas sejam pulverizadas completamente com EtOH a 70%, depois toque a folha de alumínio com as luvas molhadas e borrife apenas o fundo do frasco antes de colocá-lo dentro do armário.
2. Ao colher uma amostra para contagem celular, remova apenas um tubo de 1,5 mL de seu recipiente. Não toque em nenhum outro tubo. Coloque a tampa de cabeça para baixo na superfície de trabalho. Não toque no aro interno. Manuseie-o com cuidado pelas laterais e substitua-o depois de terminado.
3. Retire cuidadosamente a peça dobrada duplamente de papel alumínio que cobre todo o gargalo do frasco. Manuseie o frasco de vidro apenas a partir do fundo — não o toque a partir do pescoço — uma vez que o papel alumínio esteja desligado. Use uma pipeta sorológica de 1 mL para coletar uma amostra para contagem celular.
4. Não deixe o meio escorrer pela lateral dos frascos; se isso acontecer, borrife um papel toalha com 70% de EtOH e limpe-o imediatamente.
5. Certifique-se de que as tampas e a folha de alumínio estejam apertadas antes de remover garrafas ou frascos dos armários de segurança biológica.

6. Incubação celular

1. Use incubadoras separadas para diferentes tipos de células para evitar a contaminação cruzada dos diferentes tipos celulares.

7. Coleta de resíduos líquidos

1. Recolher resíduos líquidos num frasco de armadilha de vácuo localizado fora do armário, no chão, num recipiente secundário rotulado como "Resíduos".
   NOTA: A mangueira é conectada a um filtro de absorção de partículas de alta eficiência (HEPA), que é substituído mensalmente.

8. Limpeza

1. Retire o saco de resíduos de risco biológico e lave os frascos de vidro o mais rapidamente possível. Mantenha um protocolo de lavagem de vidros junto à pia. Consulte Arquivo Suplementar 1 para o protocolo de lavagem.
2. Autoclave o vidro de cultura celular em vez de enviá-lo para uma instalação de lavagem de vidro. Mantenha-o separado dos utensílios de vidro na área principal do laboratório.
   NOTA: As células SF-9 deixam uma borda de células mortas na lateral dos frascos se o vidro não for bem esfregado. Consulte Arquivo Suplementar 1 para o protocolo de autoclave.

9. Organização

1. Organizar a sala de cultura celular de forma que todos os insumos estejam localizados em uma área, minimizando assim a necessidade de os membros do laboratório saírem da sala em busca de insumos.
2. Rotule quaisquer garrafas de plástico usadas para colher células e reutilizadas em cultura de células posteriormente como "Somente para uso em cultura celular". Use os frascos de cultura celular designados para um tipo de célula específico. Guarde os frascos na sala de cultura celular para facilitar o acesso.

10. Identificação de contaminação por bactérias, fungos e micoplasma

NOTA: Não seguir o fluxo de trabalho acima pode levar à contaminação por bactérias, fungos e micoplasmas.

1. Sempre antes de iniciar o trabalho, observe os frascos para turbidez pesada, crescimento extra na forma de bolas difusas e acúmulos densos de células na lateral, todos os quais são indicadores de contaminação.
   NOTA: Um olho experiente pode dizer a diferença entre a turbidez causada pela contaminação microbiana versus as células reais. Enquanto as células fazem com que o meio normalmente claro pareça turvo, a contaminação bacteriana causa turbidez pesada com a cor branca.
   1. Identifique visualmente a contaminação por mofo observando a aparência de bolas redondas e difusas flutuando na mídia (veja a Figura 2).
   2. Identifique visualmente a contaminação bacteriana se o meio estiver turvo, branco ou turbulento (ver Figura 2).
   3. Identificar a contaminação por micoplasma fazendo um teste mensal de micoplasma. Um teste baseado em PCR instrui os usuários a pegar uma amostra de 1,5 mL de células, realizar uma contagem de células usando 10 μL, diluir para 0,08 x 10⁶ células/mL, girar as células, lisar as células usando o tampão contido no kit e girar uma última vez. O sobrenadante é incubado com primers que amplificam uma variedade de espécies de micoplasmas. Execute um gel de DNA para visualizar as bandas. Sem bandas significa que o micoplasma não é identificado.
      NOTA: Este importante contaminante pode estar presente na boca humana. É uma boa prática testar a contaminação por micoplasma nas células após o descongelamento e antes de usá-las para experimentos. Depois, monitorar as células quanto à contaminação por micoplasma uma vez por mês. Muitas empresas oferecem kits de teste de micoplasma. Escolha um que seja adequado.

Resultados

Se as técnicas e práticas adequadas de cultura celular descritas neste trabalho não forem seguidas, a contaminação por fungos e bactérias pode ocorrer no laboratório de cultura de células de pesquisa. A Figura 2 mostra os frascos contendo contaminação tanto na suspensão quanto na cultura aderida.

Quando não segue técnicas assépticas, a contaminação por mofo pode ocorrer de 2 a 3 dias depois. Bolas fuzzy redondas flutuando na mídia são perceptíve...

Discussão

Embora a contaminação seja uma das principais preocupações ao realizar o trabalho de cultura de células, as práticas e técnicas descritas neste manuscrito ajudarão a mitigar os riscos. As etapas críticas incluem o uso de um jaleco limpo, que só é usado na sala de cultura celular, o uso de luvas limpas e sem pó que são pulverizadas com 70% de EtOH com frequência e que são trocadas ao alternar entre linhas celulares, incentivando cada indivíduo a não compartilhar frascos de mídia, limpando o armário cuid...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS	Gibco	14-190-144
DMEM F-12 Media	ATCC	30-2006
Glass Baffled Flask	Pyrex	09-552-40
Glass Pipettes	Fisher	13-678-6B
Pipette Aid	Drummond	13-681-15A
Serological Pipette	Corning	07-200-573
T75 flask	Corning	07-202-004
Trypsin	Gibco	25-300-054
*Items may vary because this video is about general cell culture techniques