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Demostramos un protocolo paso a paso para la investigación de la función génica en macrófagos residentes en tejido peritoneal in vivo, utilizando vectores lentivirales.
Los macrófagos residentes en el tejido peritoneal tienen amplias funciones en el mantenimiento de la homeostasis y están implicados en patologías dentro de los tejidos locales y vecinos. Sus funciones están dictadas por señales microambientales; Por lo tanto, es esencial investigar su comportamiento en un nicho fisiológico in vivo . En la actualidad, las metodologías específicas de focalización de macrófagos peritoneales emplean modelos transgénicos de ratón entero. En este trabajo se describe un protocolo para la modulación eficaz in vivo de la expresión de ARNm y especies pequeñas de ARN (por ejemplo, microARN) en macrófagos peritoneales utilizando partículas de lentivirus. Las preparaciones de lentivirus se elaboraron en células HEK293T y se purificaron en una sola capa de sacarosa. La validación in vivo de la efectividad del lentivirus después de la inyección intraperitoneal reveló una infección predominante de macrófagos restringida al tejido local. La focalización de los macrófagos peritoneales fue exitosa durante la homeostasis y la peritonitis inducida por tioglicolato. Se discuten las limitaciones del protocolo, incluida la inflamación de bajo nivel inducida por la administración intraperitoneal de lentivirus y las restricciones de tiempo para posibles experimentos. En general, este estudio presenta un protocolo rápido y accesible para la evaluación rápida de la función génica en macrófagos peritoneales in vivo.
Los macrófagos residentes en los tejidos (Mφ) son una población heterogénea de células inmunitarias fagocíticas que detectan y responden a patógenos invasores 1,2. Además, desempeñan un papel esencial en el desarrollo de los tejidos, la remodelación y el mantenimiento de la homeostasis 1,3. Muchos Mφ tisulares derivan de los progenitores del saco vitelino durante la embriogénesis y persisten en el tejido durante toda la vida 4,5. El fenotipo y las funciones de ....
Todo el trabajo con animales se llevó a cabo de acuerdo con las directrices institucionales y del Ministerio del Interior del Reino Unido.
NOTA: Todos los estudios in vivo con lentivirus deben realizarse de acuerdo con las directrices locales y nacionales sobre el uso ético de animales en la investigación, así como cumplir con todas las regulaciones asociadas con el uso de materiales infecciosos de categoría II. El bienestar animal también debe controlarse de acuerdo con las regulaciones locales. En este paso del protocolo, se debe tener mucho cuidado al trabajar con partículas lentivirales y objet....
Cuando se sigue completa y correctamente, este protocolo produce un total de 1,5 mL de stock de lentivirus de alta calidad por preparado individual, suficiente para doce inyecciones in vivo al volumen óptimo determinado en este estudio18. El éxito de la transfección se puede evaluar en una fase temprana del protocolo. Las células HEK293T sanas y confluentes deben mostrar, si están presentes en los plásmidos, una señal de marcador fácilmente detect.......
Los macrófagos residentes en los tejidos realizan una serie de funciones homeostáticas e inflamatorias específicas de los tejidos 1,2 dictadas por su entorno fisiológico 6,7,8,9. En este protocolo, se introdujo un método eficaz18 para la manipulación de macrófagos resident.......
Los autores no tienen nada que revelar.
Esta investigación fue financiada, en su totalidad o en parte, por el Wellcome Trust Investigator Award [107964/Z/15/Z]. P.R.T también cuenta con el apoyo del Instituto de Investigación de la Demencia del Reino Unido. M.A.C cuenta con el apoyo de la beca Discovery del Consejo de Investigación en Biotecnología y Ciencias Biológicas (BB/T009543/1). A los efectos del acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia pública de derechos de autor CC BY a cualquier versión del manuscrito aceptado por el autor que surja de este envío. L.C.D es profesor en la Universidad de Swansea e investigador honorario en la Univ....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.05% Trypsin-EDTA (1x) (Trypsin 500 mg/L or 0.02 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
0.22 μm sterile millex GP filter | Merck | SLGS033SS | |
0.45 μm sterile millex GP filter | Merck | SLHP033RS | |
0.5 mL U-100 insulin syringe with needle, 0.33 mm x 12.7 mm (29 G) | BD | 324892 | |
1 Litre Sharps Container | N/A | N/A | |
2.4G2 antibody (TruStain FcX anti-mouse CD16/32) | Biolegend | 101320 | |
40 μm strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
AimV medium (research grade), AlbuMax Supplement | Thermo Fisher Scientific | 31035025 | |
Blocking buffer | prepared in house | ||
Brewer thioglycolate medium | Sigma-Aldrich | B2551 | 4% stock solution prepared in water, autoclaved and kept frozen. |
CD11b | Biolegend | 101222 | Refer to Table 1 for the dilution and concentration |
CD11b | BD | 550993 | Refer to Table 1 for the dilution and concentration |
CD11c | Biolegend | 117317 | Refer to Table 1 for the dilution and concentration |
CD11c | Biolegend | 117333 | Refer to Table 1 for the dilution and concentration |
CD19 | BD | 560375 | Refer to Table 1 for the dilution and concentration |
CD19 | Biolegend | 152410 | Refer to Table 1 for the dilution and concentration |
CD226 | Biolegend | 128808 | Refer to Table 1 for the dilution and concentration |
CD3e | BD | 560527 | Refer to Table 1 for the dilution and concentration |
CD3e | Biolegend | 152313 | Refer to Table 1 for the dilution and concentration |
CD4 | Biolegend | 100412 | Refer to Table 1 for the dilution and concentration |
CD73 | eBioscience | 16-0731-82 | Refer to Table 1 for the dilution and concentration |
CD8a | eBioscience | 48-0081-82 | Refer to Table 1 for the dilution and concentration |
Cell culture flask (T175 fask, 175 cm2, 550 mL) | Greiner Bio One | 658175 | |
Centrifuge tubes, conical bottom tubes 25 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 358126 | |
Centrifuges | Beckman Coulter | Ultracentrifuge and TC centrifuge | |
Collagenase type IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
Conical centrifuge tubes (15 mL and 50 mL) | Greiner Bio One | 11512303 & 11849650 | |
Cryotubes | Greiner Bio One | 123277 | or cryotubes |
DMEM medium (1x) + 4.5g/L D-glucose, 400 µM L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
Dnase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | |
F4/80 | Biolegend | 123123 | Refer to Table 1 for the dilution and concentration |
F4/80 | Biolegend | 123133 | Refer to Table 1 for the dilution and concentration |
F4/80 | Biolegend | 123147 | Refer to Table 1 for the dilution and concentration |
FceR1 | eBioscience | 48-5898-80 | Refer to Table 1 for the dilution and concentration |
Fetal calf serum (FCS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | heat inactivated for 30 min at 56 °C and sterile filtered through 0.22 μm filter |
Flow cytometer | Thermo Fisher Scientific | Attune NxT | |
Flow cytometry (FACS) buffer | prepared in house | ||
Fluorescent tissue culture microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS FL | |
Forceps | N/A | N/A | User preference |
Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco, Life Technologies | 14175-053 | |
HEK293T cell line | grown for at least a week prior transfection. Mycoplasma free | ||
HIV-1 Core antigen | Beckman Coulter | 6604667 | |
Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | |
Hydrex surgical scrub, chlorhexiding gluconate 4% w/v skin cleanser | Ecolab | 3037170 | |
I-A/I-E | Biolegend | 107625 | Refer to Table 1 for the dilution and concentration |
ICAM1 | Becton Dickinson | 554970 | Refer to Table 1 for the dilution and concentration |
Jurkat T cell line | grown for at least a week prior use. Mycoplasma free | ||
LIVE/DEAD fixable near-IR dead cell stain kit | Thermo Fisher Scientific | L34975 | |
Ly6G | Biolegend | 127615 | Refer to Table 1 for the dilution and concentration |
Mice | here used C57BL/6 females, aged 8-12 weeks (Charles Rivers), unless specified differently | ||
Microcapillary pipettes (volume range 0.5-1,000 μL) | Fisher Scientific & Starlab | 11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700 | |
NK1.1 | Biolegend | 108724 | Refer to Table 1 for the dilution and concentration |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | prepared to 2% w/v in PBS |
pCMV-ΔR8.91 packaging plasmid | Zuffrey, R., et al. 1997 | encodes Gag-Pol HIV protein driven by cytomegalovirus promoter. Ampicilin resistance. | |
Penicillin/Streptomycin (100x, 10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Petri dish | Greiner Bio One | 664160 | |
pHR'SIN-cPPT-SEW plasmid | Rosas, M. et al. 2014 | modified for shRNA and miR expression studies. Encodes EGFP marker downstream SFFV promoter and upstream of the Woodchuck hepatitiv virus enhancer. Ampicilin resistance. | |
pMD2.G plasmid | Naldini, L. et al. 1996 | encodes vesicular stomatis virus g-glycoprotein (VSV-G) envelope. Ampicilin resistance. | |
Rat IgG1, κ isotype control | Becton Dickinson | 550617 | Refer to Table 1 for the dilution and concentration |
Rat serum | Sigma-Aldrich | R9759-10ML | |
Red blood ACK lysis buffer | prepared in house | ||
RPMI 1640 medium (1x) + 400 uM L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 21875-091 | |
Saponin | Sigma-Aldrich | S4521 | |
SiglecF | BD | 562681 | Refer to Table 1 for the dilution and concentration |
Sodium hypochlorite Tablets (bleach, 2,000 ppm) | Guest Medical | H8818 | |
Sterile 24-well cell culture plate | Greiner Bio One | 662160 | |
Sterile Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ and Ca2+ - free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Sterile EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
Sterile VWR disposable transfer pipets (23.0 mL, 30 cm) | VWR | 612-4515 | |
Sucrose | Thermo Fisher Scientific | 15503022 | |
surgical scissors | N/A | N/A | User preference |
Syringes (50 mL and 1 0mL) | Fisher Scientific | 10084450 & 768160 | |
Tim4 | Biolegend | 130007 | Refer to Table 1 for the dilution and concentration |
U-bottom 96-well cell culture plate | Greiner Bio One | 650180 |
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