Un protocolo para evaluar y cuantificar patologías del epitelio pigmentado retiniano en modelos murinos de degeneración macular relacionada con la edad

Resumen

Los modelos de ratón pueden ser herramientas útiles para investigar la biología del epitelio pigmentado de la retina (EPR). Se ha establecido que los ratones pueden desarrollar una serie de patologías del EPR. Aquí, describimos un protocolo de fenotipado para dilucidar y cuantificar patologías de EPR en ratones utilizando luz, electrones de transmisión y microscopía confocal.

Resumen

La degeneración macular relacionada con la edad (DMAE) es un trastorno retiniano debilitante en las poblaciones que envejecen. Se cree ampliamente que la disfunción del epitelio pigmentado de la retina (EPR) es un evento patobiológico clave en la DMAE. Para comprender los mecanismos que conducen a la disfunción del EPR, los investigadores pueden utilizar modelos de ratón. Se ha establecido por estudios previos que los ratones pueden desarrollar patologías del EPR, algunas de las cuales se observan en los ojos de individuos diagnosticados con DMAE. Aquí, describimos un protocolo de fenotipado para evaluar patologías de EPR en ratones. Este protocolo incluye la preparación y evaluación de cortes transversales retinianos mediante microscopía óptica y microscopía electrónica de transmisión, así como la de montajes planos RPE por microscopía confocal. Detallamos los tipos comunes de patologías murinas del EPR observadas por estas técnicas y las formas de cuantificarlas a través de métodos imparciales para las pruebas estadísticas. Como prueba de concepto, utilizamos este protocolo de fenotipado de EPR para cuantificar las patologías del EPR observadas en ratones que sobreexpresan la proteína transmembrana 135 (Tmem135) y ratones envejecidos C57BL / 6J de tipo salvaje. El objetivo principal de este protocolo es presentar métodos estándar de fenotipado de EPR con evaluaciones cuantitativas imparciales para científicos que utilizan modelos de ratón de DMAE.

Introducción

La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) es una enfermedad ceguera común que afecta a poblaciones mayores de 55 años¹. Muchos investigadores creen que la disfunción dentro del epitelio pigmentado de la retina (EPR) es un evento patobiológico temprano y crucial en la DMAE². El EPR es una monocapa de células polarizadas encargadas de mantener la homeostasis de los fotorreceptores vecinos y los vasos sanguíneos coroideos³. Existe una variedad de modelos para investigar los mecanismos asociados a la enfermedad dentro del EPR, incluidos los modelos de cultivo celular ^4,5 y los ratones 6,7,8. Un informe reciente ha descrito protocolos estandarizados y criterios de control de calidad para modelos de cultivo celular de EPR⁴, sin embargo, ningún informe ha intentado estandarizar el fenotipado del EPR en modelos de ratón. De hecho, muchas publicaciones sobre modelos de ratón de DMAE carecen de una descripción completa del EPR o cuantificación de las patologías del EPR en ellos. El objetivo general de este protocolo es presentar métodos estándar de fenotipado de EPR con evaluaciones cuantitativas imparciales para científicos que utilizan modelos de ratón DMAE.

Publicaciones anteriores han observado la presencia de varias patologías del EPR en ratones a través de tres técnicas de imagen. Por ejemplo, la microscopía óptica permite a los investigadores ver la morfología macroscópica de la retina murina (Figura 1A) y detectar patologías del EPR como el adelgazamiento, la vacuolización y la migración del EPR. El adelgazamiento del EPR en un modelo de ratón AMD se ejemplifica mediante una desviación en la altura del EPR de sus respectivos controles (Figura 1B). La vacuolización del EPR se puede dividir en dos categorías separadas: microvacuolización (Figura 1C) y macrovacuolización (Figura 1D). La microvacuolización del EPR se resume en la presencia de vacuolas en el EPR que no afectan su altura total, mientras que la macrovacuolización está indicada por la presencia de vacuolas que sobresalen en los segmentos externos de los fotorreceptores. La migración del EPR se distingue por el agregado focal de pigmento por encima de la monocapa del EPR en una sección transversal retiniana (Figura 1E). Cabe señalar que las células migratorias del EPR en los ojos de los donantes de DMAE exhiben inmunorreactividad a los marcadores de células inmunitarias, como el grupo de diferenciación 68 (CD68)9, y podrían representar células inmunitarias que envuelven restos de EPR o EPR en transdiferenciación⁹. Otra técnica de imagen llamada microscopía electrónica de transmisión puede permitir a los investigadores visualizar la ultraestructura del EPR y su membrana basal (Figura 2A). Esta técnica puede identificar el depósito sub-EPR predominante en ratones, conocido como depósito laminar basal (BLamD) (Figura 2B)¹⁰. Por último, la microscopía confocal puede revelar la estructura de las células del EPR a través de montajes planos de imágenes del EPR (Figura 3A). Este método puede descubrir la dismorfia del EPR, la desviación del EPR de su forma clásica de panal (Figura 3B). También puede detectar la multinucleación del EPR, la presencia de tres o más núcleos dentro de una célula del EPR (Figura 3C). Para un resumen de los tipos de patologías del EPR presentes en los modelos actuales de ratón DMAE, remitimos a los investigadores a estas revisiones de la literatura ^6,7.

Los investigadores que estudian la DMAE deben ser conscientes de las ventajas y desventajas de usar ratones para investigar patologías RPE antes del protocolo de fenotipado. Los ratones son ventajosos debido a su vida relativamente corta y rentabilidad, así como a su manipulabilidad genética y farmacológica. Los ratones también exhiben cambios degenerativos del EPR, incluyendo migración del EPR, dismorfia y multinucleación, que se observan en los ojos de los donantes de DMAE 11,12,13,14,15,16,17; esto sugiere que mecanismos similares pueden subyacer al desarrollo de estas patologías del EPR en ratones y humanos. Sin embargo, existen diferencias clave que limitan la traducibilidad de los estudios con ratones a la DMAE humana. Primero, los ratones no tienen una mácula, una región anatómicamente distinta de la retina humana necesaria para la agudeza visual que se ve afectada preferentemente en la DMAE. En segundo lugar, algunas patologías del EPR en ratones, como el adelgazamiento del EPR y la vacuolización, no se observan típicamente en los ojos de los donantes de DMAE¹⁸. En tercer lugar, los ratones no desarrollan drusas, un sello distintivo de la patología de la DMAE¹⁹. Las drusas son depósitos que contienen lípidos y proteínas con muy pocas proteínas de la membrana basal que se forman entre la lámina basal del EPR y la capa colágena interna de la membrana de Bruch (BrM)¹⁹. Las drusas difieren de BLamD, el depósito común de sub-RPE en ratones, tanto en su composición como en su ubicación anatómica. Los BLamD son anomalías enriquecidas con matriz extracelular dependientes de la edad y el estrés que se forman entre la lámina basal del EPR de BrM y los pliegues basales del EPR²⁰. Curiosamente, los BLamD tienen una composición y apariencia de proteínas similares tanto en ratones como en humanos ^6,10,21. Trabajos recientes sugieren que los BLamD pueden actuar en la patobiología de la DMAE al influir en la progresión de la DMAE a sus etapas posteriores^18,22; por lo tanto, estos depósitos pueden representar EPR enfermo en la retina del ratón. El conocimiento de estos beneficios y limitaciones es fundamental para los investigadores interesados en traducir los resultados de los estudios con ratones a la DMAE.

En este protocolo, discutimos los métodos para preparar los ojos para la luz, el electrón de transmisión y la microscopía confocal para visualizar patologías de EPR. También describimos cómo cuantificar las patologías del EPR de manera imparcial para las pruebas estadísticas. Como prueba de concepto, utilizamos el protocolo de fenotipado de EPR para investigar las patologías estructurales del EPR observadas en ratones que sobreexpresan la proteína transmembrana 135- (Tmem135) y ratones envejecidos tipo salvaje (WT) C57BL / 6J. En resumen, nuestro objetivo es describir la metodología de fenotipado para caracterizar el EPR en modelos de ratón DMAE, ya que actualmente no hay protocolos estándar disponibles. Los investigadores interesados en examinar y cuantificar patologías de los fotorreceptores o coroides, que también se ven afectados en modelos de ratón DMAE, pueden no encontrar este protocolo útil para sus estudios.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran sujetos animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Wisconsin-Madison, y cumplen con la Declaración de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión.

1. Evaluación del EPR del ratón mediante microscopía óptica

1. Haga un tampón fijador que tenga una concentración final de 2% de paraformaldehído y 2% de glutaraldehído a temperatura ambiente (RT) en una botella de vidrio.
   NOTA: Este protocolo requiere, como máximo, 14 ml de tampón fijador por ratón.
   PRECAUCIÓN: El paraformaldehído y el glutaraldehído son sustancias peligrosas. Siga los procedimientos operativos estándar cuando trabaje con estas sustancias.
2. Preparar un sistema de perfusión de alimentación por gravedad en una almohadilla absorbente para la perfusión cardíaca en una campana extractora (Figura suplementaria 1A).
   1. Introducir 40 ml del tampón fijador en el cilindro de la jeringa del sistema de perfusión (figura complementaria 1B).
   2. Gire la válvula hasta que esté paralela a la línea de tubería para permitir que el amortiguador fluya a través de la línea de tubería (Figura suplementaria 1C). Enjuague la línea con un tampón hasta que se eliminen todas las burbujas de aire de la línea.
   3. Gire la válvula hasta que esté perpendicular a la tubería para evitar que el amortiguador fluya hacia la tubería (Figura suplementaria 1D).
      NOTA: El sistema de perfusión ya está listo para su uso.
3. Eutanasia del ratón colocándolo en una cámara de dióxido de carbono (CO 2) y permita que el CO₂ fluya hacia la cámara a una tasa de flujo del 30% del volumen de la cámara por minuto. Una vez que el ratón deje de respirar, permita que el_CO2 fluya hacia la cámara durante al menos 1 minuto. Verifique que el mouse esté muerto antes de continuar con el siguiente paso.
   NOTA: La eutanasia mediante inyección de agentes farmacológicos se puede utilizar en este protocolo como una alternativa a la inhalación de_CO2 .
4. Realizar perfusión cardíaca en el ratón sacrificado.
   1. Transfiera el ratón a una bandeja poco profunda cerca del sistema de perfusión con el abdomen hacia arriba. Rocíe el abdomen con etanol al 70% (EtOH).
   2. Haga cuatro incisiones para exponer la cavidad abdominal (Figura complementaria 2A).
      1. Cree un corte inferior de 5 cm usando tijeras curvas y fórceps a través de la piel y la pared abdominal en el lado izquierdo más alejado del ratón que está directamente debajo de la caja torácica.
      2. Se procede a realizar un corte medial de 3 cm a través de la piel y la pared abdominal del ratón que comienza en la parte superior del corte inferior.
      3. Haga otro corte inferior de 5 cm al final del corte medial a través de la piel y la pared abdominal en el lado derecho más lejano del ratón directamente debajo de la caja torácica.
      4. Haga otra incisión medial de 3 cm para retirar el colgajo de piel abdominal con fórceps curvos.
   3. Corte a través del diafragma y el esternón para exponer el corazón (Figura suplementaria 2B).
      NOTA: Tenga cuidado de evitar cortar el corazón, las arterias y las venas. Cortarlos conducirá a una perfusión cardíaca ineficiente.
   4. Inserte la aguja de calibre en el ventrículo izquierdo del corazón. Gire la válvula hasta que esté paralela a la línea de tubería. Corte la aurícula derecha con tijeras curvas para permitir que la sangre y el fijador salgan del corazón (Figura complementaria 2C).
   5. Permita que 10 ml de tampón fijador penetren en el ratón durante al menos 1-2 minutos, o hasta que el hígado se vuelva de color pálido y no salga sangre de la aurícula derecha. Una vez que se complete la perfusión, gire la válvula hasta que esté perpendicular a la línea de tubería para detener el flujo del amortiguador.
5. Enuclear los ojos del ratón después de la perfusión cardíaca.
   1. Retire el ratón de la bandeja poco profunda y colóquelo sobre la almohadilla inferior absorbente en una campana extractora. Oriente la cabeza del ratón de tal manera que el ojo izquierdo esté orientado hacia el experimentador y el ojo derecho esté fuera de la vista. Anote el lado superior del ojo con un tinte de marcado de tejido.
   2. Empuje suavemente hacia abajo con el pulgar y el índice alrededor de la cuenca del ojo para causar la protrusión del ojo de la cuenca del ojo (Figura complementaria 3A).
   3. Tome tijeras curvas y sosténgalas con la hoja en un ángulo de 30 ° desde la cuenca del ojo. Proceda a cortar alrededor del ojo con las tijeras curvas en un ángulo de 30° (Figura suplementaria 3B).
      NOTA: Está bien cortar el exceso de tejido de la cuenca del ojo para preservar la integridad del globo ocular.
   4. Retire el globo ocular de la cabeza con pinzas curvas y colóquelo en una almohadilla absorbente. Corte la córnea con una hoja de bisturí número 11 y coloque el ojo con fórceps curvos en un microtubo de 2 ml con 2 ml de tampón fijador. Etiquete el microtubo de 2 ml con la identificación del ratón y "izquierda" para indicar el ojo izquierdo.
      NOTA: La muesca en la córnea permite que el fijador penetre fácilmente en el ojo para preservarlo mejor.
   5. Repita los pasos 1.5.1-1.5.4 para el ojo derecho.
6. Deje que los ojos se incuben en un tampón fijador durante la noche en una coctelera en una habitación de 4 ° Celsius (C), a una velocidad de 75 rotaciones por minuto (rpm).
7. Reemplace el tampón fijador con 2 ml de solución salina tampón fosfato 1x (PBS). Incubar los ojos en 1x PBS durante 10 min en un agitador a RT y 75 rpm. Repita este paso dos veces.
8. Limpiar y diseccionar los ojos para generar segmentos posteriores.
   NOTA: El segmento posterior es el globo ocular del ratón con la retina neural, el EPR, la coroides y la esclerótica sin la córnea, el iris y el cristalino.
   1. Coloque el ojo en una placa de Petri llena de 1x PBS bajo un microscopio de disección (Figura suplementaria 4A).
   2. Levante suavemente cualquier grasa y músculo lejos del globo ocular con pinzas de punta fina. Recorte cuidadosamente la grasa y el músculo con tijeras de microdisección en dirección paralela al globo ocular hasta que el globo ocular tenga un color negro azulado uniforme (Figura suplementaria 4B).
      NOTA: No corte en dirección perpendicular, ya que esto daña el globo ocular. Además, si el tinte de marcado de tejido se desprende durante el procesamiento, vuelva a anotar el lado superior del globo ocular inmediatamente.
   3. Coloque fórceps de punta fina en el sitio de punción corneal. Cortar alrededor del perímetro de la córnea, comenzando en el sitio de punción, con tijeras de microdisección, para extraer la córnea y el iris del globo ocular (Figura complementaria 4C).
   4. Tome fórceps de punta fina y retire suavemente la lente del globo ocular para obtener el segmento posterior (Figura suplementaria 4D).
   5. Coloque el segmento posterior de nuevo en un microtubo de 2 ml con 2 ml de 1x PBS. Conservar el segmento posterior en nevera a 4 °C.
      NOTA: Los segmentos posteriores pueden permanecer en 1x PBS a 4 °C durante muchas semanas antes de su posterior procesamiento.
9. Repita los pasos 1.3-1.8 para preparar los ojos de otros ratones en el estudio.
10. Procese e incruste uno de los segmentos posteriores de cada ratón en parafina para la sección. Asegúrese de que el lado superior del segmento posterior esté en la parte superior.
    NOTA: Los autores confían en el laboratorio de Iniciativas de Investigación Traslacional en Patología (TRIP) de la Universidad de Wisconsin-Madison (UW) para realizar estas tareas. Aquí hay protocolos publicados que utilizan un método similar de procesamiento e incrustación de parafina^23,24.
11. Recorte y seccione cada bloque de parafina para obtener una sección retiniana de 5 μm de espesor que incluya la cabeza del nervio óptico, así como cuatro secciones retinianas adicionales de 5 μm de espesor que estén separadas entre sí. Etiquete las diapositivas con la identificación del mouse y el número de sección de serie (es decir, 1, 2, 3, 4 o 5). Guarde las diapositivas en un cuadro de diapositivas.
    NOTA: Los autores confían en el laboratorio UW TRIP para sus servicios en la sección de parafina. Aquí hay protocolos publicados que utilizan un método similar de seccionamiento de parafina^25,26.
12. Manchar los portaobjetos que contienen secciones retinianas con hematoxilina y eosina (H&E). Un protocolo de tinción H&E se puede encontrar en la Figura Suplementaria 5.
    NOTA: Todos los pasos del procedimiento de tinción H&E deben completarse en una campana extractora.
13. Recopile imágenes cosidas de secciones retinianas teñidas con H&E con una barra de escala utilizando un microscopio de luz con un aumento de 20x.
14. Cuantificar el grosor del EPR en las imágenes retinianas que contienen la cabeza del nervio óptico para cada muestra.
    1. Descargue y abra el programa Fiji ImageJ. Arrastre todas las imágenes retinianas cosidas que contienen la cabeza del nervio óptico a la barra de tareas Fiji ImageJ. Verifique que la escala de imagen esté calibrada en μm y no en píxeles.
       NOTA: La escala de la imagen se encuentra en la esquina superior izquierda de la ventana que contiene una imagen de retina en el programa Fiji ImageJ. Si la escala se establece en píxeles, consulte el manual de instrucciones del programa Fiji ImageJ para convertir píxeles a μm.
    2. Marque cada intervalo de 300 μm en cada imagen desde el borde de la cabeza del nervio óptico hasta el final de la retina (ora serrata). Haga clic en el icono Recto en la barra de tareas de Fiji ImageJ. Haga clic y arrastre una línea desde el borde de la cabeza del nervio óptico hacia la ora serrata que tiene 300 μm de longitud. Haga clic en la herramienta Pincel en la barra de tareas Fiji ImageJ y haga clic en el final de la línea de 300 μm para marcarla.
    3. Mida el espesor del EPR en cada intervalo marcado. Haga clic en el icono Recto en la barra de tareas de Fiji ImageJ. Haga clic y arrastre una línea desde la parte superior hasta la inferior del RPE (Figura complementaria 6). Haga clic en Analizar > medida en la barra de menú Fiji ImageJ para obtener el grosor del EPR.
    4. Transfiera las mediciones de espesor del EPR a una hoja de cálculo y etiquete la columna que contiene las mediciones con la identificación del ratón. Etiquete una columna adicional con 'Intervalo marcado' e ingrese la distancia lejos de los valores del nervio óptico (es decir, 300, 600, 900, etc.)
       NOTA: El primer intervalo medido corresponde a 300 μm de distancia del nervio óptico, el segundo intervalo medido corresponde a 600 μm de distancia, y así sucesivamente.
15. Cuantificar las tasas de incidencia de patología del EPR en función de las imágenes retinianas de cada muestra.
    1. Abra el programa Fiji ImageJ.
    2. Abra la aplicación Cell Counter dentro del programa Fiji ImageJ. Haga clic en Plugins > Analyze > Cell Counter en la barra de menú Fiji ImageJ. Arrastre una imagen retiniana a la barra de tareas Fiji ImageJ y haga clic en Inicializar en la ventana Contador de celdas .
    3. Cuente el número de patologías de EPR por sección retiniana utilizando la aplicación Cell Counter . Haga clic en Tipo 1 en Contadores y luego haga clic en todos los eventos de microvacuolización en la imagen. Haga clic en Tipo 2 en Contadores y luego haga clic en todos los eventos de macrovacuolización en la imagen. Haga clic en Tipo 3 en Contadores y, a continuación, haga clic en todos los eventos de migración individuales de la imagen.
    4. Transfiera los números de las patologías del EPR a una hoja de cálculo. Etiquete las filas con microvacuolización, macrovacuolización o migración, y la columna con identificación del ratón.
    5. Repita los pasos 1.15.2-1.15.4 para otras imágenes del ejemplo. Promedie el número de patologías de EPR por muestra y divida por cinco para calcular la tasa de incidencia de cada patología de EPR para la muestra en la hoja de cálculo.
16. Realizar análisis estadísticos sobre los espesores del EPR en cada intervalo y las tasas de incidencia de patología del EPR para determinar si existen diferencias significativas entre los grupos del estudio.

2. Evaluación del EPR del ratón mediante microscopía electrónica de transmisión

1. Corte los otros segmentos posteriores cedidos después de los pasos 1.5-1.9 por la mitad a través de la marca superior en dos secciones con una cuchilla de afeitar. Anote el lado superior de los segmentos posteriores seccionados con un tinte de marcado de tejido. Separe los segmentos posteriores seccionados en nuevos microtubos de 2 ml que contengan 2 ml de 1x PBS e identificación del ratón.
   NOTA: El segmento posterior del ratón es demasiado grande para procesarlo en una sola pieza y debe cortarse por la mitad para el procesamiento de microscopía electrónica de transmisión.
2. Enjuagar los tejidos con 2 mL de tampón de cacodilato 0,1 M, pH 7,2. Incubar durante 10 minutos en RT en la mesa de trabajo. Repita este paso dos veces más.
3. Reemplace el tampón de cacodilato 0.1 M con 2 ml de tetróxido de osmio al 2% (OsO₄) diluido en tampón de cacodilato 0.1 M. Incubar durante 1,5 h a RT en la campana extractora.
   PRECAUCIÓN: OsO₄ es una sustancia venenosa. Siga los procedimientos operativos estándar cuando trabaje con OsO₄.
4. Enjuague los tejidos con 2 ml de tampón de cacodilato 0,1 M durante 10 min a RT en la campana extractora. Repita este paso una vez.
5. Deshidratar los tejidos con diluciones graduadas de EtOH que van del 50% al 100% a RT en la campana extractora. Un protocolo para el procedimiento de deshidratación se puede encontrar en la Figura Suplementaria 7.
6. Retire el 100% de EtOH de los tejidos y agregue 2 ml de óxido de propileno a los tejidos. Incubar a RT en la campana extractora durante 15 min. Retire el óxido de propileno de los tejidos y agregue 2 ml de óxido de propileno fresco a los tejidos. Incubar a RT en la campana extractora durante 15 min.
   PRECAUCIÓN: El óxido de propileno es una sustancia tóxica. Siga los procedimientos operativos estándar cuando trabaje con óxido de propileno.
7. Retire el óxido de propileno de los tejidos y agregue 2 ml de una mezcla 1: 1 de óxido de propileno y resina a los tejidos. Dejar pasar la noche al vacío en la campana extractora de RT.
   PRECAUCIÓN: La resina es una sustancia peligrosa para los seres humanos. Siga los procedimientos operativos estándar del laboratorio cuando trabaje con resina.
8. Reemplace la mezcla 1:1 de óxido de propileno y resina de los tejidos con 2 ml de resina pura. Dejar toda la noche bajo una aspiradora en la campana extractora en RT .
9. Incrustar los tejidos en resina. Coloque una etiqueta con la identificación del ratón a lápiz y una gota de resina en el molde. Coloque el tejido sobre la gota de resina. Llenar el molde con resina y colocar al vacío durante 1 h a RT en la campana extractora.
10. Vuelva a colocar las etiquetas y las muestras con pinzas de punta fina, con la parte posterior de la sección del ocular posterior en la parte superior. Dejar el molde toda la noche a 65 °C en un horno en la campana extractora.
11. Retire los moldes del horno. Deje que los moldes se enfríen a RT en la mesa de trabajo. Retire los bloques de los moldes.
    NOTA: Los bloques ya están listos para recortar.
12. Da forma a los bloques de resina con una cuchilla de afeitar para formar un trapezoide. Recorte los bloques de resina con un micrótomo hasta que la cabeza del nervio óptico sea visible. Proceda a utilizar un cuchillo de diamante para cortar secciones semifinas de los bloques de resina con un grosor de 0,5 μm.
    NOTA: Aquí hay un protocolo publicado sobre la sección de microtomótomos²⁷. Si se desea, se pueden recolectar y teñir secciones semidelgadas de 0,5 μm de espesor de los bloques de resina para evaluar la integridad de la muestra.
13. Corte una sección ultrafina de 70 nm de espesor de cada bloque recortado con un ultramicrótomo. Recolecte una sección ultrafina de 70 nm de espesor en una rejilla de cobre de barra delgada de 400 mallas. Coloque la cuadrícula en una caja de almacenamiento de cuadrícula y etiquete la ranura con la identificación del mouse.
    NOTA: Aquí hay un protocolo publicado sobre la sección de ultramicrotomo²⁸.
14. Manchar las rejillas con acetato de uranilo al 2% durante 5 min y luego con solución de citrato de plomo al 3,5% durante 5 min a RT en la campana extractora.
    PRECAUCIÓN: El acetato de uranilo y el citrato de plomo son sustancias peligrosas. Siga los procedimientos operativos estándar cuando trabaje con estas sustancias.
15. Obtenga imágenes para cada muestra utilizando un microscopio electrónico de transmisión con un aumento de 15.000x, donde las líneas de cuadrícula de la rejilla de cobre intersecan el RPE y BrM.
    NOTA: Debe haber al menos 20 a 35 imágenes por sección y 40 a 70 imágenes por muestra.
16. Cuantificar las alturas de BLamD en las imágenes de las muestras del estudio.
    1. Abra el programa Fiji ImageJ. Arrastre todas las imágenes de la sección de ejemplo a la barra de tareas Fiji ImageJ. Verifique que las imágenes estén calibradas en μm y no en píxeles.
    2. Mide la altura de BLamD en las imágenes. Haga clic en el icono Recto de la barra de tareas Fiji ImageJ. Haga clic y arrastre una línea desde la lámina elástica de BrM hasta la parte superior del depósito más alto de la imagen (Figura suplementaria 8). Haga clic en Analizar > medida en la barra de menús Fiji ImageJ para obtener la altura de BLamD en la imagen.
       NOTA: Si no hay BLamD en la imagen, dibuje una línea desde la lámina elástica de BrM hasta la lámina basal del EPR.
    3. Transfiera las alturas de BLamD a una hoja de cálculo y una etiqueta con identificación del ratón.
17. Calcule las frecuencias acumuladas de alturas de BLamD por genotipo y los promedios de alturas de BLamD por ratón en la hoja de cálculo. Realizar análisis estadísticos sobre los promedios de las alturas de BLamD para determinar si existen diferencias significativas entre los grupos en el estudio.

3. Evaluación del EPR del ratón mediante microscopía confocal

1. Recoge los ojos de los ratones. Eutanasia a los ratones de acuerdo con el procedimiento descrito en el paso 1.3. Nuclear los ojos usando el paso 1.5. Coloque los ojos usando fórceps curvos en un microtubo de 2 ml con 2 ml de PBS 1x e identificación del ratón.
   NOTA: No adapte la oscuridad de los ratones, ya que la interdigitalización de los fotorreceptores y los procesos apicales del EPR permite una mejor visualización del EPR a través de microscopía confocal.
2. Limpie y disecte los ojos del ratón inmediatamente para generar oculares posteriores del ratón.
   NOTA: El ocular posterior es diferente del segmento posterior porque no contiene la retina neural.
   1. Transfiera el ojo a una placa de Petri que contenga 1x PBS bajo un microscopio de disección (Figura suplementaria 9A).
   2. Eliminar la grasa y el músculo del globo ocular, como se describe en el paso 1.8.2 (Figura complementaria 9B).
   3. Corta la córnea del globo ocular con una hoja de bisturí número 11. Extraer la córnea y el iris, como se detalla en el paso 1.8.3 (Figura complementaria 9C).
   4. Saque la lente con pinzas de punta fina. Tome dos pinzas de punta fina y separe suavemente la retina neural del segmento posterior.
   5. Corte cuidadosamente la retina neural en la cabeza del nervio óptico para extraerla del ocular posterior (Figura suplementaria 9D).
   6. Coloque el ocular posterior en un nuevo microtubo de 2 ml que contenga 500 μL de 1x PBS con identificación de ratón.
3. Fijar los oculares posteriores con metanol (MeOH) (Figura complementaria 10).
   NOTA: El paso 3.3 tarda aproximadamente 2 h y 40 minutos en completarse.
   1. Añadir 500 μL de MeOH a los tejidos. Incubar en una agitadora a 75 rpm durante 5 min a RT.
   2. Retire los 500 μL de solución de los tejidos y agregue 500 μL de MeOH. Incubar durante 5 min en una coctelera a 75 rpm durante 5 min en RT. Repita este paso una vez más.
   3. Retire toda la solución de los tejidos y agregue 500 μL de MeOH. Incubar en una agitadora a 75 rpm durante al menos 2 h a RT.
      NOTA: Como alternativa al paso 3.3.3, el ocular posterior puede incubarse durante la noche en MeOH en un agitador a 75 rpm en una habitación a 4 °C.
   4. Agregue 500 μL de 1x PBS a los tejidos. Incubar en una agitadora a 75 rpm durante 5 min a RT.
   5. Retire los 500 μL de solución de los tejidos y agregue 500 μL de 1x PBS. Incubar en una coctelera a 75 rpm durante 5 min a RT. Repita este paso una vez más.
   6. Retire toda la solución de los tejidos y reemplácela con 500 μL de 1x PBS.
      NOTA: Los tejidos están completamente fijados por el MeOH y se pueden mantener en un refrigerador a 4 °C durante al menos 1 mes.
4. Realizar tinción por inmunofluorescencia de los oculares posteriores para visualizar uniones estrechas y núcleos del EPR (Figura complementaria 11).
   1. Retire los 500 μL de 1x PBS de las muestras y agregue 100 μL de suero de burro normal diluido al 10% en 1x solución de PBS. Incubar en un agitador a 75 rpm durante 30 min a RT.
   2. Retirar de las muestras la solución diluida de suero de burro normal al 10% y añadir 100 μL de una dilución 1:50 de un anticuerpo policlonal anti-Zonula Occludens-1 (ZO-1) de conejo en 1x PBS. Transfiera las muestras a una habitación a 4 °C e incube durante la noche en un agitador a 75 rpm.
   3. Retire la dilución de anticuerpos de las muestras y agregue 2 ml de 1x PBS. Incubar en una coctelera a 75 rpm durante 10 min a RT. Repita este paso dos veces más.
   4. Elimine el PBS 1x de las muestras. Agregue 100 μL de una dilución 1:250 de un anticuerpo IgG anti-conejo burro con una etiqueta conjugada con fluoróforos 488 y una dilución 1:250 de diclorhidrato de 4',6-Diamidina-2'-fenilindol (DAPI) en 1x PBS a las muestras. Cubrir las muestras con papel de aluminio e incubar en un agitador a 75 rpm durante 2 h a RT.
      NOTA: Las muestras deben estar completamente cubiertas con papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo.
   5. Retire las diluciones de anticuerpos y DAPI de las muestras. Agregue 2 ml de 1x PBS a las muestras, vuelva a cubrir con papel de aluminio e incube en un agitador a 75 rpm durante 10 minutos a RT. Repita este paso tres veces más.
      NOTA: Las uniones estrechas y los núcleos del EPR ahora están completamente etiquetados y teñidos, respectivamente.
5. Monte los oculares posteriores en portaobjetos de microscopio.
   1. Etiquete un portaobjetos de microscopio con identificación del ratón. Transfiera el ocular posterior a un portaobjetos de microscopio bajo un microscopio de disección con el lado coroideo hacia abajo. Agregue una gota de 1x PBS al ocular posterior para evitar que se seque (Figura complementaria 12).
   2. Corte el ocular posterior con una hoja de bisturí número 11 en cuatro puntos que producirán cuatro cuadrantes correspondientes a las direcciones cardinales (es decir, norte, este, sur y oeste). Frote el exceso 1x PBS con tejido del perímetro del ocular posterior. Aplanar suavemente el ocular posterior con un cepillo para el pelo de camello y pinzas de punta fina (Figura suplementaria 12).
      NOTA: El producto resultante ahora se conoce como montaje plano RPE.
   3. Agregue una gota de medio de montaje al soporte plano RPE y coloque un cubreobjetos encima. Aplique esmalte de uñas transparente para sellar el cubreobjetos y deje que se seque durante al menos 30 minutos en RT en un cajón cerrado. Coloque las guías en una caja portacorrederas y guárdela en un refrigerador a 4 °C.
      NOTA: Tenga cuidado de evitar la introducción de burbujas en el soporte plano RPE. Los soportes planos RPE se pueden visualizar dentro de un marco de tiempo de 2 semanas.
6. Obtenga una imagen de cada uno de los cuatro cuadrantes que rodean el nervio óptico del montaje plano del EPR en un microscopio confocal con un aumento de 20x para cada muestra. Un ejemplo de una imagen de montaje plano RPE se puede encontrar en la Figura suplementaria 13A.
   NOTA: Puede ser necesario realizar imágenes de pila z de los soportes planos de RPE donde se toman y apilan varias imágenes para compensar las diferencias dimensionales del montaje plano de RPE.
7. Trace las uniones estrechas de las celdas RPE dentro de cada imagen de montaje plano de RPE. Un ejemplo de una imagen de montaje plano RPE trazada se puede encontrar en la Figura Suplementaria 13B.
   1. Abra el programa Fiji ImageJ. Arrastre una imagen de montaje plano RPE a la barra de tareas Fiji ImageJ. Verifique que la imagen esté calibrada en micrómetros y no en píxeles.
   2. Haga doble clic en el icono Superposición de la herramienta Pincel en la barra de tareas Fiji ImageJ para establecer el ancho del pincel en 3, la transparencia en 0 y el color en rojo. Haga clic en el botón Cerrar de la ventana Herramienta Pincel superpuesto .
   3. Haga clic en el icono Overlay Brush Tool . Haga clic y arrastre en las uniones estrechas de todas las celdas RPE que están completamente dentro de la imagen.
      NOTA: En caso de que se cometa un error de rastreo, haga doble clic en el icono de la herramienta Pincel superpuesto y haga clic en el cuadro Deshacer en la ventana Herramienta Pincel superpuesto para eliminar el error de trazado de la imagen.
   4. Haga clic en el icono Rectángulo de la barra de tareas Fiji ImageJ. Haga clic en la imagen y arrastre alrededor del perímetro de la imagen. Haga clic en Editar > Borrar en la barra de menús Fiji ImageJ para mantener las líneas trazadas y eliminar los colores azul y verde de la imagen.
   5. Guarde la imagen de seguimiento en una ubicación adecuada con identificación del mouse, ubicación del cuadrante (es decir, norte, sur, este u oeste) y una etiqueta de sufijo CP.
      NOTA: No guarde la imagen de seguimiento de RPE antes de completar el paso 3.7.4.
8. Calcule las áreas de celda RPE para cada muestra.
   1. Designe una ubicación para guardar los archivos del análisis de área RPE creando una carpeta en la pantalla del escritorio del equipo. Genere subcarpetas para cada imagen de seguimiento de RPE y etiquete las subcarpetas con la identificación del mouse, así como la ubicación del cuadrante (es decir, norte, sur, este u oeste).
   2. Instale y abra el programa Cell Profiler²⁹. Descargue el archivo de proyecto Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj (Archivo de codificación suplementario 1). Abra el archivo Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj haciendo clic en Archivo > Abrir proyecto en la barra de menús del programa Cell Profiler.
   3. Arrastre una imagen de seguimiento RPE al cuadro Imagen > Colocar archivos y carpetas aquí en la ventana del programa Cell Profiler.
   4. Introduzca la ubicación de la carpeta en el programa Cell Profiler que corresponde a la imagen de seguimiento RPE. Haga clic en el botón Configuración de salida en la esquina inferior izquierda de la ventana del programa Cell Profiler e ingrese la ubicación de la carpeta en los cuadros de texto Carpeta de entrada predeterminada y Carpeta de salida predeterminada .
   5. Haga clic en el botón Analizar imágenes en la esquina inferior izquierda de la ventana del programa Cell Profiler. Una vez completado el análisis, aparecerá una ventana Análisis completo en la pantalla. Haga clic en el botón Aceptar en la ventana Análisis completo .
      NOTA: Esta acción generará un archivo csv y una imagen jpeg. El archivo csv contendrá las áreas para las celdas RPE dentro de la imagen de seguimiento. La imagen jpeg corresponderá a la imagen de traza RPE, donde cada celda RPE se etiquetará con un número (Figura suplementaria 13C).
   6. Transfiera las áreas RPE del archivo csv a una hoja de cálculo. Etiqueta la hoja de cálculo con la identificación del ratón.
   7. Realice una encuesta de control de calidad de los datos confirmando que cada área de RPE en el archivo csv se vincula a una celda RPE completamente trazada en una imagen jpeg. Quite los valores de la hoja de cálculo que no correspondan a las celdas RPE con seguimiento completo.
   8. Vuelva al programa Cell Profiler. Haga clic con el botón secundario en el nombre de la imagen de seguimiento RPE en el cuadro Colocar archivos y carpetas aquí y seleccione Borrar la lista para quitar la imagen del programa Cell Profiler.
   9. Repita los pasos 3.8.3-3.8.8 para calcular los tamaños de EPR para las tres imágenes de trazas de EPR restantes de la muestra.
9. Cuantifique los promedios de tamaño de celda RPE para cada muestra en la hoja de cálculo.
10. Cuantifique las densidades de celda RPE para cada muestra en la hoja de cálculo. Para calcular la densidad de células del EPR, divida el número total de células del EPR por cuadrante por el área total de células del EPR por cuadrante detectadas por el programa del Generador de perfiles de células. Determine el promedio de las densidades de células RPE de los cuatro cuadrantes por muestra.
11. Cuantificar el número de células RPE multinucleadas por montaje plano de RPE para cada muestra. Utilice la aplicación Cell Counter dentro del programa Fiji ImageJ, como se describe en los pasos 1.15.1-1.15.3, para contar el número de células RPE con más de tres núcleos en cuatro cuadrantes de la muestra.
12. Realizar análisis estadísticos sobre el tamaño de las células del EPR y los promedios de densidad, así como el número de células del EPR multinucleadas para determinar si existen diferencias significativas entre los grupos del estudio.

Resultados

La finalización del protocolo de fenotipado del EPR descrito en este artículo proporciona un análisis cuantitativo de las anomalías estructurales del EPR comúnmente observadas en modelos de ratón de DMAE. Para confirmar la efectividad de este protocolo, lo utilizamos en ratones que se sabe que presentan patologías del EPR, incluidos los ratones transgénicos que sobreexpresan WT Tmem135 impulsado por el promotor de beta-actina de pollo (Tmem135 TG)30 y ratones C57BL / 6J envejecidos

Discusión

En este artículo, presentamos un protocolo de fenotipado para evaluar las patologías estructurales del EPR de modelos de ratón. Describimos los pasos necesarios para procesar los ojos para diversas técnicas de imagen, incluida la luz, el electrón de transmisión y la microscopía confocal, así como la cuantificación de patologías típicas observadas a través de estos métodos de imagen. Demostramos la efectividad de nuestro protocolo de fenotipado de EPR examinando ratones Tmem135 TG y WT de 24...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2	PolyScientiifc R&D Company	S1619
100 Capacity Slide Box			Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol	MDS Warehouse	2292-CASE	Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks	Qosina	11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS)			Premade 1x PBS can be used in this protocol.
2.0 mL microtubes	Genesee Scientific	24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold	Electron Microscopy Sciences	70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends	Fisher Scientific	NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids	Electron Microscopy Sciences	T400-Cu
95% Ethanol	MDS Warehouse	2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches)	VWR	56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle	VWR	23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle	Sigma-Aldrich	Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width	Roboz Surgical Instrument	RS-5211	Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush	Electron Microscopy Sciences	65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps	Fisher Scientific	05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand	Fisher Scientific	11-474-207
Cell Prolifer Program			Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish	Electron Microscopy Sciences	72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender	VWR	10118-956
Computer
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-5MG
Distilled H20			Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55	Roboz Surgical Instrument	RS-4984	Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder	Electron Microscopy Sciences	71147-01
EPON 815 Resin	Electron Microscopy Sciences	14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye	Fisher Scientific	22050460	Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye.
Epredia Mounting Media	Fisher Scientific	22-110-610	Use for mounting H&E slides.
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source	Dolan-Jenner Industries	Mi-150	Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program			Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector	Thermo Scientific	14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32%	Electron Microscopy Sciences	16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker			Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels	Electron Microscopy Sciences	77564-05
Lead Citrate	Electron Microscopy Sciences	17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips	Thermo Fisher Scientific	22X22I24788001LS	Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin	VWR	100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5600	Known as micro-dissecting scissors in protocol.
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
Mice			Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length	Roboz Surgical Instrument	RS-5913	Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum	SouthernBiotech	0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades	VWR	21909-380
Osmium Tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Pencil
Petri Dish	VWR	21909-380
Pipette Tips
Pipettes
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody	Thermo Fisher Scientific	402200
Propylene Oxide	Electron Microscopy Sciences	20412
Razor Blade	VWR	10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic	VWR	89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker	Staples	642736
Slide Rack for Staining	Grainger	49WF31
Squared Cover Glass Slips	Fisher Scientific	12-541B
Staining Dish with Cover	Grainger	49WF30	Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe	Thermo Scientific	S7510-50	Use only the syringe barrel.
Timer	Fisher	1464917
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Use for mounting RPE flat mounts.
Xylene	Fisher Scientific	22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope			This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching.
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope	Electron Microscopy Sciences	65575-02