Protocolo para Avaliação e Quantificação de Patologias do Epitélio Pigmentado da Retina em Modelos Murinos de Degeneração Macular Relacionada à Idade

Resumo

Modelos murinos podem ser ferramentas úteis para investigar a biologia do epitélio pigmentado da retina (EPR). Foi estabelecido que camundongos podem desenvolver uma série de patologias do EPR. Aqui, descrevemos um protocolo de fenotipagem para elucidar e quantificar patologias do EPR em camundongos usando microscopia de luz, elétron de transmissão e confocal.

Resumo

A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é uma doença debilitante da retina em populações envelhecidas. Acredita-se que a disfunção do epitélio pigmentado da retina (EPR) seja um evento patobiológico chave na DMRI. Para entender os mecanismos que levam à disfunção do EPR, modelos de camundongos podem ser utilizados por pesquisadores. Foi estabelecido por estudos anteriores que camundongos podem desenvolver patologias do EPR, algumas das quais são observadas nos olhos de indivíduos diagnosticados com DMRI. Descrevemos um protocolo de fenotipagem para avaliar patologias do EPR em camundongos. Este protocolo inclui a preparação e avaliação de cortes transversais da retina usando microscopia de luz e microscopia eletrônica de transmissão, bem como de montagens planas de EPR por microscopia confocal. Detalhamos os tipos comuns de patologias murinas do EPR observadas por essas técnicas e formas de quantificá-las através de métodos imparciais para testes estatísticos. Como prova de conceito, usamos este protocolo de fenotipagem do EPR para quantificar as patologias do EPR observadas em camundongos superexpressando a proteína transmembrana 135 (Tmem135) e camundongos selvagens C57BL/6J envelhecidos. O principal objetivo deste protocolo é apresentar métodos padrão de fenotipagem da PSE com avaliações quantitativas imparciais para cientistas usando modelos de DMRI em camundongos.

Introdução

A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é uma doença cegante comum que afeta populações acima de 55 anos^1. Muitos pesquisadores acreditam que a disfunção dentro do epitélio pigmentado da retina (PSE) é um evento patobiológico precoce e crucial na DMRI². O EPR é uma monocamada de células polarizadas encarregada de manter a homeostase dos fotorreceptores vizinhos e dos vasos sanguíneos de coroide³. Existe uma variedade de modelos para investigar mecanismos associados à doença dentro do EPR, incluindo modelos de cultura de células^4,5 e camundongos 6,7,8. Um relatório recente descreveu protocolos padronizados e critérios de controle de qualidade para modelos de cultura de células PSE⁴, mas nenhum relato tentou padronizar a fenotipagem do EPR em modelos de camundongos. De fato, muitas publicações sobre modelos de camundongos com DMRI carecem de uma descrição completa do EPR ou quantificação das patologias do EPR neles. O objetivo geral deste protocolo é apresentar métodos padrão de fenotipagem de EPR com avaliações quantitativas imparciais para cientistas usando modelos de camundongos com DMRI.

Publicações anteriores observaram a presença de várias patologias do EPR em camundongos através de três técnicas de imagem. Por exemplo, a microscopia de luz permite aos pesquisadores visualizar a morfologia macroscópica da retina murina (Figura 1A) e detectar patologias do EPR, como afinamento do EPR, vacuolização e migração. O afinamento do EPR em um modelo de mouse AMD é exemplificado por um desvio na altura do EPR em relação aos seus respectivos controles (Figura 1B). A vacuolização do EPR pode ser dividida em duas categorias distintas: microvacuolização (Figura 1C) e macrovacuolização (Figura 1D). A microvacuolização do EPR é resumida pela presença de vacúolos no EPR que não afetam sua altura total, enquanto a macrovacuolização é indicada pela presença de vacúolos que se projetam para os segmentos externos dos fotorreceptores. A migração do EPR é distinguida pelo agregado focal de pigmento acima da monocamada do EPR em um corte transversal da retina (Figura 1E). Deve-se ressaltar que as células migratórias do EPR em olhos de doadores de DMRI exibem imunorreatividade a marcadores de células imunes, como o cluster de diferenciação 68 (CD68)⁹, e poderiam representar células imunes engolindo restos de EPR ou EPR em transdiferenciação9. Outra técnica de imagem chamada microscopia eletrônica de transmissão pode permitir ao pesquisador visualizar a ultraestrutura do EPR e sua membrana basal (Figura 2A). Essa técnica pode identificar o depósito sub-PSE predominante em camundongos, conhecido como depósito laminar basal (BLamD) (Figura 2B)¹⁰. Por fim, a microscopia confocal pode revelar a estrutura das células do EPR por meio de imagens de suportes planos do EPR (Figura 3A). Esse método pode revelar a dismorfia do EPR, o desvio do EPR de sua forma clássica em favo de mel (Figura 3B). Também pode detectar multinucleação do EPR, a presença de três ou mais núcleos dentro de uma célula do EPR (Figura 3C). Para um resumo dos tipos de patologias do EPR presentes nos modelos atuais de camundongos com DMRI, remetemos os pesquisadores para essas revisões da literatura ^6,7.

Os pesquisadores que estudam a DMRI devem estar cientes das vantagens e desvantagens do uso de camundongos para investigar patologias do EPR antes do protocolo de fenotipagem. Os camundongos são vantajosos por causa de sua vida útil relativamente curta e custo-efetividade, bem como sua manipulabilidade genética e farmacológica. Camundongos também exibem alterações degenerativas do EPR, incluindo migração do EPR, dismorfia e multinucleação, que são observadas em olhos de doadores de DMRI11,12,13,14,15,16,17; isso sugere que mecanismos semelhantes podem estar subjacentes ao desenvolvimento dessas patologias do EPR em camundongos e humanos. No entanto, existem diferenças fundamentais que limitam a traduzibilidade de estudos em camundongos para DMRI humana. Primeiro, os camundongos não têm mácula, uma região anatomicamente distinta da retina humana necessária para a acuidade visual que é preferencialmente afetada na DMRI. Em segundo lugar, algumas patologias do EPR em camundongos, como afinamento e vacuolização do EPR, não são tipicamente vistas em olhos de doadores de DMRI¹⁸. Terceiro, camundongos não desenvolvem drusa, uma característica da patologia da DMRI¹⁹. Drusen são depósitos contendo lipídios e proteínas com pouquíssimas proteínas da membrana basal que se formam entre a lâmina basal do EPR e a camada colágena interna da membrana de Bruch (BrM)¹⁹. Drusen diferem de BLamD, o depósito comum de sub-PSE em camundongos, tanto em sua composição quanto em sua localização anatômica. Os BLamDs são anormalidades enriquecidas com matriz extracelular dependentes da idade e do estresse que se formam entre a lâmina basal do EPR do BrM e os infoldings basais do EPR²⁰. Curiosamente, os BLamDs têm composição e aparência proteica semelhantes em camundongos e humanos ^6,10,21. Trabalhos recentes sugerem que os BLamDs podem atuar na patobiologia da DMRI, influenciando a progressão da DMRI para seus estágios mais avançados^18,22; portanto, esses depósitos podem representar EPR doente na retina de camundongos. O conhecimento desses benefícios e limitações é fundamental para pesquisadores interessados em traduzir resultados de estudos em camundongos para a DMRI.

Neste protocolo, discutimos os métodos de preparação dos olhos para luz, elétrons de transmissão e microscopia confocal para visualização de patologias do EPR. Também descrevemos como quantificar patologias do EPR de forma imparcial para testes estatísticos. Como prova de conceito, utilizamos o protocolo de fenotipagem do EPR para investigar as patologias estruturais do EPR observadas em camundongos superexpressando a proteína transmembrana 135- (Tmem135) e camundongos selvagens envelhecidos (WT) C57BL/6J. Em resumo, objetivamos descrever a metodologia de fenotipagem para caracterizar a PSE em modelos de camundongos com DMRI, uma vez que atualmente não existem protocolos padronizados disponíveis. Pesquisadores interessados em examinar e quantificar patologias dos fotorreceptores ou coroides, que também são afetadas em modelos de camundongos com DMRI, podem não achar esse protocolo útil para seus estudos.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Wisconsin-Madison, e estão em conformidade com a Declaração da Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) para o Uso de Animais em Pesquisa Oftálmica e da Visão.

1. Avaliação da PSE de camundongos por microscopia de luz

1. Fazer um tampão fixador que tenha uma concentração final de 2% de paraformaldeído e 2% de glutaraldeído à temperatura ambiente (TR) em um frasco de vidro.
   NOTA: Este protocolo requer, no máximo, 14 ml de tampão fixador por rato.
   CUIDADO: Paraformaldeído e glutaraldeído são substâncias perigosas. Siga os procedimentos operacionais padrão ao trabalhar com essas substâncias.
2. Preparar um sistema de perfusão por gravidade em uma almofada absorvente para perfusão cardíaca em uma capela de fumaça (Figura 1A suplementar).
   1. Colocar 40 mL do tampão fixador no barril da seringa do sistema de perfusão (Figura 1B suplementar).
   2. Gire a válvula até que ela fique paralela à linha de tubulação para permitir que o tampão flua através da linha de tubulação (Figura suplementar 1C). Lave a linha com tampão até que todas as bolhas de ar sejam removidas da linha.
   3. Gire a válvula até que ela esteja perpendicular à linha de tubulação para impedir que o tampão flua para a linha de tubulação (Figura 1D Suplementar).
      NOTA: O sistema de perfusão já está pronto para uso.
3. Eutanasiar o camundongo colocando-o em uma câmara de dióxido de carbono (CO 2) e permitir que o CO₂ flua para a câmara a uma taxa de fluxo de 30% do volume da câmara por minuto. Quando o rato parar de respirar, deixe o CO₂ fluir para a câmara durante pelo menos 1 minuto. Verifique se o mouse está morto antes de avançar para a próxima etapa.
   NOTA: A eutanásia através da injeção de agentes farmacológicos pode ser utilizada neste protocolo como alternativa à inalação de CO₂ .
4. Realizar perfusão cardíaca no camundongo eutanasiado.
   1. Transfira o mouse para uma bandeja rasa perto do sistema de perfusão com o abdome voltado para cima. Borrifar o abdome com etanol 70% (EtOH).
   2. Realizar quatro incisões para exposição da cavidade abdominal (Figura 2A Suplementar).
      1. Crie um corte inferior de 5 cm usando tesoura curva e pinça através da pele e da parede abdominal no lado esquerdo mais distante do mouse que está diretamente abaixo da caixa torácica.
      2. Proceder a um corte medial de 3 cm através da pele e parede abdominal do rato que começa no topo do corte inferior.
      3. Faça outro corte inferior de 5 cm na extremidade do corte medial através da pele e da parede abdominal no lado direito mais distante do mouse diretamente abaixo da caixa torácica.
      4. Realizar outra incisão medial de 3 cm para retirada do retalho cutâneo abdominal com pinça curva.
   3. Cortar o diafragma e o esterno para expor o coração (Figura 2B suplementar).
      NOTA: Tenha cuidado para evitar cortar o coração, artérias e veias. Nicking estes levará a uma perfusão cardíaca ineficiente.
   4. Insira a agulha do calibre no ventrículo esquerdo do coração. Gire a válvula até que ela fique paralela à linha da tubulação. Cortar o átrio direito com tesoura curva para permitir a saída de sangue e fixador do coração (Figura 2C suplementar).
   5. Deixe 10 mL de tampão fixador penetrar no camundongo por pelo menos 1-2 min, ou até que o fígado fique pálido e nenhum sangue flua para fora do átrio direito. Quando a perfusão estiver completa, gire a válvula até que ela esteja perpendicular à linha de tubulação para interromper o fluxo do tampão.
5. Enuclear os olhos do camundongo após a perfusão cardíaca.
   1. Remova o mouse da bandeja rasa e coloque-o na parte inferior do absorvente em um exaustor. Orientar a cabeça do rato de tal forma que o olho esquerdo esteja virado para o experimentador e o olho direito esteja fora de vista. Anote o lado superior do olho com um corante de marcação de tecido.
   2. Empurre suavemente para baixo com o polegar e o indicador ao redor da cavidade ocular para causar protrusão do olho a partir da cavidade ocular (Figura 3A suplementar).
   3. Pegue uma tesoura curva e segure-a com a lâmina em um ângulo de 30° da cavidade ocular. Proceder ao corte ao redor do olho com a tesoura curva em um ângulo de 30° (Figura 3B Suplementar).
      NOTA: Não há problema em cortar o excesso de tecido da cavidade ocular para preservar a integridade do globo ocular.
   4. Retire o globo ocular da cabeça com pinça curva e coloque-o em uma almofada absorvente. Corte a córnea com uma lâmina de bisturi número 11 e coloque o olho com pinça curva em um microtubo de 2 mL com 2 mL de tampão fixador. Rotular o microtubo de 2 mL com identificação do mouse e 'esquerda' para indicar o olho esquerdo.
      NOTA: O nick na córnea permite que o fixador penetre prontamente no olho para melhor preservá-lo.
   5. Repita as etapas 1.5.1-1.5.4 para o olho direito.
6. Deixe os olhos incubarem em tampão fixador durante a noite em um agitador em uma sala de 4 °Celsius (C), a uma velocidade de 75 rotações por minuto (rpm).
7. Substitua o tampão fixador por 2 mL de solução salina tampão fosfato (PBS) 1x. Incubar os olhos em 1x PBS por 10 min em um agitador a RT e 75 rpm. Repita esta etapa duas vezes.
8. Limpar e dissecar os olhos para gerar segmentos posteriores.
   NOTA: O segmento posterior é o globo ocular do camundongo com a retina neural, PSE, coroide e esclera sem córnea, íris e lente.
   1. Coloque o olho em uma placa de Petri preenchida com 1x PBS sob um microscópio dissecante (Figura 4A suplementar).
   2. Levante suavemente qualquer gordura e músculo para longe do globo ocular com pinças de ponta fina. Aparar cuidadosamente a gordura e o músculo com uma tesoura microdissecante em direção paralela ao globo ocular até que o globo ocular tenha uma cor preto-azulada uniforme (Figura 4B Suplementar).
      OBS: Não corte no sentido perpendicular, pois isso danifica o globo ocular. Além disso, se o corante de marcação de tecido sair durante o processamento, reanote o lado superior do globo ocular imediatamente.
   3. Coloque pinça de ponta fina no local da punção corneana. Corte ao redor do perímetro da córnea, iniciando-se no local da punção, com tesoura microdissecante, para retirada da córnea e íris do globo ocular (Figura 4C Suplementar).
   4. Pegue a pinça de ponta fina e remova suavemente a lente do globo ocular para obter o segmento posterior (Figura 4D Suplementar).
   5. Coloque o segmento posterior novamente em um microtubo de 2 mL com 2 mL de PBS 1x. Conservar o segmento posterior num frigorífico a 4 °C.
      NOTA: Os segmentos posteriores podem permanecer em 1x PBS a 4 °C por muitas semanas antes do processamento adicional.
9. Repita os passos 1.3-1.8 para preparar os olhos de outros ratos no estudo.
10. Processar e incorporar um dos segmentos posteriores de cada camundongo em parafina para seccionamento. Certifique-se de que o lado superior do segmento posterior esteja na parte superior.
    NOTA: Os autores confiam no laboratório Translational Research Initiatives in Pathology (TRIP) da Universidade de Wisconsin-Madison (UW) para realizar essas tarefas. Aqui estão publicados protocolos utilizando um método semelhante de processamento e incorporação em^{parafina23,24}.
11. Aparar e seccionar cada bloco de parafina para obter uma seção retiniana de 5 μm de espessura que inclua a cabeça do nervo óptico, bem como quatro cortes adicionais de retina de 5 μm de espessura que estejam a 250 μm de distância um do outro. Rotule os slides com a identificação do mouse e o número da seção de série (ou seja, 1, 2, 3, 4 ou 5). Armazene os slides em uma caixa de slides.
    NOTA: Os autores contam com o laboratório UW TRIP para seus serviços de secção em parafina. Aqui estão publicados protocolos utilizando método semelhante de secção em^{parafina25,26}.
12. Manchar as lâminas contendo cortes de retina com hematoxilina e eosina (H&E). Um protocolo de coloração de H&E pode ser encontrado na Figura Suplementar 5.
    NOTA: Todas as etapas do procedimento de coloração H&E devem ser concluídas em um exaustor.
13. Coletar imagens costuradas de cortes retinianos corados com H&E com uma barra de escala usando um microscópio de luz com aumento de 20x.
14. Quantificar a espessura do EPR nas imagens retinianas contendo a cabeça do nervo óptico para cada amostra.
    1. Baixe e abra o programa Fiji ImageJ. Arraste todas as imagens da retina costuradas contendo a cabeça do nervo óptico para a barra de tarefas do Fiji ImageJ. Verifique se a escala da imagem está calibrada em μm e não em pixels.
       Observação : a escala de imagem está localizada no canto superior esquerdo da janela que contém uma imagem retiniana no programa Fiji ImageJ. Se a escala estiver definida em pixels, consulte o manual de instruções do programa Fiji ImageJ para converter pixels em μm.
    2. Marque a cada intervalo de 300 μm em cada imagem desde a borda da cabeça do nervo óptico até o final da retina (ora serrata). Clique no ícone Reto na barra de tarefas do Fiji ImageJ. Clique e arraste uma linha da borda da cabeça do nervo óptico em direção à ora serrata que tem 300 μm de comprimento. Clique na ferramenta Pincel na barra de tarefas Fiji ImageJ e clique no final da linha de 300 μm para marcá-la.
    3. Meça a espessura do PSE em cada intervalo marcado. Clique no ícone Reto na barra de tarefas do Fiji ImageJ. Clique e arraste uma linha da parte superior para a inferior do RPE (Figura 6 Suplementar). Clique em Analisar > Medir na barra de menus do Fiji ImageJ para obter a espessura do PSE.
    4. Transfira as medidas de espessura de PSE para uma planilha e rotule a coluna que contém as medidas com identificação do mouse. Rotule uma coluna adicional com "Intervalo marcado" e insira a distância longe dos valores do nervo óptico (ou seja, 300, 600, 900, etc.)
       NOTA: O primeiro intervalo medido corresponde a 300 μm de distância do nervo óptico, o segundo intervalo medido corresponde a 600 μm de distância, e assim por diante.
15. Quantificar as taxas de incidência de EPR com base nas imagens retinianas de cada amostra.
    1. Abra o programa Fiji ImageJ.
    2. Abra o aplicativo Contador de células dentro do programa Fiji ImageJ. Clique em Plugins > Analisar > contador de células na barra de menus do Fiji ImageJ. Arraste uma imagem retiniana para a barra de tarefas do Fiji ImageJ e clique em Inicializar na janela Contador de células .
    3. Conte o número de patologias de EPR por seção da retina usando o aplicativo Contador de células . Clique em Tipo 1 em Contadores e, em seguida, clique em todos os eventos de microvacuolização na imagem. Clique em Tipo 2 em Contadores e, em seguida, clique em todos os eventos de macrovacuolização na imagem. Clique em Tipo 3 em Contadores e, em seguida, clique em todos os eventos de migração individuais na imagem.
    4. Transfira os números das patologias do EPR para uma planilha. Rotule as linhas com microvacuolização, macrovacuolização ou migração, e a coluna com identificação do mouse.
    5. Repita as etapas 1.15.2-1.15.4 para outras imagens da amostra. Média do número de patologias do EPR por amostra e dividir por cinco para calcular a taxa de incidência de cada patologia do EPR para a amostra da planilha.
16. Realizar análise estatística das espessuras de EPR em cada intervalo e das taxas de incidência de EPR para determinar se há diferenças significativas entre os grupos no estudo.

2. Avaliação do PSE de camundongos por microscopia eletrônica de transmissão

1. Cortar os demais segmentos posteriores cedidos após os passos 1,5-1,9 ao meio através da marcação superior em duas seções com lâmina de barbear. Reanotar a face superior dos segmentos posteriores seccionados com corante tecidual marcador. Separe os segmentos posteriores seccionados em novos microtubos de 2 mL contendo 2 mL de PBS 1x e identificação em camundongos.
   NOTA: O segmento posterior do mouse é muito grande para ser processado em uma peça e deve ser cortado ao meio para processamento de microscopia eletrônica de transmissão.
2. Enxaguar os tecidos com 2 mL de tampão cacodilato 0,1 M, pH 7,2. Incubar por 10 min em TR na bancada. Repita esta etapa mais duas vezes.
3. Substitua o tampão cacodilato 0,1 M por 2 mL de tetróxido de ósmio a 2% (OsO₄) diluído em tampão cacodilato 0,1 M. Incubar durante 1,5 h em RT no exaustor.
   CUIDADO: OsO₄ é uma substância venenosa. Siga os procedimentos operacionais padrão ao trabalhar com o OsO₄.
4. Enxaguar os tecidos com 2 mL de tampão cacodilato 0,1 M por 10 min em RT no exaustor. Repita esta etapa uma vez.
5. Desidratar os tecidos com diluições graduadas de EtOH variando de 50% a 100% em RT no exaustor. Um protocolo para o procedimento de desidratação pode ser encontrado na Figura 7 Suplementar.
6. Remover 100% de EtOH dos tecidos e adicionar 2 mL de óxido de propileno aos tecidos. Incubar em RT no exaustor durante 15 min. Remova o óxido de propileno dos tecidos e adicione 2 mL de óxido de propileno fresco aos tecidos. Incubar em RT no exaustor durante 15 min.
   CUIDADO: O óxido de propileno é uma substância tóxica. Siga os procedimentos operacionais padrão ao trabalhar com óxido de propileno.
7. Remova o óxido de propileno dos tecidos e adicione 2 mL de uma mistura 1:1 de óxido de propileno e resina aos tecidos. Deixe durante a noite sob um vácuo no exaustor de fumaça no RT.
   CUIDADO: A resina é uma substância perigosa para os seres humanos. Por favor, siga os procedimentos operacionais padrão do laboratório ao trabalhar com resina.
8. Substitua a mistura 1:1 de óxido de propileno e resina dos tecidos por 2 mL de resina pura. Deixe durante a noite sob um vácuo no exaustor de fumaça no RT .
9. Embutir os tecidos em resina. Coloque uma etiqueta com a identificação do rato a lápis e uma gota de resina no molde. Posicione o tecido sobre a gota de resina. Encha o molde com resina e coloque sob vácuo por 1 h no RT no exaustor.
10. Reposicione as etiquetas e os espécimes com pinça de ponta fina, com a face posterior da seção posterior da ocular por cima. Deixe o molde durante a noite a 65 °C em um forno no exaustor.
11. Retire as formas do forno. Deixe os moldes esfriarem para RT na bancada. Retire os blocos dos moldes.
    Observação : os blocos agora estão prontos para corte.
12. Molde os blocos de resina com uma lâmina de barbear para formar um trapézio. Corte os blocos de resina usando um micrótomo até que a cabeça do nervo óptico esteja visível. Proceder ao uso de uma faca diamantada para cortar seções semifinas dos blocos de resina com espessura de 0,5 μm.
    NOTA: Aqui está um protocolo publicado sobre micrótomo seccionamento²⁷. Se desejado, cortes semifinos de 0,5 μm de espessura dos blocos de resina podem ser coletados e corados para avaliar a integridade da amostra.
13. Corte uma seção ultrafina de 70 nm de espessura de cada bloco aparado usando um ultramicrótomo. Colete uma seção ultrafina de 70 nm de espessura em uma grade de cobre de barra fina de 400 malhas. Coloque a grade em uma caixa de armazenamento de grade e rotule o slot com identificação do mouse.
    NOTA: Aqui está um protocolo publicado sobre a secção de ultramicrótomo²⁸.
14. Manchar as grades com acetato de uranila a 2% por 5 min e, em seguida, com solução de citrato de chumbo a 3,5% por 5 min no TR no exaustor.
    CUIDADO: Acetato de uranila e citrato de chumbo são substâncias perigosas. Siga os procedimentos operacionais padrão ao trabalhar com essas substâncias.
15. Obter imagens para cada amostra usando um microscópio eletrônico de transmissão em um aumento de 15.000x, onde as linhas de grade da grade de cobre cruzam o PSE e BrM.
    NOTA: Deve haver pelo menos 20 a 35 imagens por seção e 40 a 70 imagens por amostra.
16. Quantificar as alturas dos BLamD nas imagens das amostras em estudo.
    1. Abra o programa Fiji ImageJ. Arraste todas as imagens da seção de exemplo para a barra de tarefas do Fiji ImageJ. Verifique se as imagens estão calibradas em μm e não em pixels.
    2. Meça a altura do BLamD nas imagens. Clique no ícone Reto na barra de tarefas do Fiji ImageJ. Clique e arraste uma linha da lâmina elástica de BrM até o topo do depósito mais alto da imagem (Figura 8 Suplementar). Clique em Analisar > Medir na barra de menus do Fiji ImageJ para obter a altura BLamD na imagem.
       NOTA: Se não houver BLamDs na imagem, desenhe uma linha da lâmina elástica de BrM para a lâmina basal do PSE.
    3. Transfira as alturas do BLamD para uma planilha e etiqueta com identificação do mouse.
17. Calcule as frequências cumulativas de alturas de BLamD por genótipo e médias de alturas de BLamD por mouse na planilha. Realizar análise estatística das médias das alturas dos CLMamD para determinar se há diferenças significativas entre os grupos no estudo.

3. Avaliação da PSE de camundongos através de microscopia confocal

1. Colete os olhos dos ratos. Eutanásia dos ratinhos de acordo com o procedimento descrito no passo 1.3. Enuclear os olhos usando o passo 1.5. Coloque os olhos usando pinça curva em um microtubo de 2 mL com 2 mL de PBS 1x e identificação do camundongo.
   OBS: Não adaptar os camundongos ao escuro, pois a interdigitalização dos fotorreceptores e dos processos apicais de EPR permite melhor visualização do EPR através da microscopia confocal.
2. Limpe e disseque os olhos do rato imediatamente para gerar os óculos posteriores do rato.
   OBS: A ocular posterior é diferente do segmento posterior por não conter a retina neural.
   1. Transfira o olho para uma placa de Petri contendo 1x PBS em microscópio dissecante (Figura 9A suplementar).
   2. Remover gordura e músculo do globo ocular, conforme descrito no passo 1.8.2 (Figura 9B suplementar).
   3. Nick a córnea do globo ocular com uma lâmina de bisturi número 11. Remover a córnea e a íris, conforme detalhado na etapa 1.8.3 (Figura 9C suplementar).
   4. Puxe a lente com pinças de ponta fina. Pegue duas pinças de ponta fina e separe suavemente a retina neural do segmento posterior.
   5. Cortar cuidadosamente a retina neural na cabeça do nervo óptico para remoção da ocular posterior (Figura 9D suplementar).
   6. Coloque a ocular posterior em um novo microtubo de 2 mL contendo 500 μL de 1x PBS com identificação em camundongo.
3. Fixar as oculares posteriores com metanol (MeOH) (Figura suplementar 10).
   NOTA: O passo 3.3 demora cerca de 2 h e 40 min a ser concluído.
   1. Adicionar 500 μL de MeOH aos tecidos. Incubar em um agitador a 75 rpm por 5 min em TR.
   2. Retire os 500 μL de solução dos tecidos e adicione 500 μL de MeOH. Incubar por 5 min em um agitador a 75 rpm por 5 min no RT. Repita este passo mais uma vez.
   3. Retire toda a solução dos tecidos e adicione 500 μL de MeOH. Incubar num agitador a 75 rpm durante, pelo menos, 2 h em TR.
      NOTA: Como alternativa ao passo 3.3.3, o óculos posterior pode ser incubado durante a noite em MeOH num agitador a 75 rpm numa sala a 4 °C.
   4. Adicionar 500 μL de 1x PBS aos tecidos. Incubar em um agitador a 75 rpm por 5 min em TR.
   5. Retire os 500 μL de solução dos tecidos e adicione 500 μL de 1x PBS. Incubar em um agitador a 75 rpm por 5 min no TR. Repita esta etapa mais uma vez.
   6. Retire toda a solução dos tecidos e substitua-a por 500 μL de 1x PBS.
      NOTA: Os tecidos são totalmente fixados pelo MeOH e podem ser mantidos em um refrigerador de 4 °C por pelo menos 1 mês.
4. Realizar coloração por imunofluorescência das oculares posteriores para visualização das tight junctions e núcleos do EPR (Figura 11 Suplementar).
   1. Remover os 500 μL de 1x PBS das amostras e adicionar 100 μL de soro normal diluído a 10% em solução de 1x PBS. Incubar em um agitador a 75 rpm por 30 min em TR.
   2. Retirar a solução diluída de soro normal de burro a 10% das amostras e adicionar 100 μL de uma diluição de 1:50 de um anticorpo policlonal de coelho anti-Zonula Occludens-1 (ZO-1) em 1x PBS. Transferir as amostras para uma sala a 4 °C e incubar durante a noite num agitador a 75 rpm.
   3. Retirar a diluição de anticorpos das amostras e adicionar 2 ml de PBS 1x. Incubar em um agitador a 75 rpm por 10 min no TR. Repita esta etapa mais duas vezes.
   4. Remova o PBS 1x das amostras. Adicionar 100 μL de uma diluição de 1:250 de um anticorpo IgG anti-coelho de burro com um tag conjugado com 488 fluoróforos e uma diluição de 1:250 de 4',6-Diamidina-2'-dicloridrato de fenilindol (DAPI) em 1x PBS às amostras. Cubra as amostras com papel alumínio e incube em um agitador a 75 rpm por 2 h no TR.
      NOTA: As amostras devem ser completamente cobertas com papel alumínio para evitar o fotobranqueamento.
   5. Remover as diluições de anticorpos e DAPI das amostras. Adicione 2 mL de 1x PBS às amostras, cubra novamente com papel alumínio e incube em um agitador a 75 rpm por 10 min no TR. Repita esta etapa mais três vezes.
      NOTA: As tight junctions e os núcleos do EPR estão agora totalmente marcados e corados, respectivamente.
5. Monte as oculares posteriores em lâminas de microscópio.
   1. Rotule uma lâmina de microscópio com identificação do mouse. Transfira a ocular posterior para uma lâmina de microscópio sob um microscópio dissecante com o lado coroidal voltado para baixo. Adicione uma gota de 1x PBS ao óculos posterior para evitar que ele seque (Figura 12 suplementar).
   2. Corte a ocular posterior usando uma lâmina de bisturi número 11 em quatro pontos que produzirão quatro quadrantes correspondentes às direções cardeais (ou seja, norte, leste, sul e oeste). Dab excesso 1x PBS com tecido do perímetro da ocular posterior. Achate suavemente a ocular posterior com uma escova de cabelo camel e pinça de ponta fina (Figura 12 Suplementar).
      Observação : o produto resultante agora é conhecido como uma montagem plana RPE.
   3. Adicione uma gota de meio de montagem ao suporte plano RPE e coloque uma tampa sobre ele. Aplique esmalte de unha transparente para selar a lamínula e deixe secar por pelo menos 30 min em RT em uma gaveta fechada. Coloque as corrediças numa caixa transportadora de corrediças e guarde a caixa num frigorífico a 4 °C.
      NOTA: Tenha cuidado para evitar a introdução de bolhas no suporte plano RPE. As montagens planas RPE podem ser visualizadas dentro de um período de tempo de 2 semanas.
6. Obter uma imagem de cada um dos quatro quadrantes ao redor do nervo óptico da montagem plana do EPR em um microscópio confocal com aumento de 20x para cada amostra. Um exemplo de uma imagem de montagem plana RPE pode ser encontrado na Figura Suplementar 13A.
   NOTA: Pode ser necessário executar imagens z-stack das montagens planas RPE onde várias imagens são tiradas e empilhadas para compensar as diferenças dimensionais da montagem plana RPE.
7. Rastreie as junções apertadas das células RPE dentro de cada imagem de montagem plana RPE. Um exemplo de uma imagem de montagem plana RPE rastreada pode ser encontrado na Figura Suplementar 13B.
   1. Abra o programa Fiji ImageJ. Arraste uma imagem de montagem plana RPE para a barra de tarefas do Fiji ImageJ. Verifique se a imagem está calibrada em micrômetros e não em pixels.
   2. Clique duas vezes no ícone Overlay Brush Tool na barra de tarefas do Fiji ImageJ para definir a largura do pincel como 3, transparência como 0 e cor como vermelho. Clique no botão Fechar na janela Ferramenta Pincel de sobreposição .
   3. Clique no ícone Overlay Brush Tool . Clique e arraste nas junções apertadas de todas as células RPE que estão completamente dentro da imagem.
      Observação : no caso de um erro de rastreamento é feito, clique duas vezes no ícone Overlay Brush Tool e clique na caixa Desfazer na janela Overlay Brush Tool para remover o erro de rastreamento da imagem.
   4. Clique no ícone Retângulo na barra de tarefas do Fiji ImageJ. Clique na imagem e arraste pelo perímetro da imagem. Clique em Editar > Limpar na barra de menus do Fiji ImageJ para manter as linhas traçadas e remover as cores azul e verde da imagem.
   5. Salve a imagem de rastreamento em um local apropriado com identificação do mouse, localização do quadrante (ou seja, norte, sul, leste ou oeste) e um rótulo de sufixo CP.
      Observação : não salve a imagem de rastreamento RPE antes de concluir a etapa 3.7.4.
8. Calcule as áreas celulares do EPR para cada amostra.
   1. Designe um local para salvar os arquivos da análise da área RPE criando uma pasta na tela da área de trabalho do computador. Gere subpastas para cada imagem de rastreamento RPE e rotule as subpastas com a identificação do mouse, bem como a localização do quadrante (ou seja, norte, sul, leste ou oeste).
   2. Instale e abra o programa Cell Profiler²⁹. Baixe o arquivo de projeto Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj (Supplementary Coding File 1). Abra o arquivo Calculator.cpproj da área Ikeda_RPE clicando em Arquivo > Abrir projeto na barra de menus do programa Cell Profiler.
   3. Arraste uma imagem de rastreamento RPE para a caixa Imagem > Soltar arquivos e pastas aqui na janela do programa Cell Profiler.
   4. Insira o local da pasta no programa Cell Profiler que corresponde à imagem de rastreamento RPE. Clique no botão Configurações de saída no canto inferior esquerdo da janela do programa Cell Profiler e digite o local da pasta nas caixas de texto Pasta de entrada padrão e Pasta de saída padrão .
   5. Clique no botão Analisar imagens no canto inferior esquerdo da janela do programa Cell Profiler. Após a conclusão da análise, uma janela Análise Concluída aparecerá na tela. Clique no botão OK na janela Análise concluída .
      Observação : essa ação gerará um arquivo csv e imagem jpeg. O arquivo csv conterá as áreas para as células RPE dentro da imagem de rastreamento. A imagem jpeg corresponderá à imagem de rastreamento RPE, onde cada célula RPE será rotulada com um número (Figura Suplementar 13C).
   6. Transfira as áreas de RPE do arquivo csv para uma planilha. Rotule a planilha com a identificação do mouse.
   7. Execute uma pesquisa de controle de qualidade dos dados confirmando que cada área RPE no arquivo csv se vincula a uma célula RPE totalmente rastreada em uma imagem jpeg. Remova quaisquer valores da planilha que não correspondam a células RPE totalmente rastreadas.
   8. Retorne ao programa Cell Profiler. Clique com o botão direito do mouse no nome da imagem de rastreamento RPE na caixa Soltar arquivos e pastas aqui e selecione Limpar a lista para remover a imagem do programa Cell Profiler.
   9. Repita as etapas 3.8.3-3.8.8 para calcular os tamanhos de EPR para as três imagens de rastreamento de EPR restantes da amostra.
9. Quantifique as médias de tamanho de célula RPE para cada amostra na planilha.
10. Quantifique as densidades de células de PSE para cada amostra na planilha. Para calcular a densidade celular do EPR, divida o número total de células do EPR por quadrante pela área total de células do EPR por quadrante que foi detectada pelo programa Cell Profiler. Determinar a média das densidades celulares do EPR a partir dos quatro quadrantes por amostra.
11. Quantificar o número de células de EPR multinucleadas por montagem plana de EPR para cada amostra. Use o aplicativo Contador de células dentro do programa Fiji ImageJ, conforme descrito nas etapas 1.15.1-1.15.3, para contar o número de células RPE com mais de três núcleos em quatro quadrantes da amostra.
12. Realizar análise estatística sobre as médias de tamanho e densidade celular do EPR, bem como o número de células multinucleadas do EPR para determinar se há diferenças significativas entre os grupos no estudo.

Resultados

A conclusão do protocolo de fenotipagem da PSE descrito neste artigo fornece uma análise quantitativa das anormalidades estruturais da EPR comumente observadas em modelos murinos de DMRI. Para confirmar a eficácia desse protocolo, nós o usamos em camundongos que são conhecidos por apresentar patologias do EPR, incluindo camundongos transgênicos que superexpressam WT Tmem135 impulsionado pelo promotor de beta-actina de frango (Tmem135 TG)30 e camundongos C57BL/6J envelhecidos31,32.

Discussão

Neste artigo, apresentamos um protocolo de fenotipagem para avaliação das patologias estruturais do EPR em modelos murinos. Descrevemos as etapas necessárias para o processamento dos olhos para várias técnicas de imagem, incluindo microscopia de luz, elétron de transmissão e confocal, bem como a quantificação de patologias típicas observadas por esses métodos de imagem. Comprovamos a eficácia de nosso protocolo de fenotipagem de EPR examinando camundongos Tmem135 TG e WT de 24 meses de idade...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2	PolyScientiifc R&D Company	S1619
100 Capacity Slide Box			Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol	MDS Warehouse	2292-CASE	Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks	Qosina	11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS)			Premade 1x PBS can be used in this protocol.
2.0 mL microtubes	Genesee Scientific	24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold	Electron Microscopy Sciences	70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends	Fisher Scientific	NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids	Electron Microscopy Sciences	T400-Cu
95% Ethanol	MDS Warehouse	2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches)	VWR	56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle	VWR	23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle	Sigma-Aldrich	Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width	Roboz Surgical Instrument	RS-5211	Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush	Electron Microscopy Sciences	65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps	Fisher Scientific	05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand	Fisher Scientific	11-474-207
Cell Prolifer Program			Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish	Electron Microscopy Sciences	72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender	VWR	10118-956
Computer
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-5MG
Distilled H20			Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55	Roboz Surgical Instrument	RS-4984	Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder	Electron Microscopy Sciences	71147-01
EPON 815 Resin	Electron Microscopy Sciences	14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye	Fisher Scientific	22050460	Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye.
Epredia Mounting Media	Fisher Scientific	22-110-610	Use for mounting H&E slides.
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source	Dolan-Jenner Industries	Mi-150	Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program			Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector	Thermo Scientific	14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32%	Electron Microscopy Sciences	16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker			Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels	Electron Microscopy Sciences	77564-05
Lead Citrate	Electron Microscopy Sciences	17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips	Thermo Fisher Scientific	22X22I24788001LS	Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin	VWR	100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5600	Known as micro-dissecting scissors in protocol.
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
Mice			Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length	Roboz Surgical Instrument	RS-5913	Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum	SouthernBiotech	0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades	VWR	21909-380
Osmium Tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Pencil
Petri Dish	VWR	21909-380
Pipette Tips
Pipettes
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody	Thermo Fisher Scientific	402200
Propylene Oxide	Electron Microscopy Sciences	20412
Razor Blade	VWR	10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic	VWR	89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker	Staples	642736
Slide Rack for Staining	Grainger	49WF31
Squared Cover Glass Slips	Fisher Scientific	12-541B
Staining Dish with Cover	Grainger	49WF30	Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe	Thermo Scientific	S7510-50	Use only the syringe barrel.
Timer	Fisher	1464917
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Use for mounting RPE flat mounts.
Xylene	Fisher Scientific	22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope			This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching.
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope	Electron Microscopy Sciences	65575-02