Методы и методы культивирования клеток для предотвращения загрязнения грибами и бактериями в исследовательской лаборатории клеточных культур

Резюме

В этом протоколе представлены основные методы и методы культивирования клеток, которые будут использоваться в исследовательской лаборатории клеточных культур, чтобы избежать заражения грибками и бактериями. В категории бактерий особый акцент будет сделан на предотвращении заражения микоплазмами.

Аннотация

Клеточная культура — это тонкий навык, необходимый для выращивания клеток человека, животных и насекомых или других тканей в контролируемой среде. Цель протокола состоит в том, чтобы подчеркнуть правильные методы, используемые в исследовательской лаборатории для предотвращения загрязнения грибками и бактериями. Особое внимание уделяется предотвращению заражения микоплазмой, что является серьезной проблемой в помещении для культивирования клеток из-за его небольшого размера и устойчивости к большинству антибиотиков, используемых для культивирования клеток. Эти же методы обеспечивают непрерывный рост и поддерживают здоровые клетки. Как для новых, так и для опытных пользователей клеточных культур важно последовательно придерживаться этих передовых методов, чтобы снизить риск заражения. Раз в год лаборатории должны проводить обзор передового опыта в области клеточных культур и при необходимости проводить обсуждение или дополнительное обучение. Заблаговременное принятие мер по предотвращению загрязнения в первую очередь сэкономит время и деньги по сравнению с очисткой после загрязнения. Универсальные передовые методы поддерживают здоровье клеточных культур, тем самым уменьшая необходимость постоянного размораживания новых клеток, покупки дорогостоящих сред для клеточных культур и сокращения количества обеззараживания инкубаторов и времени простоя.

Введение

Клеточная культура имеет множество применений в исследовательской лаборатории. С момента возникновения клеточных культур в начале 20-го века клеточные линии помогли продвинуть науку. Клеточные линии имеют ряд преимуществ; Различные клеточные линии могут помочь исследователям изучать клеточную биологию, производить бакуловирус для дальнейших исследований или производить большое количество белка, представляющего интерес, и это лишь некоторые из^них. Некоторые дополнительные виды использования включают изучение роста тканей, помощь в разработке вакцин, токсикологические исследования, изучение роли генов в здоровых организмах и больных моделях, а также производство гибридных клеточных линий ^2,3. Клеточные линии также могут обеспечивать производство лекарств³. При работе с клеточными линиями необходимы правильные асептические методики; Методы и методы, изложенные в этой рукописи, применимы к исследовательским лабораториям, где проводятся работы с клеточными культурами. Другие лабораторные условия не обсуждаются.

Загрязнение часто является основной проблемой при выполнении работы с клеточными культурами. В контексте этой статьи под загрязнением обычно понимаются грибки и бактерии. Общая цель метода, изложенного в этой статье, состоит в том, чтобы подробно описать лучшие практики предотвращения загрязнения. Все члены лаборатории должны придерживаться этих правил при работе в комнате клеточных культур исследовательской лаборатории. Лаборатории должны обеспечить, чтобы все работники были активными участниками использования этих передовых методов для предотвращения загрязнения. Знание правильных практик и методов поможет гарантировать, что клеточные культуры останутся жизнеспособными, здоровыми и свободными от загрязнения. Разработка этого метода основана на изучении литературы, семилетнем опыте работы с клеточными культурами и необходимости метода, к которому могут обращаться как новички, так и опытные работники клеточных культур на ежегодной основе.

Существует потребность в четкой, стандартизированной методике, которой должны следовать все исследовательские лаборатории клеточных культур. Большая часть литературы по загрязнению клеточных культур обсуждает обнаружение микоплазмы, асептические методы, источники загрязнения, устранение загрязняющих веществ и профилактику с помощью антибиотиков и регулярного тестирования 4,5,6,7,8. Хотя эта информация полезна, в литературе нет видеороликов, демонстрирующих правильные методы культивирования клеток, которым следует следовать. Преимущество представленных методов перед альтернативными методами заключается в том, что основное внимание уделяется предотвращению загрязнения до того, как оно произойдет, а не обнаружению и исправлению ошибок позже. Кроме того, тщательная демонстрация асептических методов, обсуждение предотвращения роста грибков и бактерий, а также информация о воздушном потоке шкафа биобезопасности ценны как для начинающих, так и для опытных работников клеточных культур.

Бактерии и грибки являются двумя наиболее распространенными типами загрязняющих веществ. В категории бактерий микоплазма является серьезной проблемой из-за ее небольшого размера и способности размножаться, оставаясь незамеченной. Это самовоспроизводящиеся организмы без жесткой клеточной стенки, рост которых зависит от эукариотических клеток. Они имеют сниженные метаболические возможности и могут сильно размножаться, оставаясь нераспознанными при обычном визуальном осмотре клеточных культур и регулярном микроскопическом анализе, хотя просвечивающая электронная микроскопия может обнаружить микоплазму ^9,10. Более того, они могут проходить через микробиологические фильтры¹⁰. Питательная среда для клеточных культур обеспечивает микоплазму питательными веществами, хотя, к сожалению, добавление антибиотиков не влияет на микоплазму¹⁰. Следует отметить, что, как правило, нет необходимости дополнять среды антибиотиками; Надлежащих методов должно быть достаточно для предотвращения загрязнения. Заражение микоплазмой не приводит к немедленной гибели клеток, но это беспокоит исследователей, поскольку влияет на воспроизводимость и качество данных.

Весь персонал лаборатории должен строго придерживаться надлежащей практики культивирования клеток. Культуры следует проверять на микоплазму после того, как они были недавно приобретены, пока они в настоящее время выращиваются, перед криоконсервацией и при размораживании от жидкого азота ^2,10. На рынке доступны различные тесты, использующие полимеразную цепную реакцию (ПЦР), иммуноферментный анализ (ИФА) или иммуноокрашивание. ³ В литературе указывается, что «человеческие изоляты представляют собой большой процент загрязнителей микоплазмы, обнаруженных в культуре клеток»⁵. Хотя было описано более 200 видов микоплазмы, около шести из них являются причиной большинства инфекций. Этими шестью видами являются M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale и Acholeplasma laidlawii¹⁰. Как и в случае с другими типами загрязнения, воздух и аэрозоли переносят их в клеточные культуры⁵. Это повторяется в других работах, поскольку «человек-оператор потенциально представляет наибольшую опасность в лаборатории»⁷. Хотя это делается из-за человеческой ошибки, риск можно устранить, если следовать стандартной процедуре. Выделение от персонала не ограничивается только заражением микоплазмой; Клеточные культуры в одной лаборатории обычно инфицированы одними и теми же видами микоплазмы, что указывает на то, что загрязнение распространяется от одной колбы к другой из-за неправильных методов культивирования клеток¹⁰.

Предотвращение перекрестного загрязнения также является еще одной причиной, по которой следует следовать правильным методам культивирования клеток. Отмечается, что, по крайней мере, 15–18% клеточных линий во всем мире могут быть перекрестно загрязнены или неправильно идентифицированы^11,12. В дополнение к тестированию клеточных линий на микоплазменное загрязнение, они также должны быть проверены на перекрестную контаминацию¹⁰. Для клеточных линий человека аутентификация клеточных линий с помощью недорогого метода на основе ДНК, называемого профилированием короткого тандемного повтора (STR), является текущим международным эталонным стандартом, поскольку это простой способ подтвердить идентичность клеточной линии 2,10,13,14. STR может идентифицировать неправильно маркированные или перекрестно загрязненные клеточные линии, но он не может обнаружить неправильное происхождение ткани^10,13,14. Достоверность данных исследований может быть поставлена под угрозу, если клеточные линии неправильно маркированы, неправильно идентифицированы или загрязнены¹³. Подобно другим типам загрязнения, перекрестное загрязнение может происходить из-за плохой техники, вызывающей распространение аэрозолей, ошибочного контакта, приводящего к попаданию неправильного типа клеток в колбу, или использования одной и той же бутылки с носителем и реагентов с разными клеточными линиями¹⁰. Совместное использование бутылок с носителями не должно происходить; Совместное использование одной бутылки среды между двумя разными клеточными линиями может позволить этим клеточным популяциям смешиваться, что приводит к тому, что более быстрорастущий тип клеток полностью захватывает колбу. Эта замена не заметна и приводит к неправильной маркировке и неправильной идентификации². Клеточная линия также может быть ошибочно принята за другую, если культуры перепутаны во время обработки или маркировки¹⁰. Особое внимание следует уделять хранению реагентов, сред и колб отдельно друг от друга. У каждого члена лаборатории должны быть свои собственные бутылки-носители; Между членами лаборатории не должно происходить совместное использование. Сами клеточные линии должны быть приобретены у квалифицированного банка клеток и поставщика. Лаборатории не должны делиться клетками. Исследования показывают, что, хотя тесты STR и микоплазмы используются регулярно, во многих исследовательских работах в литературе уже использовались неправильно идентифицированные или загрязненные клеточные линии¹⁵. Просеивание исследований, чтобы найти эти проблемные статьи и задним числом проинформировать читателей об этом вопросе, является громоздким. Профилактика - лучший способ гарантировать, что эта проблема не возникнет в первую очередь.

Простое действие распыления предметов с 70% EtOH может убить организмы; 70% EtOH работает путем денатурации белков и растворения липидов в наиболее часто загрязняющих организмах, включая бактерии и грибы¹⁶. Исследования показали, что 70% является наиболее эффективной концентрацией; поверхностные белки не коагулируют быстро с 70% EtOH, поэтому они могут проникнуть в клетку, в то время как содержащаяся в них вода необходима для процесса денатурации белков. Из-за разницы в концентрациях воды и спирта по обе стороны клеточной стенки 70% EtOH поступает в клетку для денатурации как ферментативных, так и структурных белков. Если в колбах наблюдается рост плесени, весь инкубатор необходимо обеззаразить, сначала опрыскав его 70% EtOH и вытерев насухо, а затем 16-часовую ночную инкубацию при 60 ° C¹⁷. Это убивает большую часть плесени и любых бактерий.

Основное преимущество профилактических практик по сравнению с альтернативными методами устранения загрязнения после его возникновения заключается в том, что, предотвращая загрязнение на ранней стадии, лабораторные работники могут быть уверены, что их клеточные культуры здоровы и не будет высоких затрат, связанных с обеззараживанием инкубаторов или выбрасыванием клеточных культур. Удаление микоплазменных загрязнителей, например, после, не является эффективным⁷. Если вы потратите время на то, чтобы убедиться, что лабораторный персонал должным образом обучен, комната для культивирования клеток автономна, а стандартная процедура используется, это сэкономит время и деньги.

протокол

1. Подготовка

1. Общее
   1. Носите чистый лабораторный халат, предназначенный для ношения только в комнате клеточных культур и ни в каких других частях лаборатории.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лабораторный халат не обязательно должен быть стерильным.
   2. Наденьте новые перчатки, которые не касались других поверхностей. Убедитесь, что перчатки плотно прилегают. Лучше всего подойдут нитриловые, неопудренные перчатки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перчатки не обязательно должны быть стерильными.
   3. Чтобы подготовиться к работе, опрыскайте перчатки, рукава лабораторного халата и внутреннюю часть шкафа биологической безопасности 70% EtOH. Рабочую поверхность и стеклянную панель насухо протрите безворсовым бумажным полотенцем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 70% EtOH убивает бактерии с высочайшей эффективностью¹⁶. Бумажное полотенце не обязательно должно быть стерильным.
   4. Держите водяные бани в помещении для клеточных культур и используйте их только для нагрева питательных сред или размораживания клеток. Сливайте воду и мойте водяные бани один раз в неделю, следуя инструкциям производителя по очистке.
2. Внутри шкафа биологической безопасности
   1. Ограничьте количество предметов, вносимых в шкаф. Не прерывайте поток воздуха внутри шкафа биологической безопасности, блокируя переднюю или заднюю решетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 1 для объяснения того, как воздух течет внутри шкафа.
   2. Опрыскайте все предметы, помещенные внутри шкафа, 70% EtOH и вытрите их насухо. Начните с распыления на верхнюю часть флакона носителя и двигайтесь вниз. Точно так же чистым бумажным полотенцем вытрите его насухо, постепенно продвигаясь ко дну. Не поднимайтесь обратно к крышке.
   3. Если шкаф достаточно велик для размещения серологических пипеток, их можно поместить внутрь, в противном случае их можно хранить в емкости, установленной снаружи шкафа. Перед использованием проверьте обе стороны закрытой пипетки на наличие отверстий, разрывов или проколов в упаковке. Не срывать обертку. Вместо этого аккуратно снимите концы упаковки, вставьте серологическую пипетку в пипетку и снимите обертку одним жидким движением.
   4. Не нависайте над открытыми бутылками или колбами; Протяните руку над открытыми бутылками или колбами или откройте предметы поверх уже открытых предметов в шкафу биологической безопасности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Воздушный поток внутри шкафа давит на рабочую поверхность, поэтому любое загрязнение, присутствующее, например, на рукаве, может попасть в клеточные культуры.
   5. Не наливайте жидкости. Вместо этого добавьте их с помощью серологической пипетки. После добавления среды тщательно перемешайте содержимое и инициируйте флакон. Кроме того, не забудьте включить метку для того, чем был дополнен носитель.

2. Работа с адгезивными клеточными линиями

1. Если нужна пластиковая колба, опрыскайте весь пакет и поместите его внутрь шкафа.
2. Используйте автоклавные стеклянные пипетки или одноразовые стерильные пластиковые пипетки для аспирации среды или моющих растворов. Осторожно снимите металлический колпачок с контейнера для хранения. Изолируйте одну стеклянную пипетку, осторожно встряхнув емкость под углом. Залезая в контейнер, не прикасайтесь к другим пипеткам.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте выбранную пипетку только с одного конца.
3. Быстро замените крышки на бутылках как можно скорее. Поместите колпачки на рабочую поверхность вверх дном так, чтобы ободок не касался рабочей поверхности. Не хватайтесь за колпачок сверху или снизу; Вместо этого прикоснитесь к колпачкам с боков.
4. При аспирации жидкостей используйте колбу-ловушку, расположенную снаружи шкафа во вторичном контейнере на полу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не выбрасывайте жидкие отходы в мешки для биологически опасных отходов, так как пакеты могут протекать. Отходы будут создаваться во время работы внутри шкафа. Слишком частое перемещение рук внутрь и наружу шкафа прервет поток воздуха. Временно оставьте все отходы внутри шкафа. Отложите его в сторону, чтобы он не прерывал работу.
5. Обильно сбрызгивайте перчатки 70% EtOH каждый раз, когда они высыхают. Потрите руки друг о друга, чтобы перчатки не промокли.
6. Если серологическая пипетка по ошибке задела что-то в шкафу, не стесняйтесь выбросить ее. Начните заново с чистой серологической пипетки вместо того, чтобы использовать ту, которая может быть загрязнена.

4. Проверка и хранение ячеек

1. Перед помещением клеток в инкубатор проверьте, как они выглядят под микроскопом. Если клетки были тщательно подвешены, следует наблюдать за отдельными клетками.
2. Не говорите, не чихайте, не кашляйте и не дышите тяжело в инкубаторы. Быстро открывайте и закрывайте дверцы инкубатора. Если оставить двери открытыми дольше, чем необходимо, это может привести к попаданию загрязняющих веществ, присутствующих в воздухе, в инкубаторы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ношение маски во время работы в комнате клеточных культур может помочь, поскольку микоплазма может присутствовать во рту человека. Избегайте использования сотовых телефонов в комнате клеточной культуры, так как разговаривать не рекомендуется.
3. Убедитесь, что крышки на всех бутылках плотно закрыты, прежде чем вынимать бутылки из шкафа.
4. Храните среду для культивирования клеток в темноте при температуре 4 ° C, когда она не используется, так как она чувствительна к свету.
5. После завершения работы по культивированию клеток снова опрыскайте внутреннюю часть шкафа 70% EtOH и вытрите поверхность насухо бумажным полотенцем. Опорожните мешки для биологически опасных отходов. Повторите этот процесс и замените перчатки при переходе на другую клеточную линию.

5. Работа с суспензионными клеточными линиями

1. Для суспензионных ячеек, выращенных в стеклянных колбах, убедитесь, что перчатки тщательно опрысканы 70% EtOH, затем прикоснитесь к алюминиевой фольге влажными перчатками и опрыскайте только дно колбы, прежде чем помещать ее внутрь шкафа.
2. При взятии образца для подсчета клеток извлеките из контейнера только одну пробирку объемом 1,5 мл. Не прикасайтесь к другим трубкам. Поместите колпачок вверх дном на рабочую поверхность. Не прикасайтесь к внутреннему ободу. Обращайтесь с ним осторожно с боков и замените его после завершения.
3. Осторожно снимите сложенный вдвое кусок алюминиевой фольги, который покрывает все горлышко колбы. Прикасайтесь к стеклянной колбе только снизу - не прикасайтесь к ней с горлышка - после того, как фольга снята. Используйте серологическую пипетку объемом 1 мл, чтобы взять образец для подсчета клеток.
4. Не допускайте стекания носителя по стенкам колб; если это так, сбрызните бумажное полотенце 70% EtOH и сразу же очистите его.
5. Убедитесь, что крышки и алюминиевая фольга затянуты, прежде чем вынимать бутылки или колбы из шкафов биологической безопасности.

6. Клеточная инкубация

1. Используйте отдельные инкубаторы для разных типов клеток, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение разных типов клеток.

7. Сбор жидких отходов

1. Соберите жидкие отходы в колбу вакуумной ловушки, расположенную снаружи шкафа на полу, во вторичном контейнере с надписью «Отходы».
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шланг подключен к высокоэффективному фильтру поглощения твердых частиц (HEPA), который заменяется ежемесячно.

8. Очистка

1. Извлеките пакет для биологически опасных отходов и как можно скорее вымойте стеклянные колбы. Соблюдайте протокол мытья стекол у раковины. Протокол стирки см. в дополнительном файле 1 .
2. Автоклавировать стеклянную посуду для клеточных культур вместо того, чтобы отправлять ее на мойку стекла. Храните его отдельно от стеклянной посуды в основной зоне лаборатории.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки SF-9 оставляют ободок мертвых клеток на боковой стороне колб, если стекло не вычищено должным образом. Протокол автоклава см. в дополнительном файле 1 .

9. Организационная структура

1. Организуйте комнату клеточных культур так, чтобы все расходные материалы располагались в одной зоне, тем самым сведя к минимуму необходимость для сотрудников лаборатории покидать комнату в поисках расходных материалов.
2. Маркируйте любые пластиковые бутылки, используемые для сбора клеток и повторно используемые в клеточных культурах впоследствии, как «Только для использования в клеточных культурах». Используйте специальные флаконы для клеточных культур для одного конкретного типа клеток. Храните флаконы в помещении для культивирования клеток для легкого доступа.

10. Идентификация бактерий, грибков и микоплазменного загрязнения

ПРИМЕЧАНИЕ: Несоблюдение описанного выше рабочего процесса может привести к заражению бактериями, грибками и микоплазмами.

1. Всегда перед началом работы наблюдайте за колбами на предмет сильного помутнения, дополнительного роста в виде нечетких шариков и плотных скоплений клеток сбоку, которые являются индикаторами загрязнения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Опытный глаз может определить разницу между мутностью, вызванной микробным загрязнением, и фактическими клетками. В то время как клетки приводят к тому, что обычно прозрачная среда кажется мутной, бактериальное загрязнение вызывает сильное помутнение с белым цветом.
   1. Визуально определите загрязнение плесенью, отметив появление круглых нечетких шариков, плавающих в среде (см. рис. 2).
   2. Визуально определите бактериальное загрязнение, если среда мутная, белая или турбулентная (см. рис. 2).
   3. Определите загрязнение микоплазмой, проводя ежемесячный тест на микоплазму. Один тест на основе ПЦР инструктирует пользователей взять образец клеток объемом 1,5 мл, выполнить подсчет клеток с использованием 10 мкл, разбавить до 0,08 x 10⁶ клеток / мл, раскрутить клетки, лизировать клетки с помощью буфера, содержащегося в наборе, и открутить вниз в последний раз. Надосадочную жидкость инкубируют с праймерами, которые усиливают ряд видов микоплазмы. Запустите гель ДНК, чтобы визуализировать полосы. Отсутствие полос означает, что микоплазма не идентифицирована.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот основной загрязнитель может присутствовать во рту человека. Хорошей практикой является тестирование на загрязнение микоплазмой клеток после их размораживания и перед использованием в экспериментах. После этого контролируйте клетки на предмет загрязнения микоплазмой один раз в месяц. Многие компании предлагают наборы для тестирования микоплазмы. Выберите тот, который подходит.

Результаты

Если не следовать надлежащим методам и практикам культивирования клеток, изложенным в этой статье, в исследовательской лаборатории клеточных культур может произойти заражение грибами и бактериями. На рисунке 2 показаны колбы, содержащие загрязнение как в суспензии, та...

Обсуждение

В то время как загрязнение является одной из основных проблем при выполнении работы с клеточными культурами, методы и методы, изложенные в этой рукописи, помогут снизить риски. Критические шаги включают в себя ношение чистого лабораторного халата, который используется только в комнате...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS	Gibco	14-190-144
DMEM F-12 Media	ATCC	30-2006
Glass Baffled Flask	Pyrex	09-552-40
Glass Pipettes	Fisher	13-678-6B
Pipette Aid	Drummond	13-681-15A
Serological Pipette	Corning	07-200-573
T75 flask	Corning	07-202-004
Trypsin	Gibco	25-300-054
*Items may vary because this video is about general cell culture techniques