Protocole d’évaluation et de quantification des pathologies de l’épithélium pigmenté rétinien dans des modèles murins de dégénérescence maculaire liée à l’âge

Résumé

Les modèles murins peuvent être des outils utiles pour étudier la biologie de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR). Il a été établi que les souris peuvent développer un éventail de pathologies RPE. Ici, nous décrivons un protocole de phénotypage pour élucider et quantifier les pathologies RPE chez la souris en utilisant la lumière, l’électron de transmission et la microscopie confocale.

Résumé

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est un trouble rétinien débilitant chez les populations vieillissantes. Il est largement admis que le dysfonctionnement de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR) est un événement pathobiologique clé dans la DMLA. Pour comprendre les mécanismes qui conduisent au dysfonctionnement de l’EPR, les chercheurs peuvent utiliser des modèles murins. Il a été établi par des études antérieures que les souris peuvent développer des pathologies RPE, dont certaines sont observées dans les yeux des personnes diagnostiquées avec la DMLA. Nous décrivons ici un protocole de phénotypage pour évaluer les pathologies de l’EPR chez la souris. Ce protocole comprend la préparation et l’évaluation de coupes transversales rétiniennes par microscopie optique et microscopie électronique à transmission, ainsi que celle de montures plates RPE par microscopie confocale. Nous détaillons les types courants de pathologies de l’EPR murin observés par ces techniques et les moyens de les quantifier grâce à des méthodes non biaisées pour les tests statistiques. Comme preuve de concept, nous utilisons ce protocole de phénotypage RPE pour quantifier les pathologies RPE observées chez les souris surexprimant la protéine transmembranaire 135 (Tmem135) et les souris âgées de type sauvage C57BL/6J. L’objectif principal de ce protocole est de présenter des méthodes de phénotypage RPE standard avec des évaluations quantitatives non biaisées pour les scientifiques utilisant des modèles murins de DMLA.

Introduction

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est une maladie cécitante courante qui touche les populations de plus de 55 ans¹. De nombreux chercheurs pensent que le dysfonctionnement de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR) est un événement pathobiologique précoce et crucial dans la DMLA². L’EPR est une monocouche de cellules polarisées chargée de maintenir l’homéostasie des photorécepteurs voisins et des vaisseaux sanguins choroïdiens³. Il existe divers modèles pour étudier les mécanismes associés à la maladie au sein de l’EPR, y compris les modèles de culture cellulaire ^4,5 et les souris 6,7,8. Un rapport récent a décrit des protocoles normalisés et des critères de contrôle de la qualité pour les modèles de culture cellulaire EPR⁴, mais aucun rapport n’a tenté de normaliser le phénotypage de l’EPR dans les modèles murins. En fait, de nombreuses publications sur des modèles murins de DMLA manquent d’une description complète de l’EPR ou d’une quantification des pathologies de l’EPR qu’ils contiennent. L’objectif global de ce protocole est de présenter des méthodes de phénotypage RPE standard avec des évaluations quantitatives non biaisées pour les scientifiques utilisant des modèles murins AMD.

Des publications antérieures ont noté la présence de plusieurs pathologies RPE chez la souris grâce à trois techniques d’imagerie. Par exemple, la microscopie optique permet aux chercheurs de visualiser la morphologie grossière de la rétine murine (Figure 1A) et de détecter des pathologies de l’EPR telles que l’amincissement de l’EPR, la vacuolisation et la migration. L’amincissement de l’EPR dans un modèle murin AMD est illustré par un écart de la hauteur de l’EPR par rapport à leurs contrôles respectifs (Figure 1B). La vacuolisation de l’EPR peut être divisée en deux catégories distinctes : la microvacuolisation (figure 1C) et la macrovacuolisation (figure 1D). La microvacuolisation de l’EPR est résumée par la présence de vacuoles dans l’EPR qui n’affectent pas sa hauteur totale, tandis que la macrovacuolisation est indiquée par la présence de vacuoles qui font saillie dans les segments externes des photorécepteurs. La migration de l’EPR se distingue par l’agrégat focal de pigment au-dessus de la monocouche de l’EPR dans une section transversale rétinienne (Figure 1E). Il convient de noter que les cellules EPR migratrices dans les yeux des donneurs de DMLA présentent une immunoréactivité aux marqueurs des cellules immunitaires, tels que le groupe de différenciation 68 (CD68)9, et pourraient représenter des cellules immunitaires engloutissant des débris d’EPR ou des EPR subissant une transdifférenciation ⁹. Une autre technique d’imagerie appelée microscopie électronique à transmission peut permettre aux chercheurs de visualiser l’ultrastructure de l’EPR et de sa membrane basale (Figure 2A). Cette technique permet d’identifier le dépôt sous-RPE prédominant chez la souris, connu sous le nom de dépôt laminaire basal (BLamD) (Figure 2B)¹⁰. Enfin, la microscopie confocale peut révéler la structure des cellules EPR grâce à l’imagerie des supports plats de l’EPR (Figure 3A). Cette méthode permet de découvrir la dysmorphie de l’EPR, c’est-à-dire la déviation de l’EPR par rapport à sa forme classique en nid d’abeille (Figure 3B). Il peut également détecter la multinucléation de l’EPR, la présence de trois noyaux ou plus dans une cellule EPR (Figure 3C). Pour un résumé des types de pathologies RPE présentes dans les modèles murins DMLA actuels, nous renvoyons les chercheurs à ces revues de la littérature ^6,7.

Les chercheurs qui étudient la DMLA devraient être conscients des avantages et des inconvénients de l’utilisation de souris pour étudier les pathologies de l’EPR avant le protocole de phénotypage. Les souris sont avantageuses en raison de leur durée de vie relativement courte et de leur rentabilité, ainsi que de leur manipulabilité génétique et pharmacologique. Les souris présentent également des changements dégénératifs de l’EPR, y compris la migration de l’EPR, la dysmorphie et la multinucléation, qui sont observés dans les yeux des donneurs de DMLA 11,12,13,14,15,16,17; cela suggère que des mécanismes similaires peuvent sous-tendre le développement de ces pathologies RPE chez la souris et l’homme. Cependant, il existe des différences clés qui limitent la transposabilité des études sur les souris à la DMLA humaine. Premièrement, les souris n’ont pas de macula, une région anatomiquement distincte de la rétine humaine nécessaire à l’acuité visuelle qui est préférentiellement affectée dans la DMLA. Deuxièmement, certaines pathologies de l’EPR chez la souris, comme l’amincissement et la vacuolisation de l’EPR, ne sont généralement pas observées dans les yeux des donneurs de DMLA¹⁸. Troisièmement, les souris ne développent pas de drusen, une caractéristique de la pathologie DMLA¹⁹. Les Drusen sont des dépôts contenant des lipides et des protéines avec très peu de protéines de la membrane basale qui se forment entre la lame basale RPE et la couche collagène interne de la membrane de Bruch (BrM)¹⁹. Drusen diffère de BLamD, le dépôt sous-RPE commun chez la souris, à la fois dans sa composition et sa localisation anatomique. Les BLamD sont des anomalies enrichies par la matrice extracellulaire dépendantes de l’âge et du stress qui se forment entre la lame basale RPE de BrM et les repliements basaux du RPE²⁰. Fait intéressant, les BLamD ont une composition protéique et une apparence similaires chez les souris et les humains ^6,10,21. Des travaux récents suggèrent que les BLamD peuvent agir dans la pathobiologie de la DMLA en influençant la progression de la DMLA vers ses stades ultérieurs^18,22 ; ainsi, ces dépôts peuvent représenter un EPR malade dans la rétine de la souris. La connaissance de ces avantages et limites est essentielle pour les chercheurs intéressés à traduire les résultats d’études sur la souris à la DMLA.

Dans ce protocole, nous discutons des méthodes de préparation des yeux à la lumière, à l’électron de transmission et à la microscopie confocale pour visualiser les pathologies de l’EPR. Nous décrivons également comment quantifier les pathologies de l’EPR de manière impartiale pour les tests statistiques. Comme preuve de concept, nous utilisons le protocole de phénotypage RPE pour étudier les pathologies structurelles de l’EPR observées chez les souris surexprimant la protéine transmembranaire 135- (Tmem135) et les souris âgées de type sauvage (WT) C57BL/6J. En résumé, nous visons à décrire la méthodologie de phénotypage pour caractériser l’EPR dans les modèles murins AMD, car il n’existe actuellement aucun protocole standard disponible. Les chercheurs intéressés par l’examen et la quantification des pathologies des photorécepteurs ou des choroïdes, qui sont également affectées dans les modèles murins DMLA, peuvent ne pas trouver ce protocole utile pour leurs études.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Wisconsin-Madison et sont conformes à la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle.

1. Évaluation de l’EPR chez la souris par microscopie optique

1. Fabriquez un tampon fixateur qui a une concentration finale de 2% de paraformaldéhyde et 2% de glutaraldéhyde à température ambiante (RT) dans une bouteille en verre.
   REMARQUE: Ce protocole nécessite, au maximum, 14 mL de tampon fixateur par souris.
   ATTENTION : Le paraformaldéhyde et le glutaraldéhyde sont des substances dangereuses. Veuillez suivre les procédures opérationnelles normalisées lorsque vous travaillez avec ces substances.
2. Préparer un système de perfusion par gravité sur un sous-coussin absorbant pour la perfusion cardiaque dans une hotte (figure supplémentaire 1A).
   1. Placer 40 mL du tampon fixateur dans le corps de la seringue du système de perfusion (figure supplémentaire 1B).
   2. Tournez la vanne jusqu’à ce qu’elle soit parallèle à la conduite de tuyauterie pour permettre au tampon de s’écouler dans la conduite de tuyauterie (figure supplémentaire 1C). Rincez la ligne avec un tampon jusqu’à ce que toutes les bulles d’air soient retirées de la ligne.
   3. Tourner la vanne jusqu’à ce qu’elle soit perpendiculaire à la conduite de tuyauterie pour empêcher le tampon de s’écouler dans la conduite de tuyauterie (figure supplémentaire 1D).
      REMARQUE: Le système de perfusion est maintenant prêt à l’emploi.
3. Euthanasier la souris en la plaçant dans une chambre de dioxyde de carbone (CO 2) et laisser le CO₂ s’écouler dans la chambre à un débit de 30% du volume de la chambre par minute. Une fois que la souris cesse de respirer, laissez le CO₂ s’écouler dans la chambre pendant au moins 1 min. Vérifiez que la souris est morte avant de passer à l’étape suivante.
   NOTE: L’euthanasie par injection d’agents pharmacologiques peut être utilisée dans ce protocole comme alternative à l’inhalation de CO₂ .
4. Effectuer une perfusion cardiaque sur la souris euthanasiée.
   1. Transférez la souris dans un plateau peu profond près du système de perfusion avec son abdomen tourné vers le haut. Vaporiser l’abdomen avec de l’éthanol à 70% (EtOH).
   2. Faites quatre incisions pour exposer la cavité abdominale (figure supplémentaire 2A).
      1. Créez une coupe inférieure de 5 cm à l’aide de ciseaux incurvés et de pinces à travers la peau et la paroi abdominale sur le côté gauche le plus éloigné de la souris qui se trouve directement sous la cage thoracique.
      2. Procédez à une coupe médiale de 3 cm à travers la peau et la paroi abdominale de la souris qui commence au sommet de la coupe inférieure.
      3. Faites une autre coupe inférieure de 5 cm à l’extrémité de la coupe médiale à travers la peau et la paroi abdominale sur le côté droit le plus éloigné de la souris directement sous la cage thoracique.
      4. Faites une autre incision médiale de 3 cm pour enlever le lambeau de peau abdominale avec une pince incurvée.
   3. Coupez le diaphragme et le sternum pour exposer le cœur (figure supplémentaire 2B).
      REMARQUE: Veillez à éviter de entailler le cœur, les artères et les veines. Entailler ceux-ci conduira à une perfusion cardiaque inefficace.
   4. Insérez l’aiguille de jauge dans le ventricule gauche du cœur. Tournez la vanne jusqu’à ce qu’elle soit parallèle à la conduite de tuyauterie. Coupez l’oreillette droite avec des ciseaux incurvés pour permettre au sang et au fixateur de sortir du cœur (figure supplémentaire 2C).
   5. Laisser 10 mL de tampon fixateur pénétrer dans la souris pendant au moins 1 à 2 minutes, ou jusqu’à ce que le foie devienne de couleur pâle et qu’aucun sang ne s’écoule de l’oreillette droite. Une fois la perfusion terminée, tournez la vanne jusqu’à ce qu’elle soit perpendiculaire à la conduite de tuyauterie pour arrêter l’écoulement du tampon.
5. Énucléer les yeux de la souris après perfusion cardiaque.
   1. Retirez la souris du plateau peu profond et placez-la sur le sous-tampon absorbant dans une hotte aspirante. Orientez la tête de la souris de telle sorte que l’œil gauche soit face à l’expérimentateur et que l’œil droit soit hors de vue. Annoter le côté supérieur de l’œil avec un colorant de marquage tissulaire.
   2. Appuyez doucement vers le bas avec le pouce et l’index autour de l’orbite pour provoquer une saillie de l’œil de l’orbite (figure supplémentaire 3A).
   3. Prenez des ciseaux incurvés et tenez-les avec la lame à un angle de 30 ° de l’orbite. Procéder à la coupe autour de l’œil avec les ciseaux incurvés à un angle de 30° (figure supplémentaire 3B).
      REMARQUE: Il est acceptable de couper l’excès de tissu de l’orbite pour préserver l’intégrité du globe oculaire.
   4. Retirez le globe oculaire de la tête à l’aide d’une pince incurvée et placez-le sur un coussinet absorbant. Entailler la cornée avec une lame de scalpel numéro 11 et placer l’œil avec une pince incurvée dans un microtube de 2 ml avec 2 ml de tampon fixateur. Étiqueter le microtube de 2 mL avec identification de la souris et « gauche » pour indiquer l’œil gauche.
      REMARQUE: L’entaille dans la cornée permet au fixateur de pénétrer facilement dans l’œil pour mieux le préserver.
   5. Répétez les étapes 1.5.1-1.5.4 pour l’œil droit.
6. Laisser les yeux incuber dans un tampon fixateur pendant la nuit sur un agitateur dans une pièce à 4 ° Celsius (C), à une vitesse de 75 rotations par minute (tr/min).
7. Remplacez le tampon fixateur par 2 mL de solution saline tampon phosphate 1x (PBS). Incuber les yeux en 1x PBS pendant 10 min sur un agitateur à TA et 75 rpm. Répétez cette étape deux fois.
8. Nettoyez et disséquez les yeux pour générer des segments postérieurs.
   REMARQUE: Le segment postérieur est le globe oculaire de la souris avec la rétine neurale, l’EPR, la choroïde et la sclérotique sans la cornée, l’iris et le cristallin.
   1. Placer l’œil dans une boîte de Petri remplie de 1x PBS sous un microscope à dissection (figure supplémentaire 4A).
   2. Soulevez doucement la graisse et les muscles loin du globe oculaire à l’aide d’une pince à pointe fine. Coupez soigneusement la graisse et le muscle avec des ciseaux microdisséquants dans une direction parallèle au globe oculaire jusqu’à ce que le globe oculaire ait une couleur bleu-noir uniforme (figure supplémentaire 4B).
      REMARQUE: Ne coupez pas dans une direction perpendiculaire, car cela endommage le globe oculaire. De plus, si le colorant de marquage tissulaire se détache pendant le traitement, réannotez immédiatement le côté supérieur du globe oculaire.
   3. Placez des pinces à pointe fine au site de ponction cornéenne. Couper autour du périmètre de la cornée, en commençant par le site de ponction, avec des ciseaux à microdissection, pour retirer la cornée et l’iris du globe oculaire (Figure supplémentaire 4C).
   4. Prenez des pinces à pointe fine et retirez doucement la lentille du globe oculaire pour obtenir le segment postérieur (Figure supplémentaire 4D).
   5. Replacez le segment postérieur dans un microtube de 2 mL contenant 2 mL de 1x PBS. Conservez le segment postérieur dans un réfrigérateur à 4 °C.
      REMARQUE: Les segments postérieurs peuvent rester dans 1x PBS à 4 ° C pendant plusieurs semaines avant un traitement ultérieur.
9. Répétez les étapes 1.3-1.8 pour préparer les yeux des autres souris de l’étude.
10. Traiter et intégrer l’un des segments postérieurs de chaque souris dans de la paraffine pour la section. Assurez-vous que le côté supérieur du segment postérieur est au-dessus.
    NOTE: Les auteurs s’appuient sur le laboratoire Translational Research Initiatives in Pathology (TRIP) de l’Université du Wisconsin-Madison (UW) pour effectuer ces tâches. Voici des protocoles publiés utilisant une méthode similaire de traitement et d’intégration de la paraffine^23,24.
11. Couper et couper chaque bloc de paraffine pour obtenir une section rétinienne de 5 μm d’épaisseur qui comprend la tête du nerf optique, ainsi que quatre sections rétiniennes supplémentaires de 5 μm d’épaisseur qui sont distantes de 250 μm les unes des autres. Étiquetez les lames avec l’identification de la souris et le numéro de section de série (c.-à-d. 1, 2, 3, 4 ou 5). Conservez les diapositives dans une boîte de diapositives.
    NOTE: Les auteurs comptent sur le laboratoire UW TRIP pour leurs services de sectionnement de paraffine. Voici des protocoles publiés utilisant une méthode de section de paraffine similaire^25,26.
12. Colorer les lames contenant des sections rétiniennes avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E). Un protocole de coloration H&E se trouve à la figure supplémentaire 5.
    REMARQUE: Toutes les étapes de la procédure de coloration H & E doivent être complétées dans une hotte.
13. Collectez des images cousues de coupes rétiniennes colorées H & E avec une barre d’échelle à l’aide d’un microscope optique à un grossissement de 20x.
14. Quantifier l’épaisseur de l’EPR dans les images rétiniennes contenant la tête du nerf optique pour chaque échantillon.
    1. Téléchargez et ouvrez le programme Fiji ImageJ. Faites glisser toutes les images rétiniennes cousues contenant la tête du nerf optique dans la barre des tâches Fiji ImageJ. Vérifiez que l’échelle de l’image est calibrée en μm et non en pixels.
       REMARQUE: L’échelle de l’image est située dans le coin supérieur gauche de la fenêtre contenant une image rétinienne dans le programme Fiji ImageJ. Si l’échelle est définie en pixels, veuillez vous référer au manuel d’instructions du programme Fiji ImageJ pour convertir les pixels en μm.
    2. Marquez tous les intervalles de 300 μm dans chaque image du bord de la tête du nerf optique à l’extrémité de la rétine (ora serrata). Cliquez sur l’icône Droit dans la barre des tâches Fiji ImageJ. Cliquez et faites glisser une ligne du bord de la tête du nerf optique vers l’ora serrata d’une longueur de 300 μm. Cliquez sur l’outil Pinceau dans la barre des tâches Fiji ImageJ et cliquez sur la fin de la ligne de 300 μm pour la marquer.
    3. Mesurez l’épaisseur RPE à chaque intervalle marqué. Cliquez sur l’icône Droit dans la barre des tâches Fiji ImageJ. Cliquez et faites glisser une ligne du haut vers le bas de l’EPR (Figure supplémentaire 6). Cliquez sur Analyser > mesurer dans la barre de menus Fiji ImageJ pour obtenir l’épaisseur RPE.
    4. Transférez les mesures d’épaisseur RPE dans une feuille de calcul et étiquetez la colonne contenant les mesures avec identification de la souris. Étiquetez une colonne supplémentaire avec « Intervalle marqué » et entrez la distance par rapport aux valeurs du nerf optique (c.-à-d. 300, 600, 900, etc.)
       NOTE: Le premier intervalle mesuré correspond à 300 μm du nerf optique, le deuxième intervalle mesuré correspond à 600 μm de distance, et ainsi de suite.
15. Quantifier les taux d’incidence de la pathologie de l’EPR en fonction des images rétiniennes de chaque échantillon.
    1. Ouvrez le programme Fiji ImageJ.
    2. Ouvrez l’application Cell Counter dans le programme Fiji ImageJ. Cliquez sur Plugins > Analyze > Cell Counter dans la barre de menu Fiji ImageJ. Faites glisser une image rétinienne dans la barre des tâches Fiji ImageJ et cliquez sur Initialiser dans la fenêtre Cell Counter .
    3. Comptez le nombre de pathologies RPE par section rétinienne à l’aide de l’application Cell Counter . Cliquez sur Type 1 sous Compteurs, puis cliquez sur tous les événements de microvacuolisation dans l’image. Cliquez sur Type 2 sous Compteurs, puis cliquez sur tous les événements de macrovacuolisation dans l’image. Cliquez sur Type 3 sous Compteurs, puis cliquez sur tous les événements de migration individuels dans l’image.
    4. Transférez les numéros des pathologies RPE dans une feuille de calcul. Étiquetez les lignes avec microvacuolisation, macrovacuolisation ou migration, et la colonne avec identification de la souris.
    5. Répétez les étapes 1.15.2 à 1.15.4 pour les autres images de l’exemple. Faire la moyenne du nombre de pathologies EPR par échantillon et diviser par cinq pour calculer le taux d’incidence de chaque pathologie EPR pour l’échantillon dans la feuille de calcul.
16. Effectuer une analyse statistique des épaisseurs de l’EPR à chaque intervalle et des taux d’incidence de la pathologie de l’EPR afin de déterminer s’il existe des différences significatives entre les groupes de l’étude.

2. Évaluation de l’EPR chez la souris par microscopie électronique à transmission

1. Couper les autres segments postérieurs cédés après les étapes 1,5-1,9 en deux à travers la marque supérieure en deux sections avec une lame de rasoir. Réannoter la face supérieure des segments postérieurs sectionnés avec un colorant de marquage tissulaire. Séparer les segments postérieurs sectionnés en nouveaux microtubes de 2 mL contenant 2 mL de 1x PBS et identification de souris.
   REMARQUE: Le segment postérieur de la souris est trop grand pour être traité en une seule pièce et doit être coupé en deux pour le traitement par microscopie électronique à transmission.
2. Rincer les tissus avec 2 mL de tampon cacodylate 0,1 M, pH 7,2. Incuber pendant 10 min à RT sur la paillasse. Répétez cette étape deux fois de plus.
3. Remplacer le tampon cacodylate 0,1 M par 2 mL de tétroxyde d’osmium à 2 % (_OsO4) dilué dans un tampon cacodylate 0,1 M. Incuber pendant 1,5 h à TA dans la hotte.
   ATTENTION : L’OsO₄ est une substance toxique. Veuillez suivre les procédures opérationnelles standard lorsque vous travaillez avec OsO₄.
4. Rincer les mouchoirs avec 2 mL de tampon cacodylate 0,1 M pendant 10 min à TA dans la hotte. Répétez cette étape une fois.
5. Déshydrater les tissus avec des dilutions graduées d’EtOH allant de 50% à 100% à RT dans la hotte. Un protocole pour la procédure de déshydratation se trouve à la figure supplémentaire 7.
6. Retirer 100 % d’EtOH des tissus et ajouter 2 mL d’oxyde de propylène aux tissus. Incuber à TA dans la hotte pendant 15 min. Retirez l’oxyde de propylène des tissus et ajoutez 2 mL d’oxyde de propylène frais aux tissus. Incuber à TA dans la hotte pendant 15 min.
   ATTENTION : L’oxyde de propylène est une substance toxique. Veuillez suivre les procédures opérationnelles normalisées lorsque vous travaillez avec de l’oxyde de propylène.
7. Retirez l’oxyde de propylène des tissus et ajoutez 2 mL d’un mélange 1:1 d’oxyde de propylène et de résine aux tissus. Laisser passer la nuit sous vide dans la hotte à RT.
   ATTENTION : La résine est une substance dangereuse pour l’homme. Veuillez suivre les procédures opérationnelles normalisées du laboratoire lorsque vous travaillez avec de la résine.
8. Remplacer le mélange 1:1 d’oxyde de propylène et de résine de tissus par 2 mL de résine pure. Laisser passer la nuit sous vide dans la hotte à RT.
9. Incorporer les tissus dans de la résine. Placez une étiquette avec identification de la souris au crayon et une goutte de résine dans le moule. Placez le tissu sur la goutte de résine. Remplir le moule avec de la résine et placer sous vide pendant 1 h à TA dans la hotte.
10. Repositionnez les étiquettes et les spécimens à l’aide d’une pince à pointe fine, avec le côté postérieur de la section postérieure de l’œilleton sur le dessus. Laisser la moisissure toute la nuit à 65 °C dans un four dans la hotte.
11. Retirez les moules du four. Laissez les moules refroidir à RT sur la paillasse. Retirez les blocs des moules.
    REMARQUE: Les blocs sont maintenant prêts pour le rognage.
12. Façonnez les blocs de résine avec une lame de rasoir pour former un trapèze. Coupez les blocs de résine à l’aide d’un microtome jusqu’à ce que la tête du nerf optique soit visible. Procédez à l’utilisation d’un couteau diamanté pour couper des sections semi-minces des blocs de résine d’une épaisseur de 0,5 μm.
    NOTE: Voici un protocole publié sur la section microtome²⁷. Si vous le souhaitez, des sections semi-minces de 0,5 μm d’épaisseur provenant des blocs de résine peuvent être collectées et colorées pour évaluer l’intégrité de l’échantillon.
13. Couper une section ultramince de 70 nm d’épaisseur de chaque bloc paré à l’aide d’un ultramicrotome. Collectez une section ultramince de 70 nm d’épaisseur sur une grille de cuivre à barres minces de 400 mailles. Placez la grille dans une boîte de stockage de grille et étiquetez l’emplacement avec l’identification de la souris.
    NOTE: Voici un protocole publié sur la section ultramicrotome²⁸.
14. Colorer les grilles avec 2% d’acétate d’uranyle pendant 5 min, puis avec une solution de citrate de plomb à 3,5% pendant 5 min à TA dans la hotte.
    ATTENTION : L’acétate d’uranyle et le citrate de plomb sont des substances dangereuses. Veuillez suivre les procédures opérationnelles normalisées lorsque vous travaillez avec ces substances.
15. Obtenir des images pour chaque échantillon à l’aide d’un microscope électronique à transmission à un grossissement de 15 000x, où les lignes de grille de la grille de cuivre croisent le RPE et BrM.
    REMARQUE: Il devrait y avoir au moins 20 à 35 images par section et 40 à 70 images par échantillon.
16. Quantifier les hauteurs BLamD dans les images des échantillons de l’étude.
    1. Ouvrez le programme Fiji ImageJ. Faites glisser toutes les images de la section d’exemple vers la barre des tâches Fiji ImageJ. Vérifiez que les images sont calibrées en μm et non en pixels.
    2. Mesurez la hauteur BLamD dans les images. Cliquez sur l’icône Droit dans la barre des tâches Fiji ImageJ. Cliquez et faites glisser une ligne du limbe élastique de BrM vers le haut du dépôt le plus haut de l’image (Figure supplémentaire 8). Cliquez sur Analyser > mesure dans la barre de menus Fiji ImageJ pour obtenir la hauteur BLamD de l’image.
       REMARQUE: S’il n’y a pas de BLamD dans l’image, tracez une ligne entre la lame élastique de BrM et la lame basale du RPE.
    3. Transférez les hauteurs BLamD dans une feuille de calcul et une étiquette avec identification de la souris.
17. Calculez les fréquences cumulées des hauteurs BLamD par génotype et les moyennes des hauteurs BLamD par souris dans la feuille de calcul. Effectuer une analyse statistique sur les moyennes des hauteurs BLamD pour déterminer s’il existe des différences significatives entre les groupes de l’étude.

3. Évaluation de l’EPR chez la souris par microscopie confocale

1. Recueillez les yeux des souris. Euthanasier les souris selon la procédure décrite à l’étape 1.3. Énucléez les yeux à l’étape 1.5. Placez les yeux à l’aide d’une pince incurvée dans un microtube de 2 mL contenant 2 mL de 1x PBS et identification de la souris.
   REMARQUE: Ne pas adapter les souris à l’obscurité, car l’internumérisation des photorécepteurs et des processus apicaux RPE permet une meilleure visualisation de l’EPR par microscopie confocale.
2. Nettoyez et disséquez immédiatement les yeux de la souris pour générer des oculaires postérieurs de souris.
   REMARQUE: L’œilleton postérieur est différent du segment postérieur car il ne contient pas la rétine neurale.
   1. Transférer l’œil dans une boîte de Petri contenant 1x PBS au microscope à dissection (figure supplémentaire 9A).
   2. Enlevez la graisse et les muscles du globe oculaire, comme décrit à l’étape 1.8.2 (figure supplémentaire 9B).
   3. Entailler la cornée du globe oculaire avec une lame de scalpel numéro 11. Retirez la cornée et l’iris, comme indiqué à l’étape 1.8.3 (figure supplémentaire 9C).
   4. Retirez l’objectif à l’aide d’une pince à pointe fine. Prenez deux pinces à pointe fine et séparez doucement la rétine neurale du segment postérieur.
   5. Couper soigneusement la rétine neurale à la tête du nerf optique pour l’enlever de l’œilleton postérieur (figure supplémentaire 9D).
   6. Placez l’œilleton postérieur dans un nouveau microtube de 2 mL contenant 500 μL de 1x PBS avec identification de souris.
3. Fixez les oculaires postérieurs avec du méthanol (MeOH) (figure supplémentaire 10).
   REMARQUE: Étape 3.3 prend environ 2 h et 40 min pour terminer.
   1. Ajouter 500 μL de MeOH aux tissus. Incuber sur agitateur à 75 tours pendant 5 min à TA.
   2. Retirer les 500 μL de solution des tissus et ajouter 500 μL de MeOH. Incuber pendant 5 min sur un shaker à 75 tours pendant 5 min à TA. Répétez cette étape une fois de plus.
   3. Retirez toute la solution des tissus et ajoutez 500 μL de MeOH. Incuber sur agitateur à 75 tours pendant au moins 2 h à TA.
      NOTE: Comme alternative à l’étape 3.3.3, l’œilleton postérieur peut être incubé pendant une nuit dans MeOH sur un agitateur à 75 tr/min dans une pièce à 4 °C.
   4. Ajouter 500 μL de 1x PBS aux tissus. Incuber sur agitateur à 75 tours pendant 5 min à TA.
   5. Retirer les 500 μL de solution des tissus et ajouter 500 μL de 1x PBS. Incuber sur un shaker à 75 tours pendant 5 min à TA. Répétez cette étape une fois de plus.
   6. Retirez toute la solution des tissus et remplacez-la par 500 μL de 1x PBS.
      NOTE: Les tissus sont entièrement fixés par le MeOH et peuvent être conservés dans un réfrigérateur à 4 °C pendant au moins 1 mois.
4. Effectuer une coloration par immunofluorescence des oculaires postérieurs pour visualiser les jonctions serrées et les noyaux de l’EPR (figure supplémentaire 11).
   1. Retirer les 500 μL de 1x PBS des échantillons et ajouter 100 μL de sérum d’âne dilué à 10% normal dans 1x solution de PBS. Incuber sur un shaker à 75 tours pendant 30 min à TA.
   2. Retirer la solution diluée de sérum d’âne normal à 10 % des échantillons et ajouter 100 μL d’une dilution 1:50 d’un anticorps polyclonal anti-Zonula Occludens-1 (ZO-1) de lapin dans 1x PBS. Transférer les échantillons dans une pièce à 4 °C et incuber pendant la nuit sur un agitateur à 75 tr/min.
   3. Retirer la dilution des anticorps des échantillons et ajouter 2 mL de 1x PBS. Incuber sur un shaker à 75 tr/min pendant 10 min à TA. Répétez cette étape deux fois de plus.
   4. Retirez le PBS 1x des échantillons. Ajouter 100 μL d’une dilution 1:250 d’un anticorps IgG anti-lapin d’âne avec une étiquette conjuguée au fluorophore 488 et une dilution 1:250 de dichlorhydrate de 4',6-diamidine-2'-phénylindole (DAPI) dans 1x PBS aux échantillons. Couvrir les échantillons de papier d’aluminium et incuber sur un agitateur à 75 rpm pendant 2 h à TA.
      REMARQUE: Les échantillons doivent être complètement recouverts de papier d’aluminium pour éviter le photoblanchiment.
   5. Retirer les dilutions d’anticorps et de DAPI des échantillons. Ajouter 2 ml de 1x PBS aux échantillons, recouvrir de papier d’aluminium et incuber sur un agitateur à 75 rpm pendant 10 min à TA. Répétez cette étape trois fois de plus.
      REMARQUE: Les jonctions serrées et les noyaux de l’EPR sont maintenant entièrement marqués et colorés, respectivement.
5. Montez les oculaires postérieurs sur des lames de microscope.
   1. Étiquetez une lame de microscope avec identification de souris. Transférez l’œilleton postérieur sur une lame de microscope sous un microscope à dissection avec le côté choroïdien vers le bas. Ajoutez une goutte de 1x PBS à l’œilleton postérieur pour l’empêcher de se dessécher (Figure supplémentaire 12).
   2. Coupez l’œilleton postérieur à l’aide d’une lame de scalpel numéro 11 à quatre endroits qui donnera quatre quadrants correspondant aux directions cardinales (c.-à-d. nord, est, sud et ouest). Tamponner l’excès de 1x PBS avec le tissu du périmètre de l’œilleton postérieur. Aplatir doucement l’œilleton postérieur à l’aide d’une brosse à cheveux camel et d’une pince à pointe fine (figure supplémentaire 12).
      REMARQUE : Le produit résultant est maintenant connu sous le nom de montage plat RPE.
   3. Ajoutez une goutte de support de montage au support plat RPE et placez un couvercle dessus. Appliquez du vernis à ongles transparent pour sceller la lamelle de couverture et laissez-la sécher pendant au moins 30 minutes à TA dans un tiroir fermé. Placez les lames dans une boîte de support de diapositives et conservez-la au réfrigérateur à 4 °C.
      REMARQUE: Veillez à éviter d’introduire des bulles sur le support plat RPE. Les supports plats RPE peuvent être imagés dans un délai de 2 semaines.
6. Obtenez une image de chacun des quatre quadrants entourant le nerf optique de la monture plate RPE sur un microscope confocal à un grossissement de 20x pour chaque échantillon. Un exemple d’image à montage plat RPE se trouve à la figure supplémentaire 13A.
   REMARQUE : Il peut être nécessaire d’effectuer une imagerie z-stack des supports plats RPE où plusieurs images sont prises et empilées pour compenser les différences dimensionnelles du montage plat RPE.
7. Tracez les jonctions serrées des cellules RPE dans chaque image à montage plat RPE. Un exemple d’image à montage plat RPE tracée se trouve à la figure supplémentaire 13B.
   1. Ouvrez le programme Fiji ImageJ. Faites glisser une image à montage plat RPE dans la barre des tâches Fiji ImageJ. Vérifiez que l’image est calibrée en micromètres et non en pixels.
   2. Double-cliquez sur l’icône Overlay Brush Tool dans la barre des tâches Fiji ImageJ pour définir la largeur du pinceau sur 3, la transparence sur 0 et la couleur sur le rouge. Cliquez sur le bouton Fermer dans la fenêtre Overlay Brush Tool (Outil Pinceau de superposition ).
   3. Cliquez sur l’icône Overlay Brush Tool (Pinceau de superposition ). Cliquez et faites glisser sur les jonctions serrées de toutes les cellules RPE qui se trouvent complètement dans l’image.
      REMARQUE: Si une erreur de suivi est commise, double-cliquez sur l’icône Outil Pinceau de superposition et cliquez sur la case Annuler dans la fenêtre Outil Pinceau de superposition pour supprimer l’erreur de traçage de l’image.
   4. Cliquez sur l’icône Rectangle dans la barre des tâches Fiji ImageJ. Cliquez sur l’image et faites-la glisser autour du périmètre de l’image. Cliquez sur Modifier > Effacer dans la barre de menus Fiji ImageJ pour conserver les lignes tracées et supprimer les couleurs bleues et vertes de l’image.
   5. Enregistrez l’image de trace dans un emplacement approprié avec identification de la souris, emplacement du quadrant (nord, sud, est ou ouest) et une étiquette de suffixe CP.
      REMARQUE : n’enregistrez pas l’image de trace RPE avant d’avoir terminé l’étape 3.7.4.
8. Calculez les surfaces des cellules EPR pour chaque échantillon.
   1. Désignez un emplacement pour enregistrer les fichiers de l’analyse de zone RPE en créant un dossier sur l’écran du bureau de l’ordinateur. Générez des sous-dossiers pour chaque image de trace RPE et étiquetez-les avec l’identification de la souris ainsi que l’emplacement du quadrant (nord, sud, est ou ouest).
   2. Installez et ouvrez le programme Cell Profiler²⁹. Téléchargez le fichier de projet Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj (Supplementary Coding File 1). Ouvrez le fichier Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj en cliquant sur Fichier > Ouvrir le projet dans la barre de menus du programme Cell Profiler.
   3. Faites glisser une image de trace RPE dans la zone Image > Déposer des fichiers et des dossiers ici dans la fenêtre du programme Cell Profiler.
   4. Entrez l’emplacement du dossier dans le programme Cell Profiler qui correspond à l’image de trace RPE. Cliquez sur le bouton Paramètres de sortie dans le coin inférieur gauche de la fenêtre du programme Cell Profiler et entrez l’emplacement du dossier dans les zones de texte Dossier d’entrée par défaut et Dossier de sortie par défaut .
   5. Cliquez sur le bouton Analyser les images dans le coin inférieur gauche de la fenêtre du programme Cell Profiler. Une fois l’analyse terminée, une fenêtre Analyse terminée apparaît à l’écran. Cliquez sur le bouton OK dans la fenêtre Analyse terminée .
      Remarque : Cette action générera un fichier csv et une image jpeg. Le fichier csv contiendra les zones des cellules RPE dans l’image de trace. L’image jpeg correspondra à l’image de trace RPE, où chaque cellule RPE sera étiquetée avec un numéro (Figure supplémentaire 13C).
   6. Transférez les zones RPE du fichier csv vers une feuille de calcul. Étiquetez la feuille de calcul avec l’identification de la souris.
   7. Effectuez une enquête de contrôle de la qualité des données en confirmant que chaque zone RPE du fichier csv est liée à une cellule RPE entièrement tracée dans une image jpeg. Supprimez de la feuille de calcul toutes les valeurs qui ne correspondent pas aux cellules RPE entièrement tracées.
   8. Revenez au programme Cell Profiler. Cliquez avec le bouton droit sur le nom de l’image de trace RPE dans la zone Déposer les fichiers et dossiers ici et sélectionnez Effacer la liste pour supprimer l’image du programme Cell Profiler.
   9. Répétez les étapes 3.8.3-3.8.8 pour calculer les tailles RPE pour les trois images de trace RPE restantes de l’échantillon.
9. Quantifier les moyennes de taille de cellule RPE pour chaque échantillon de la feuille de calcul.
10. Quantifier les densités de cellules EPR pour chaque échantillon de la feuille de calcul. Pour calculer la densité des cellules EPR, divisez le nombre total de cellules EPR par quadrant par la surface totale des cellules EPR par quadrant détectées par le programme Cell Profiler. Déterminer la moyenne des densités cellulaires RPE à partir des quatre quadrants par échantillon.
11. Quantifier le nombre de cellules EPR multinucléées par montage plat d’EPR pour chaque échantillon. Utilisez l’application Cell Counter du programme Fiji ImageJ, comme décrit aux étapes 1.15.1-1.15.3, pour compter le nombre de cellules EPR avec plus de trois noyaux dans quatre quadrants de l’échantillon.
12. Effectuer une analyse statistique sur les moyennes de taille et de densité des cellules EPR, ainsi que sur le nombre de cellules EPR multinucléées afin de déterminer s’il existe des différences significatives entre les groupes de l’étude.

Résultats

L’achèvement du protocole de phénotypage RPE décrit dans cet article fournit une analyse quantitative des anomalies structurelles de l’EPR couramment observées dans les modèles murins de DMLA. Pour confirmer l’efficacité de ce protocole, nous l’avons utilisé chez des souris connues pour présenter des pathologies de l’EPR, y compris des souris transgéniques qui surexpriment WT Tmem135 entraînées par le promoteur de la bêta-actine de poulet (Tmem135 TG)30 et des souris C57BL/6J âgées

Discussion

Dans cet article, nous avons présenté un protocole de phénotypage pour évaluer les pathologies structurelles de l’EPR de modèles murins. Nous avons décrit les étapes nécessaires au traitement des yeux pour diverses techniques d’imagerie telles que la lumière, l’électron de transmission et la microscopie confocale, ainsi que la quantification des pathologies typiques observées via ces méthodes d’imagerie. Nous avons prouvé l’efficacité de notre protocole de phénotypage RPE en examinant

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Cacodylate Buffer pH7.2	PolyScientiifc R&D Company	S1619
100 Capacity Slide Box			Two are needed for this protocol (one for H&E-stained slides and one for RPE flat mounts.)
100% Ethanol	MDS Warehouse	2292-CASE	Can be used to make diluted ethanol solutions in this protocol.
1-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks	Qosina	11069
1x Phosphate Buffer Solution (PBS)			Premade 1x PBS can be used in this protocol.
2.0 mL microtubes	Genesee Scientific	24-283-LR
24 Cavity Embedding Capsule Substitute Mold	Electron Microscopy Sciences	70165
24 inch PVC Tubing with Luer Ends	Fisher Scientific	NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Grids	Electron Microscopy Sciences	T400-Cu
95% Ethanol	MDS Warehouse	2293-CASE
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier (23 inches by 24 inches)	VWR	56616-031
Adjustable 237 ml  Spray Bottle	VWR	23609-182
Alexa Fluor488 Conjugated Donkey anti-Rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Aluminum Foil
BD Precision glide 19 Gauge Syringe Needle	Sigma-Aldrich	Z192546
Bracken Forceps; Curved; Fine Cross Serrations; 4" Length, 1 mm Tip Width	Roboz Surgical Instrument	RS-5211	Known as curved forceps in this protocol.
Camel Hair Brush	Electron Microscopy Sciences	65575-02
Carbon Dioxide Euthanasia Chamber
Carbon Dioxide Flow Meter
Carbon Dioxide Tank
Castaloy Prong Extension Clamps	Fisher Scientific	05-769-7Q
Cast-Iron L-shaped Base Support Stand	Fisher Scientific	11-474-207
Cell Prolifer Program			Available to download: https://cellprofiler.org/releases
Clear Nail Polish	Electron Microscopy Sciences	72180
Colorfrost Microscope Slides Lavender	VWR	10118-956
Computer
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-5MG
Distilled H20			Water from Milli-Q Purification System was used in this protocol.
Dumont Thin Tip Tweezers; Pattern #55	Roboz Surgical Instrument	RS-4984	Known as fine-tipped forceps in this protocol, and 3 are needed for this protocol (two for dissections and one for electron microscope processing).
Electron Microscopy Grid Holder	Electron Microscopy Sciences	71147-01
EPON 815 Resin	Electron Microscopy Sciences	14910
Epredia Mark-It Tissue Marking Yellow Dye	Fisher Scientific	22050460	Please follow manufacturer's protocol when using this tissue marking dye.
Epredia Mounting Media	Fisher Scientific	22-110-610	Use for mounting H&E slides.
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series,150 w Halogen Light Source	Dolan-Jenner Industries	Mi-150	Light source for dissecting microscope.
Fiji ImageJ Program			Available to download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector	Thermo Scientific	14-666-18Q
Fume hood
Glutaraldehyde 2.5% in Phosphate Buffer, pH 7.4, 32%	Electron Microscopy Sciences	16537-05
JEM-1400 Transmission Electron Microscope (JEOL) with an ORIUS (1000) CCD Camera
Laboratory Benchtop Shaker			Two are needed for these experiments. One should be at room temperature while the other should be in a 4 degree Celsius cold room.
Laser Cryo Tag Labels	Electron Microscopy Sciences	77564-05
Lead Citrate	Electron Microscopy Sciences	17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips	Thermo Fisher Scientific	22X22I24788001LS	Use these coverslips for the RPE flat mounts as they have raised edges and accommodate the thickness of the RPE.
Mayer's Hematoxylin	VWR	100504-406
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors	Roboz Surgical Instrument	RS-5600	Known as micro-dissecting scissors in protocol.
Methanol	Fisher Scientific	A412-4
Mice			Any AMD mouse model and its respective controls can work for this protocol.
Micro Dissecting Scissors; Standard Version; Curved; Sharp Points; 24 mm Blade Length; 4.5" Overall Length	Roboz Surgical Instrument	RS-5913	Known as curved scissors in this protocol.
Microsoft Excel
Microtube racks
Nikon A1RS Confocal Microscope
Normal Donkey Serum	SouthernBiotech	0030-01
Number 11 Sterile Disposable Scalpel Blades	VWR	21909-380
Osmium Tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Pencil
Petri Dish	VWR	21909-380
Pipette Tips
Pipettes
Polyclonal Anti-ZO-1 Antibody	Thermo Fisher Scientific	402200
Propylene Oxide	Electron Microscopy Sciences	20412
Razor Blade	VWR	10040-386
Shallow Tray for Mouse Perfusions
Shandon Eosin Y Alcoholic	VWR	89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Black Permanent Marker	Staples	642736
Slide Rack for Staining	Grainger	49WF31
Squared Cover Glass Slips	Fisher Scientific	12-541B
Staining Dish with Cover	Grainger	49WF30	Need 15 for H&E staining procedure.
Target All-Plastic Disposable Luer-Slip 50 mL Syringe	Thermo Scientific	S7510-50	Use only the syringe barrel.
Timer	Fisher	1464917
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vacuum Oven
Vectashield Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Use for mounting RPE flat mounts.
Xylene	Fisher Scientific	22050283
Zeiss Axio Imager 2 Light Microscope			This microscope has the capacity to generate stitched 20x images. If a light microscope does not have this capacity, then take images of the entire retina that are slightly overlapping each other. Use Adobe Photoshop to stitch these images together. Please refer to the manuals of the Adobe Photoshop program for image stitching.
Zeiss Stemi 2000 Dissecting Microscope	Electron Microscopy Sciences	65575-02