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En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Demostramos un protocolo paso a paso para la investigación de la función génica en macrófagos residentes en tejido peritoneal in vivo, utilizando vectores lentivirales.

Resumen

Los macrófagos residentes en el tejido peritoneal tienen amplias funciones en el mantenimiento de la homeostasis y están implicados en patologías dentro de los tejidos locales y vecinos. Sus funciones están dictadas por señales microambientales; Por lo tanto, es esencial investigar su comportamiento en un nicho fisiológico in vivo . En la actualidad, las metodologías específicas de focalización de macrófagos peritoneales emplean modelos transgénicos de ratón entero. En este trabajo se describe un protocolo para la modulación eficaz in vivo de la expresión de ARNm y especies pequeñas de ARN (por ejemplo, microARN) en macrófagos peritoneales utilizando partículas de lentivirus. Las preparaciones de lentivirus se elaboraron en células HEK293T y se purificaron en una sola capa de sacarosa. La validación in vivo de la efectividad del lentivirus después de la inyección intraperitoneal reveló una infección predominante de macrófagos restringida al tejido local. La focalización de los macrófagos peritoneales fue exitosa durante la homeostasis y la peritonitis inducida por tioglicolato. Se discuten las limitaciones del protocolo, incluida la inflamación de bajo nivel inducida por la administración intraperitoneal de lentivirus y las restricciones de tiempo para posibles experimentos. En general, este estudio presenta un protocolo rápido y accesible para la evaluación rápida de la función génica en macrófagos peritoneales in vivo.

Introducción

Los macrófagos residentes en los tejidos (Mφ) son una población heterogénea de células inmunitarias fagocíticas que detectan y responden a patógenos invasores 1,2. Además, desempeñan un papel esencial en el desarrollo de los tejidos, la remodelación y el mantenimiento de la homeostasis 1,3. Muchos Mφ tisulares derivan de los progenitores del saco vitelino durante la embriogénesis y persisten en el tejido durante toda la vida 4,5. El fenotipo y las funciones de ....

Protocolo

Todo el trabajo con animales se llevó a cabo de acuerdo con las directrices institucionales y del Ministerio del Interior del Reino Unido.

NOTA: Todos los estudios in vivo con lentivirus deben realizarse de acuerdo con las directrices locales y nacionales sobre el uso ético de animales en la investigación, así como cumplir con todas las regulaciones asociadas con el uso de materiales infecciosos de categoría II. El bienestar animal también debe controlarse de acuerdo con las regulaciones locales. En este paso del protocolo, se debe tener mucho cuidado al trabajar con partículas lentivirales y objet....

Resultados

Cuando se sigue completa y correctamente, este protocolo produce un total de 1,5 mL de stock de lentivirus de alta calidad por preparado individual, suficiente para doce inyecciones in vivo al volumen óptimo determinado en este estudio18. El éxito de la transfección se puede evaluar en una fase temprana del protocolo. Las células HEK293T sanas y confluentes deben mostrar, si están presentes en los plásmidos, una señal de marcador fácilmente detect.......

Discusión

Los macrófagos residentes en los tejidos realizan una serie de funciones homeostáticas e inflamatorias específicas de los tejidos 1,2 dictadas por su entorno fisiológico 6,7,8,9. En este protocolo, se introdujo un método eficaz18 para la manipulación de macrófagos resident.......

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada, en su totalidad o en parte, por el Wellcome Trust Investigator Award [107964/Z/15/Z]. P.R.T también cuenta con el apoyo del Instituto de Investigación de la Demencia del Reino Unido. M.A.C cuenta con el apoyo de la beca Discovery del Consejo de Investigación en Biotecnología y Ciencias Biológicas (BB/T009543/1). A los efectos del acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia pública de derechos de autor CC BY a cualquier versión del manuscrito aceptado por el autor que surja de este envío. L.C.D es profesor en la Universidad de Swansea e investigador honorario en la Univ....

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin-EDTA (1x) (Trypsin 500 mg/L or 0.02 mM)Thermo Fisher Scientific25300054
0.22 μm sterile millex GP filterMerckSLGS033SS
0.45 μm sterile millex GP filterMerckSLHP033RS
0.5 mL U-100 insulin syringe with needle, 0.33 mm x 12.7 mm (29 G)BD324892
1 Litre Sharps ContainerN/AN/A
2.4G2 antibody (TruStain FcX anti-mouse CD16/32)Biolegend101320
40 μm strainerThermo Fisher Scientific22363547
AimV medium (research grade), AlbuMax SupplementThermo Fisher Scientific31035025
Blocking bufferprepared in house
Brewer thioglycolate mediumSigma-AldrichB25514% stock solution prepared in water, autoclaved and kept frozen.
CD11bBiolegend101222Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11bBD550993Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11cBiolegend117317Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11cBiolegend117333Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19BD560375Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19Biolegend152410Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD226Biolegend128808Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3eBD560527Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3eBiolegend152313Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD4Biolegend100412Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD73eBioscience16-0731-82Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD8aeBioscience48-0081-82Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Cell culture flask (T175 fask, 175 cm2, 550 mL)Greiner Bio One658175
Centrifuge tubes, conical bottom tubes 25 mm x 89 mmBeckman Coulter358126
CentrifugesBeckman CoulterUltracentrifuge and TC centrifuge
Collagenase type IVSigma-AldrichC5138
Conical centrifuge tubes (15 mL and 50 mL)Greiner Bio One11512303 & 11849650
CryotubesGreiner Bio One123277or cryotubes
DMEM medium (1x) + 4.5g/L D-glucose, 400 µM L-glutamineThermo Fisher Scientific41965-062
Dnase ISigma-Aldrich11284932001
Effectene transfection reagentQiagen301425
F4/80Biolegend123123Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80Biolegend123133Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80Biolegend123147Refer to Table 1 for the dilution and concentration
FceR1eBioscience48-5898-80Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Fetal calf serum (FCS) Thermo Fisher Scientific10270-106heat inactivated for 30 min at 56 °C and sterile filtered through 0.22 μm filter
Flow cytometerThermo Fisher Scientific Attune NxT
Flow cytometry (FACS) bufferprepared in house
Fluorescent tissue culture microscopeThermo Fisher ScientificEVOS FL
ForcepsN/AN/AUser preference
Hank's balanced salt solution (HBSS)Gibco, Life Technologies14175-053
HEK293T cell linegrown for at least a week prior transfection. Mycoplasma free
HIV-1 Core antigenBeckman Coulter6604667
HyaluronidaseSigma-AldrichH3506
Hydrex surgical scrub, chlorhexiding gluconate 4% w/v skin cleanserEcolab3037170
I-A/I-EBiolegend107625Refer to Table 1 for the dilution and concentration
ICAM1Becton Dickinson554970Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Jurkat T cell linegrown for at least a week prior use. Mycoplasma free
LIVE/DEAD fixable near-IR dead cell stain kitThermo Fisher ScientificL34975
Ly6GBiolegend127615Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Micehere used C57BL/6 females, aged 8-12 weeks (Charles Rivers), unless specified differently
Microcapillary pipettes (volume range 0.5-1,000 μL)Fisher Scientific & Starlab11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1Biolegend108724Refer to Table 1 for the dilution and concentration
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148-500Gprepared to 2% w/v in PBS
pCMV-ΔR8.91 packaging plasmidZuffrey, R., et al. 1997encodes Gag-Pol HIV protein driven by cytomegalovirus promoter. Ampicilin resistance.
Penicillin/Streptomycin (100x, 10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Petri dishGreiner Bio One664160
pHR'SIN-cPPT-SEW plasmidRosas, M. et al. 2014modified for shRNA and miR expression studies. Encodes EGFP marker downstream SFFV promoter and upstream of the Woodchuck hepatitiv virus enhancer. Ampicilin resistance.
pMD2.G plasmidNaldini, L. et al. 1996encodes vesicular stomatis virus g-glycoprotein (VSV-G) envelope. Ampicilin resistance.
Rat IgG1, κ isotype controlBecton Dickinson550617Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Rat serumSigma-AldrichR9759-10ML
Red blood ACK lysis bufferprepared in house
RPMI 1640 medium (1x) + 400 uM L-glutamineThermo Fisher Scientific21875-091
SaponinSigma-AldrichS4521
SiglecFBD562681Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Sodium hypochlorite Tablets (bleach, 2,000 ppm)Guest MedicalH8818
Sterile 24-well cell culture plateGreiner Bio One662160
Sterile Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ and Ca2+ - freeThermo Fisher Scientific14190144
Sterile EDTAThermo Fisher Scientific15575020
Sterile VWR disposable transfer pipets (23.0 mL, 30 cm)VWR612-4515
SucroseThermo Fisher Scientific15503022
surgical scissorsN/AN/AUser preference
Syringes (50 mL and 1 0mL)Fisher Scientific10084450 & 768160
Tim4Biolegend130007Refer to Table 1 for the dilution and concentration
U-bottom 96-well cell culture plateGreiner Bio One650180

Referencias

  1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  2. Jantsch, J., Binger, K. J., Muller, D. N., Titze, J. Macrophages in homeostatic immune function.

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Palabras clave vector lentiviralmodulaci n g nicamodulaci n de microARNmacr fagos peritonealesin vivohomeostasisperitonitisc lulas HEK293Tpurificaci n de sacarosainyecci n intraperitonealfunci n g nica

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