Preparación de vectores lentivirales para la modulación eficiente de genes y microARN de macrófagos residentes en el tejido de la cavidad peritoneal in vivo en ratones

Resumen

Demostramos un protocolo paso a paso para la investigación de la función génica en macrófagos residentes en tejido peritoneal in vivo, utilizando vectores lentivirales.

Resumen

Los macrófagos residentes en el tejido peritoneal tienen amplias funciones en el mantenimiento de la homeostasis y están implicados en patologías dentro de los tejidos locales y vecinos. Sus funciones están dictadas por señales microambientales; Por lo tanto, es esencial investigar su comportamiento en un nicho fisiológico in vivo . En la actualidad, las metodologías específicas de focalización de macrófagos peritoneales emplean modelos transgénicos de ratón entero. En este trabajo se describe un protocolo para la modulación eficaz in vivo de la expresión de ARNm y especies pequeñas de ARN (por ejemplo, microARN) en macrófagos peritoneales utilizando partículas de lentivirus. Las preparaciones de lentivirus se elaboraron en células HEK293T y se purificaron en una sola capa de sacarosa. La validación in vivo de la efectividad del lentivirus después de la inyección intraperitoneal reveló una infección predominante de macrófagos restringida al tejido local. La focalización de los macrófagos peritoneales fue exitosa durante la homeostasis y la peritonitis inducida por tioglicolato. Se discuten las limitaciones del protocolo, incluida la inflamación de bajo nivel inducida por la administración intraperitoneal de lentivirus y las restricciones de tiempo para posibles experimentos. En general, este estudio presenta un protocolo rápido y accesible para la evaluación rápida de la función génica en macrófagos peritoneales in vivo.

Introducción

Los macrófagos residentes en los tejidos (Mφ) son una población heterogénea de células inmunitarias fagocíticas que detectan y responden a patógenos invasores ^1,2. Además, desempeñan un papel esencial en el desarrollo de los tejidos, la remodelación y el mantenimiento de la homeostasis ^1,3. Muchos Mφ tisulares derivan de los progenitores del saco vitelino durante la embriogénesis y persisten en el tejido durante toda la vida ^4,5. El fenotipo y las funciones de estas células están dictados por interacciones colaborativas y jerárquicas de factores de transcripción específicos y el microambiente local 6,7,8,9. Una creciente comprensión de esta dependencia aumenta la necesidad de métodos in vivo efectivos para la manipulación génica de Mφ dentro de su nicho fisiológicamente relevante.

Los vectores lentivirales son una herramienta frecuentemente empleada para la manipulación de ácidos nucleicos en poblaciones celulares específicas in vivo 10,11,12, particularmente debido a su capacidad para infectar tanto a las células en división como a las que no se dividen y para integrarse de manera estable en el genoma del huésped ^13,14. En las últimas dos décadas, se ha optimizado la tecnología de administración de lentivirus y se han investigado sobres alternativos y promotores sintéticos para aumentar la focalización específica del linaje ^8,15. Debido a su amplio tropismo celular, la glicoproteína envolvente del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G)^16,17 se ha convertido en la envoltura "estándar de oro" utilizada en la tecnología de lentivirus.

En este protocolo¹⁸, se emplean partículas lentivirales pseudotipadas de VSV-G para demostrar la entrega dirigida y efectiva de ARN de horquilla corta (shRNA) y microARN (miR) al Mφ peritoneal (pMφ) de ratón in vivo, en estado estacionario¹⁹. La expresión del transgén fue impulsada por el promotor del virus formador de foco del bazo (SFFV). La infección productiva de las células se definió por la expresión de la proteína verde fluorescente mejorada (GFP) derivada de lentivirus. La utilización de este enfoque permitió una lectura fácil de los experimentos in vivo con lentivirus para definir la dosis óptima y el marco temporal experimental. Por último, el desafío lentiviral in vivo de ratones durante la inflamación inducida por tioglicolato reveló la propensión natural a la infección selectiva por pMφ.

Protocolo

Todo el trabajo con animales se llevó a cabo de acuerdo con las directrices institucionales y del Ministerio del Interior del Reino Unido.

NOTA: Todos los estudios in vivo con lentivirus deben realizarse de acuerdo con las directrices locales y nacionales sobre el uso ético de animales en la investigación, así como cumplir con todas las regulaciones asociadas con el uso de materiales infecciosos de categoría II. El bienestar animal también debe controlarse de acuerdo con las regulaciones locales. En este paso del protocolo, se debe tener mucho cuidado al trabajar con partículas lentivirales y objetos punzantes.

1. Preparación de las células HEK293T para la transfección

NOTA: Realice estos pasos bajo una cabina de seguridad biológica para cultivo de tejidos estériles.

1. Prepare el medio Eagle Modificado (cDMEM) completo de Dulbecco para células HEK293T combinando los 450 mL de DMEM con un 10% (v/v) de suero fetal de ternero (50 mL) y una concentración final de 100 U/mL de penicilina/estreptomicina.
2. Descongele HEK293T células al menos 1 semana antes de la transfección planificada. Mantener unas condiciones de crecimiento saludables y pasar cada 2-3 días utilizando tripsina + EDTA para separar las células del matraz.
3. Un día antes de la transfección, aspire cuidadosamente el medio de crecimiento de las células y lave suavemente las células con DPBS estéril. Añadir 1-5 mL de tripsina al matraz e incubar a 37 °C en una incubadora de CO₂ al 5% durante 2-5 min.
4. Añadir 5-10 mL de cDMEM y centrifugar las células a 350 x g durante 5 min. Retire el líquido y vuelva a suspender el pellet celular en 10 mL de cDMEM. Cuente las células y la semilla de 10-11 x 10⁶ células HEK293T viables por matraz T175 en 20 mL de cDMEM.
5. Incubar a 37 °C en una incubadora de 5% de CO₂ durante la noche para permitir que las células HEK293T alcancen una confluencia del 70%-80%.
6. Al día siguiente, confirme la confluencia de células bajo un microscopio óptico.
7. Retire el medio del matraz con una tireta serológica de 25 ml sin alterar la monocapa celular.
8. Agregue suavemente 10 ml de DPBS y balancee la placa para lavar las células, teniendo cuidado de no alterar la monocapa celular.
9. Retire el DPBS con una tira serológica de 25 ml.
10. Añada 15 mL de nuevo cDMEM en la pared por matraz T175 para no perturbar la monocapa celular, y devuelva la placa a la incubadora a 37 °C.

2. Transfección de células HEK293T utilizando reactivo de transfección lipídica no liposomal

1. En un tubo de centrífuga de 15 mL, prepare los componentes lentivirales: 2 μg de plásmido lentiviral, 1,5 μg de pΔ8.91 (pCMV-Δ8.91) y 1 μg de pMD2.G (pCMV-MD2.G) con tampón EC (kit de reactivos de transfección) hasta un volumen final de 600 μL.
2. Añadir 36 μL de solución potenciadora. Mezcle los componentes con una pipeta de 1 ml aspirando repetidamente una parte del líquido y volviéndola a colocar gota a gota directamente sobre la solución restante. Dejar actuar 5 min a temperatura ambiente (RT).
3. Añada 120 μL de reactivo de transfección y mezcle como se indica arriba aproximadamente 20 veces. Incubar durante 10 min en RT.
4. Añadir 5,2 mL de cDMEM y mezclar como se indica arriba con una tireta serológica de 5 mL.
5. Con una pipeta de transferencia desechable, añadir la mezcla de transfección gota a gota directamente sobre la monocapa de células HEK293T (evitando las paredes del matraz), extendiendo la mezcla en diferentes puntos del matraz.
6. Distribuya el plásmido balanceando suavemente el matraz de lado a lado. Evite que entre líquido en la tapa del matraz.
7. Incubar el matraz a 37 °C en una incubadora con 5 % de CO₂ durante 48 h. Confirmar la transfección efectiva de las células HEK293T mediante la aparición de un marcador fluorescente, en este caso GFP, dentro de las 24 h posteriores a la transfección monitoreada bajo un microscopio fluorescente de imagen celular.
   NOTA: En el caso de las construcciones sin el marcador fluorescente, las células HEK293T deben analizarse para detectar la presencia del gen marcador utilizado o mediante un cambio en la expresión del gen/proteína de interés mediante técnicas adecuadas, por ejemplo, qPCR. Alternativamente, la transfección exitosa puede verificarse indirectamente durante las pruebas de la colección de lentivirus en las células Jurkat en las últimas etapas del protocolo mediante las técnicas anteriores.
   PRECAUCIÓN: Las células HEK293T transfectadas se consideran infecciosas y se deben implementar las precauciones de seguridad adecuadas al manipular estas células. Se deben seguir las reglas locales, que generalmente pueden incluir trabajar bajo un gabinete de seguridad biológica de categoría II, el uso de guantes dobles y una solución de descontaminación adecuada para la desinfección, por ejemplo, una mayor concentración de lejía de desecho (2,000 ppm) o una solución equivalente de acuerdo con las pautas institucionales de bioseguridad. Todas las soluciones y plásticos que entren en contacto con la preparación de lentivirus deben desinfectarse de acuerdo con los procedimientos institucionales de bioseguridad.

3. Recolección de partículas lentivirales

1. Prepare la solución de descontaminación, una solución de lejía (hipoclorito de sodio) de alta concentración (2.000 ppm) o un agente equivalente de acuerdo con los lineamientos institucionales de bioseguridad en un balde y colóquela en el gabinete de seguridad biológica.
2. Prepare el armario de seguridad biológica eliminando cualquier exceso de elementos, como bastidores de tubos vacíos, etc.
3. Etiquete previamente un tubo de centrífuga de 50 ml por matraz de celdas de HEK293T T175 y retire la tapa del tubo de centrífuga. Coloque los tubos en una rejilla estable.
4. Recupere el matraz de la incubadora y confirme la expresión de GFP utilizando un microscopio fluorescente con un láser de 488 nm (Figura 1A). La intensidad de la señal depende de la eficiencia de la transfección del procedimiento y de los constructos utilizados.
5. Recoja los medios de las células en el tubo de centrífuga de 50 ml preetiquetado. Incline el matraz de HEK293T T175 con células transfectadas para que el medio se acumule en la esquina inferior del matraz. Con una tireta serológica de 25 mL, recoja el medio sin alterar la monocapa celular. Algunas celdas flotantes pueden ser visibles en este punto. Transfiera el medio a un tubo de centrífuga limpio de 50 ml y cierre la tapa.
   1. Con una tireta serológica de 25 mL, añada 25 mL de cDMEM fresco y tibio al matraz. Asegúrese de dirigir el flujo del medio sobre las paredes del matraz para no perturbar la monocapa de la célula. Devolver el matraz con células HEK293T transfectadas a la incubadora (37 °C, 5% CO₂).
      NOTA: Se puede realizar una segunda recolección de lentivirus y una purificación adicional después de 24 horas adicionales siguiendo el procedimiento descrito en los pasos anteriores.
6. Cuando se complete la recolección de lentivirus después de 24 h o 48 h, agregue solución de descontaminación a las células, asegurándose de que cubra la monocapa celular. Mantenga el matraz en posición horizontal durante las siguientes 24 h, luego deséchelo siguiendo las regulaciones apropiadas de la categoría II.

4. Purificación de lentivirus

1. Filtre el medio de recolección del paso 3.5.
   1. Retire el émbolo de la jeringa de 50 ml e inserte un filtro estéril de poliéter sulfona o fluoruro de polivinilideno de baja unión a proteínas de 0,45 μm en el extremo de la jeringa. Con una tira serológica de 25 ml, añada el medio recogido del paso 3.5.1 a la jeringa y devuelva suavemente el émbolo.
   2. Empuje el tapón lentamente para hacer pasar el medio a través del filtro a un tubo de centrífuga nuevo de 50 ml. Si el flujo se reduce significativamente, coloque la jeringa con el filtro apuntando hacia arriba y extraiga el émbolo lo suficiente como para eliminar el medio del filtro.
   3. Con cuidado, reemplace el filtro de la jeringa por uno nuevo y deseche el filtro usado en la solución de descontaminación. Continúe con la filtración del medio. Cuando termine, descontamine el filtro y la jeringa sumergiendo el filtro y llenando la jeringa con la solución de descontaminación.
2. Enfríe previamente la ultracentrífuga ajustando la temperatura a 4 °C y cierre la tapa para permitir que la temperatura se aclimate.
3. Añadir 3 mL de solución de sacarosa al 20 % (20 % p/v en agua ultrapura, esterilizada con filtro con un filtro de 0,22 μm) en el fondo del tubo cónico de ultracentrífuga.
4. Usando una tireta serológica de 25 mL, superponga el medio filtrado sobre la capa de sacarosa, teniendo cuidado de no alterar las capas.
   1. Utilice el ajuste de velocidad más bajo en el chico de pipetas. Incline el tubo de ultracentrífuga cónico a unos 45° y añada lentamente el medio filtrado que contiene lentivirus desde el paso 4.1 hasta la pared del tubo. Asegúrese de que el medio y la sacarosa no se mezclen, y que se vea una clara separación de las capas (Figura 1B). A medida que aumenta el volumen de la capa media, incline lentamente el tubo de ultracentrífuga hacia atrás a una posición vertical.
5. Si el volumen total, incluyendo la sacarosa y el medio, en el tubo de la ultracentrífuga es inferior a 29 ml, rellene con cDMEM nuevo para evitar que el tubo colapse durante el centrifugado. Para múltiples colecciones de T175 mL, mezcle preparaciones de medio filtrado y use varios tubos de ultracentrífuga. Rellene el tubo de ultracentrífuga final con el medio según sea necesario.
6. Asegúrese de que los cubos de ultracentrífuga estén limpios; No hay residuos medianos en el fondo del cubo ni en las tapas. Si es necesario, limpie con ~ 70 % de alcohol. Coloque los adaptadores de tubo apropiados en el fondo de cada cubo (Figura 1C) y baje suavemente los tubos de ultracentrífuga en los cubos.
7. Cierre los cubos de forma segura y cuélguelos en los espacios asignados en el rotor giratorio.
8. Asegúrese de que los cubos estén equilibrados con los mismos volúmenes de sacarosa y medio. Un rotor giratorio nunca debe funcionar sin cucharones, aunque los cucharones opuestos pueden dejarse vacíos²⁰ (Figura 1D).
9. Inserte con cuidado el rotor en la ultracentrífuga y encienda la aspiradora. Ajuste la velocidad de aceleración y desaceleración de la ultracentrífuga al ajuste más bajo y ejecute las preparaciones de lentivirus a 85.000 x g durante 90 minutos a 4 °C.
10. Espere a que la ultracentrífuga alcance la velocidad requerida (aproximadamente 3-5 minutos) antes de alejarse para asegurarse de que el rotor esté insertado correctamente y que el giro no termine.
11. Mientras la ultracentrífuga está funcionando, limpie el espacio de trabajo de acuerdo con los requisitos de seguridad de la categoría II y prepare el espacio para los siguientes pasos.
12. Cuando termine el centrifugado, desactive el vacío y retire con cuidado el rotor para no perturbar las muestras.
13. Investigue la ultracentrífuga en busca de derrames y confirme que no haya fugas en los cubos. En caso de derrame, doble guante y descontamine la centrífuga y la superficie externa de los cubos con productos antivirales.
14. Retire los cubos de la ultracentrífuga y transpórtelos con cuidado al armario de seguridad biológica de categoría II.
    NOTA: Las partículas de lentivirus se acumulan en el fondo del tubo de ultracentrífuga. El perdigón no es visible a simple vista.
15. Vierta la sacarosa y el medio con un movimiento suave directamente en el contenedor de residuos con la solución de descontaminación.
16. Manteniendo el tubo de ultracentrífuga invertido, transfiéralo a la doble capa de tejido y déjelo secar durante 10 min. Mientras tanto, limpie el interior de los cubos con un pañuelo de papel empapado en agua y séquelo al aire boca abajo.
17. Seque cuidadosamente cualquier líquido restante del borde del tubo de ultracentrífuga con un pañuelo de papel antes de ponerlo en posición vertical. Desinfecte el pañuelo y la superficie que se encuentra debajo.
18. Vuelva a suspender la pastilla de virus en 1 ml de medio o solución sin suero necesaria para una mayor experimentación pipeteando suavemente la solución hacia arriba y hacia abajo. Déjalo durante 15 min en RT dentro del gabinete de seguridad de biología de categoría II.
19. Mezcle suavemente las preparaciones de lentivirus con una pipeta de 1 mL antes de alícuotas en tubos de rosca de 1,5 mL (por ejemplo, criotubos). Prepare las alícuotas para el trabajo in vivo (multiplicidad de 100 μL) y para el título de lentivirus en células T Jurkat (1 x 20 μL) (ver paso 5).
20. Evite los ciclos de congelación y descongelación; Las preparaciones lentivirales pueden almacenarse a -80 °C durante un máximo de 6 meses sin que ello afecte negativamente a la infectividad.

5. Titulación de la producción de lentivirus en células T Jurkat

1. Prepare el medio completo Roswell Park Memorial Institute 1640 (cRPMI-1640) para las células T Jurkat suplementando 500 mL de RPMI-1640 con suero fetal de ternero al 10% (v/v) y una concentración final de 100 U/mL de penicilina/estreptomicina.
2. Para garantizar un cultivo saludable de células T Jurkat, mantenga las células en cultivo hasta 1 semana antes de la infección.
3. El día de la titulación de lentivirus, extraiga las células T Jurkat viables en una placa de 24 pocillos a 2 x 10⁵ células/pocillo en 200 μL por pocillo de cRPMI-1640.
4. Utilice lentivirus recién recogido o descongele el vial de lentivirus que contiene 20 μL en hielo y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
5. Utilizando la dilución en serie en cRPMI-1640, infecta las células T de Jurkat con 0,25 μL, 0,5 μL, 1 μL, 2,5 μL, 5 μL y 10 μL de caldo de lentivirus. Agite suavemente la placa para asegurar una distribución equitativa del lentivirus. Las células T Jurkat no infectadas sirven como control negativo.
6. Incubar la placa a 37 °C. Después de 4 h, rellene cada pocillo con cRPMI hasta un volumen total de 400 μL. Vuelva a colocar la placa en la incubadora a 37 °C durante 3 días.
7. Después de 48 h después de la infección, confirme la expresión de GFP bajo un sistema de imagen fluorescente.
8. 3 días después de la infección, recoja cada pocillo de la placa de 24 pocillos en tubos de recolección separados de 1,5 ml y centrifugue las células a 350 x g a 4 °C durante 5 min.
9. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en 300 μL de paraformaldehído (PFA) al 2% (PFA) preparado al 2% (p/v) en DPBS y déjelo durante 15 min en hielo en la oscuridad.
10. Centrifugar las células a 350 x g a 4 °C durante 5 min y resuspender el pellet en un tampón de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) (DPBS estéril + 4% FCS + EDTA estéril de 1 mM).
11. Analizar la frecuencia de expresión de GFP y la intensidad fluorescente media del lentivirus infectado y sus células control mediante citometría de flujo (Figura 2).

6. Infección in vivo por lentivirus de macrófagos peritoneales residentes en tejidos

1. En un armario de seguridad biológica de categoría II, cargue las agujas de insulina con un volumen total de 200 μL de medio libre de suero que contenga la cantidad necesaria de lentivirus (utilice agujas de un solo uso, 30 G para el bienestar animal y para evitar la pérdida de líquidos en la aguja).
2. Vuelva a colocar la funda de la aguja en la aguja utilizando la técnica de la cuchara con una sola mano. Mantenga la aguja en hielo e inyecte dentro de los 30 minutos.
3. En el animalario, instale un gabinete de seguridad biológica de categoría II antes de las inyecciones (Figura 1E).
   1. Coloque una hoja de pañuelo de papel limpio. Afloje la vaina de la aguja de insulina que contiene lentivirus.
   2. Prepare una placa de Petri que contenga pequeños trozos de tejido y desinfectante a base de gluconato de clorhexidina, un tubo de 50 ml que contenga solución de descontaminación (2,000 ppm de solución de lejía) y un recipiente seguro para objetos punzantes.
4. Sujete al ratón agarrando la piel por la nuca²¹. El mouse correctamente sujeto está inmóvil, y esto es necesario por seguridad.
5. Con el abdomen hacia arriba, apunta la cabeza del animal ligeramente hacia abajo. Inyectar el lentivirus por vía intraperitoneal en el cuadrante inferior derecho de la cavidad abdominal. Esto es para evitar la inyección en cualquier órgano de la cavidad peritoneal.
6. Antes de soltar el ratón, llene la jeringa con solución descontaminante y deséchela de forma segura en la caja fuerte afilada.
7. Limpie el lugar de la inyección en el abdomen del ratón con un pañuelo empapado en desinfectante y devuelva el animal a la jaula.
8. Alojar el ratón inyectado con lentivirus en jaulas de categoría II o en jaulas con ventilación individual (IVC) (jaulas aisladas con filtración de aire de alta eficiencia) durante un mínimo de 72 h después de la inyección. Coloque una tarjeta de información apropiada en la parte delantera de la jaula.
9. Mueva el ratón a la nueva jaula de retención de categoría I después de 72 h después de la infección, según las aprobaciones de seguridad locales. Monitoree los ratones diariamente durante un total de 3 días desde la inyección.

7. Recolección de células peritoneales de ratones infectados con lentivirus

PRECAUCIÓN: Para las colecciones dentro de las 72 horas posteriores a la inyección de lentivirus, siga las reglas institucionales de seguridad biológica de categoría II. El lecho y la jaula de espera donde se mantuvieron los animales infectados en las primeras 72 horas después de la inyección de lentivirus deben descontaminarse de acuerdo con las normas institucionales de seguridad biológica de categoría II.

1. Sacrificar ratones siguiendo las regulaciones institucionales, por ejemplo, mediante la inhalación de una concentración creciente de CO₂, seguida de la confirmación de la muerte por dislocación cervical.
2. Limpiar el abdomen del ratón con isopropanol al 70% y cortar cuidadosamente la piel para exponer la membrana de la cavidad peritoneal.
3. Lave la cavidad peritoneal con 6 mL de tampón FACS helado utilizando una jeringa de 10 mL y una aguja de 23 G. Evite perforar cualquier órgano.
4. Masajee suavemente el peritoneo para desalojar las células del tampón FACS.
5. Recoja el líquido peritoneal con la misma jeringa y aguja.
6. Retire la aguja y transfiera las células a un tubo de centrífuga de 15 ml.
7. Mantener los lavados peritoneales en hielo.
8. Recolectar otros órganos necesarios y almacenarlos según corresponda para el estudio.
9. Deseche los cadáveres de los animales de acuerdo con las pautas locales de seguridad y animales.

8. Tinción y análisis de células peritoneales

1. Centrifugar el lavado peritoneal a 350 x g a 4 °C durante 5 min, desechar el sobrenadante en la solución de descontaminación y resuspender las células en 1 mL de tampón FACS.
2. Cuente las celdas recolectadas y coloque 4 x 10⁵ celdas por pocillo en una placa de 96 pocillos con fondo en V.
3. Realice la tinción de viabilidad utilizando un reactivo reutilizable (por ejemplo, el kit de tinción de células muertas de infrarrojo cercano fijable utilizado aquí) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
4. Si las células se infectaron en las últimas 72 h, fije las células en PFA al 2% durante 15 minutos en hielo. Añadir un volumen igual de DPBS frío y volver a centrifugar a 350 x g a 4 °C durante 5 min.
5. Prepare el tampón de bloqueo: Mezcle 4 μg/mL de anticuerpo 2.4G2 en suero de rata al 10% (v/v) en tampón FACS para tinción superficial o tampón de permeabilización para tinción intracelular.
6. Vuelva a suspender cada pocillo que contenga gránulo celular en 50 μL de tampón de bloqueo e incube a 4 °C durante 15 min.
7. Prepare la mezcla de anticuerpos en 50 μL de tampón FACS (para tinción superficial) o tampón de permeabilización (para tinción intracelular) por cada muestra. El volumen final de tinción para cada muestra será de 100 μL, incluyendo 50 μL de tampón de bloqueo. Calcular las concentraciones de anticuerpos en consecuencia (Tabla 1).
8. Añada 50 μL de mezcla de anticuerpos a las muestras y 50 μL de controles de isotipo y tampón de control a las muestras de control. Incubar las muestras durante 30 minutos en hielo en la oscuridad. Incluya células sin teñir y controles de isotipo según sea necesario.
9. Lave cada pocillo con 100-200 μL de DPBS helado y centrifugue la placa a 350 x g a 4 °C durante 5 min. Repita este paso para lavar los anticuerpos no unidos. Analice las muestras en un citómetro de flujo.

9. Extracción de células de órganos

1. Prepare 1 mL de mezcla para la digestión por órgano: Mezcle la solución salina balanceada de Hank (HBSS), 2 mg/mL de colagenasa tipo IV y 0,03 mg/mL de DNasa I (incluye 1,5 mg/mL de hialuronidasa para la digestión pulmonar).
2. Transfiera el órgano recolectado a 1 ml de mezcla de digestión y píquelo con unas tijeras.
3. Filtrar las células a través de un colador de 40 μm y centrifugar a 350 x g a 4 °C durante 5 min.
4. Si aísla células del pulmón, el bazo o el hígado, lise los glóbulos rojos con tampón de lisis ACK (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM Na₂EDTA pH = 7,4). Filtrar las células a través de un colador de 40 μm y centrifugar a 350 x g a 4 °C durante 5 min.
5. Tiñir y analizar las células como se describe en la sección 8.

Resultados

Cuando se sigue completa y correctamente, este protocolo produce un total de 1,5 mL de stock de lentivirus de alta calidad por preparado individual, suficiente para doce inyecciones in vivo al volumen óptimo determinado en este estudio¹⁸. El éxito de la transfección se puede evaluar en una fase temprana del protocolo. Las células HEK293T sanas y confluentes deben mostrar, si están presentes en los plásmidos, una señal de marcador fácilmente detect...

Discusión

Los macrófagos residentes en los tejidos realizan una serie de funciones homeostáticas e inflamatorias específicas de los tejidos ^1,2 dictadas por su entorno fisiológico 6,7,8,9. En este protocolo, se introdujo un método eficaz¹⁸ para la manipulación de macrófagos resident...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% Trypsin-EDTA (1x) (Trypsin 500 mg/L or 0.02 mM)	Thermo Fisher Scientific	25300054
0.22 μm sterile millex GP filter	Merck	SLGS033SS
0.45 μm sterile millex GP filter	Merck	SLHP033RS
0.5 mL U-100 insulin syringe with needle, 0.33 mm x 12.7 mm (29 G)	BD	324892
1 Litre Sharps Container	N/A	N/A
2.4G2 antibody (TruStain FcX anti-mouse CD16/32)	Biolegend	101320
40 μm strainer	Thermo Fisher Scientific	22363547
AimV medium (research grade), AlbuMax Supplement	Thermo Fisher Scientific	31035025
Blocking buffer	prepared in house
Brewer thioglycolate medium	Sigma-Aldrich	B2551	4% stock solution prepared in water, autoclaved and kept frozen.
CD11b	Biolegend	101222	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11b	BD	550993	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11c	Biolegend	117317	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11c	Biolegend	117333	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19	BD	560375	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19	Biolegend	152410	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD226	Biolegend	128808	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3e	BD	560527	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3e	Biolegend	152313	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD4	Biolegend	100412	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD73	eBioscience	16-0731-82	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD8a	eBioscience	48-0081-82	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Cell culture flask (T175 fask, 175 cm2, 550 mL)	Greiner Bio One	658175
Centrifuge tubes, conical bottom tubes 25 mm x 89 mm	Beckman Coulter	358126
Centrifuges	Beckman Coulter		Ultracentrifuge and TC centrifuge
Collagenase type IV	Sigma-Aldrich	C5138
Conical centrifuge tubes (15 mL and 50 mL)	Greiner Bio One	11512303 & 11849650
Cryotubes	Greiner Bio One	123277	or cryotubes
DMEM medium (1x) + 4.5g/L D-glucose, 400 µM L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Dnase I	Sigma-Aldrich	11284932001
Effectene transfection reagent	Qiagen	301425
F4/80	Biolegend	123123	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80	Biolegend	123133	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80	Biolegend	123147	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
FceR1	eBioscience	48-5898-80	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Fetal calf serum (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106	heat inactivated for 30 min at 56 °C and sterile filtered through 0.22 μm filter
Flow cytometer	Thermo Fisher Scientific	Attune NxT
Flow cytometry (FACS) buffer	prepared in house
Fluorescent tissue culture microscope	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Forceps	N/A	N/A	User preference
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Gibco, Life Technologies	14175-053
HEK293T cell line			grown for at least a week prior transfection. Mycoplasma free
HIV-1 Core antigen	Beckman Coulter	6604667
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506
Hydrex surgical scrub, chlorhexiding gluconate 4% w/v skin cleanser	Ecolab	3037170
I-A/I-E	Biolegend	107625	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
ICAM1	Becton Dickinson	554970	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Jurkat T cell line			grown for at least a week prior use. Mycoplasma free
LIVE/DEAD fixable near-IR dead cell stain kit	Thermo Fisher Scientific	L34975
Ly6G	Biolegend	127615	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Mice			here used C57BL/6 females, aged 8-12 weeks (Charles Rivers), unless specified differently
Microcapillary pipettes (volume range 0.5-1,000 μL)	Fisher Scientific & Starlab	11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1	Biolegend	108724	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	prepared to 2% w/v in PBS
pCMV-ΔR8.91 packaging plasmid		Zuffrey, R., et al. 1997	encodes Gag-Pol HIV protein driven by cytomegalovirus promoter. Ampicilin resistance.
Penicillin/Streptomycin (100x, 10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri dish	Greiner Bio One	664160
pHR'SIN-cPPT-SEW plasmid		Rosas, M. et al. 2014	modified for shRNA and miR expression studies. Encodes EGFP marker downstream SFFV promoter and upstream of the Woodchuck hepatitiv virus enhancer. Ampicilin resistance.
pMD2.G plasmid		Naldini, L. et al. 1996	encodes vesicular stomatis virus g-glycoprotein (VSV-G) envelope. Ampicilin resistance.
Rat IgG1, κ isotype control	Becton Dickinson	550617	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Rat serum	Sigma-Aldrich	R9759-10ML
Red blood ACK lysis buffer	prepared in house
RPMI 1640 medium (1x) + 400 uM L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	21875-091
Saponin	Sigma-Aldrich	S4521
SiglecF	BD	562681	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Sodium hypochlorite Tablets (bleach, 2,000 ppm)	Guest Medical	H8818
Sterile 24-well cell culture plate	Greiner Bio One	662160
Sterile Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ and Ca2+ - free	Thermo Fisher Scientific	14190144
Sterile EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020
Sterile VWR disposable transfer pipets (23.0 mL, 30 cm)	VWR	612-4515
Sucrose	Thermo Fisher Scientific	15503022
surgical scissors	N/A	N/A	User preference
Syringes (50 mL and 1 0mL)	Fisher Scientific	10084450 & 768160
Tim4	Biolegend	130007	Refer to Table 1 for the dilution and concentration
U-bottom 96-well cell culture plate	Greiner Bio One	650180