El colgajo axial superficial de la arteria epigástrica inferior para estudiar los efectos del preacondicionamiento isquémico en un modelo de rata

Resumen

Este protocolo describe la recolección, sutura y monitoreo de colgajos fasciocutáneos en ratas que permiten una buena visualización y manipulación del flujo sanguíneo a través de los vasos epigástricos inferiores superficiales mediante el pinzamiento y la ligadura de los vasos femorales. Esto es crítico para los estudios que involucran preacondicionamiento isquémico.

Resumen

Los colgajos fasciocutáneos (FCF) se han convertido en el estándar de oro para la reconstrucción de defectos complejos en cirugía plástica y reconstructiva. Esta técnica de preservación muscular permite transferir tejidos vascularizados para cubrir cualquier defecto grande. FCF se puede utilizar como colgajos pediculados o como colgajos libres; sin embargo, en la literatura, las tasas de fracaso para FCF pediculado y FCF libre son superiores al 5%, dejando margen de mejora para estas técnicas y una mayor expansión del conocimiento en esta área. El preacondicionamiento isquémico (P.I.) ha sido ampliamente estudiado, pero los mecanismos y la optimización del régimen I.P. aún no se han determinado. Este fenómeno está poco explorado en cirugía plástica y reconstructiva. Aquí, se presenta un modelo quirúrgico para estudiar el régimen de P.I. en un modelo de colgajo fasciocutáneo axial de rata, que describe cómo evaluar de manera segura y confiable los efectos de I.P. en la supervivencia del colgajo. Este artículo describe el procedimiento quirúrgico completo, incluyendo sugerencias para mejorar la confiabilidad de este modelo. El objetivo es proporcionar a los investigadores un modelo reproducible y confiable para probar varios regímenes de preacondicionamiento isquémico y evaluar sus efectos sobre la supervivencia del colgajo.

Introducción

La cirugía plástica y reconstructiva está en constante evolución. El desarrollo de colgajos musculares, fasciocutáneos y perforantes ha permitido ofrecer reconstrucciones de mejor calidad y reducir la morbilidad. Combinando este conocimiento anatómico mejorado con habilidades técnicas mejoradas, los cirujanos reconstructivos pueden realizar transferencias de colgajo gratuitas cuando los defectos no están cerca de ninguna solución local. Sin embargo, mientras que la cirugía con colgajo perforante es actualmente la técnica más avanzada en cirugía reconstructiva, la literatura reporta una tasa de fracaso del 5% en las transferencias de colgajo libre ^1,2,3, y de hasta el 20% para la reconstrucción con colgajo pediculado 4,5,6. La falla parcial o total del colgajo ocurre cuando el pedículo del colgajo está comprometido, por lo tanto, es esencial buscar continuamente mejoras en las técnicas actuales. Uno de los métodos para mejorar la supervivencia del colgajo es promover su neovascularización en el lecho de la herida, permitiendo así la perfusión por una fuente distinta al pedículo. El preacondicionamiento isquémico (I.P.) se ha descrito inicialmente en un modelo cardíaco⁷, lo que demuestra que un órgano expuesto a isquemia controlada sobrevive en mayor grado después de perder su suministro primario de sangre al someterse a una neovascularización inducida por isquemia. Varios autores han estudiado este principio fundamental para optimizar la supervivencia del colgajo en modelos preclínicos y clínicos ^8,9,10.

La ventaja de esta técnica sobre otros métodos para mejorar la supervivencia del colgajo es su facilidad de implementación, que consiste en pruebas de pinza/desclamp de la fuente de sangre. En el modelo de rata, los autores anteriores utilizaron el colgajo de la arteria epigástrica inferior superficial (SIEA) para estudiar la P.I. mediante el pinzamiento del pedículo principal^11,12,13. No obstante, se pueden encontrar varios problemas técnicos con este modelo, y la literatura carece de protocolos bien descritos.

Por lo tanto, este trabajo tiene como objetivo proporcionar a los investigadores una descripción detallada de una técnica de obtención de colgajo SIEA de rata con una disección extendida de los vasos femorales para permitir estudios de IP en un modelo de colgajo fasciocutáneo axial. Este modelo conserva la integridad de los vasos epigástricos y en su lugar manipula los vasos femorales, que son más resistentes. Compartimos nuestra experiencia y herramientas para mejorar el estudio de este fenómeno y aumentar la replicabilidad de este procedimiento.

Protocolo

El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital General de Massachusetts aprobó el protocolo experimental (IACUC- protocolo #2022N000099). Los autores siguieron la lista de verificación de la guía ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments) para este trabajo. Todos los animales recibieron atención humanitaria siguiendo la Guía del Instituto Nacional de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Un total de 12 ratas Lewis macho (250-350 g, 8-10 semanas de edad) se utilizaron para todos los experimentos.

1. Preparación de animales

NOTA: Las ratas tienen una alta tasa metabólica y reservas de grasa limitadas; Por lo tanto, no los tenga ayuno antes de la cirugía y nunca restrinja el agua antes de la cirugía.

1. Para todos los procedimientos, sedar al animal usando isoflurano al 3% -5% en la cámara del vaporizador de precisión de isoflurano (ver Tabla de materiales). Cuando el animal esté bien sedado, reduzca la dosis de isoflurano al 1% -3% a través de un cono nasal.
   NOTA: Un segundo investigador debe monitorear continuamente la frecuencia respiratoria y adaptar la dosis de isoflurano.
2. A los 2 días antes de la cirugía inicial, coloque un collar electrónico de plástico (del tamaño de una rata; consulte la Tabla de materiales) en el animal y use una sutura de nylon 3-0 para asegurar el collar electrónico en los lados dorsal y ventral del cuello del animal. Espere 2 días para la aclimatación a este collar electrónico; Debe ajustarse perfectamente pero no obstruir las vías respiratorias del animal.

2. Cuidados preoperatorios

1. El día de la cirugía inicial, afeite la cara anterior inferior del abdomen, despejando el área desde la parte lateral del animal hasta un poco más allá de la línea media.
2. Luego, use un producto depilatorio (crema depilatoria; ver Tabla de materiales) para eliminar todo el vello restante en esta área (la cara anterior inferior del abdomen como se describe en el paso anterior).
3. Lave y seque bien el área con exfoliante quirúrgico y solución de betadina (povidona yodada al 10%).
4. Administrar 0,05 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea.

3. Monitorización intraoperatoria

1. Asegúrese de que el animal permanezca con isoflurano al 1% -3% a través de un vaporizador de precisión y un cono nasal durante toda la cirugía. Controle la frecuencia respiratoria, la respiración y el nivel de saturación de oxígeno del animal mediante la observación visual y un oxímetro de pulso de roedor hecho para una rata.
   NOTA: La frecuencia respiratoria típica es de 80-90 ciclos por minuto^14,15. Cualquier reacción que indique conciencia observada durante la cirugía requiere aumentar la tasa de isoflurano.
2. Coloque al animal en una almohadilla de calentamiento durante toda la cirugía, ya que la temperatura corporal de los roedores se enfría rápidamente bajo anestesia.

4. Recolección del colgajo epigástrico

1. Coloque al animal en posición supina. Afeite el abdomen desde debajo del pliegue inguinal hasta por encima del nivel del proceso xifoides.
2. Usando una pluma de piel estéril y una regla, primero marque la línea media del abdomen del animal y luego el pliegue inguinal. Una incisión a lo largo de la línea de pliegue inguinal expone los vasos epigástricos inferiores que se ramifican de los vasos femorales.
   1. Antes de la incisión, dibuje el colgajo futuro como un óvalo o un rectángulo de hasta 6 cm verticalmente y 3 cm horizontalmente, extendiéndose cranealmente desde el pliegue inguinal.
   2. Dibuja cinco o seis marcas equidistantes perpendiculares a los límites del colgajo. Estos sirven como guías para realinear mejor la piel después de que el colgajo se haya levantado y se suture de nuevo en su lugar (Figura 1).
3. Usando tijeras Ragnell (ver Tabla de materiales), haga una incisión longitudinal de 3-4 cm en el pliegue inguinal.
   NOTA: Los investigadores deben tener precaución y tirar de la piel hacia arriba para evitar dañar los vasos.
4. Exponga e identifique los vasos femorales y epigástricos utilizando pinzas microquirúrgicas # 4 joyeros (ver Tabla de materiales), abriendo y cerrando los fórceps para separar la fascia y obtener acceso a los vasos que están debajo de la almohadilla de grasa inguinal.
5. Use la incisión inguinal para comenzar la incisión del colgajo usando las tijeras Ragnell. Preste atención para socavar todo el grosor de la piel y el tejido conectivo sobre el músculo abdominal.
   1. Para facilitar la recolección del colgajo, asegúrese de que las tijeras sigan el plano de disección correcto empujando hacia el músculo y extendiendo las hojas de las tijeras. Realice este socavamiento de la solapa moviéndose en una dirección coordinada alrededor del dibujo de la solapa.
      NOTA: Para determinar el plano adecuado, no deben permanecer microvasos por debajo del plano de disección.
6. A medida que la punta inicial del colgajo se libera de la piel circundante, continúe la obtención del colgajo socavando desde la parte distal a la proximal, utilizando las puntas de tijera de Ragnell para separar el colgajo del músculo mientras cauteriza cualquier vaso perforante y vasos del plexo dérmico alrededor del colgajo. Esto asegura que toda la sangre fluya hacia el colgajo a través de los vasos epigástricos.
   NOTA: Se debe prestar atención a no dañar la vasculatura del colgajo tirando con demasiada fuerza o torciendo la piel mientras se cosecha el colgajo. Se sugiere colocar la parte liberada del colgajo cuidadosamente sobre el pulgar de la mano del cirujano mientras se trabaja en la parte proximal del colgajo.
7. Una vez que el colgajo se cosecha por completo, las ramas de los vasos epigástricos inferiores superficiales son visibles en el aspecto profundo de la piel. Trate de encapsular la totalidad de ambas ramas del SIEA con el colgajo levantando suavemente el colgajo hacia arriba para visualizar los vasos.
8. Una vez que se cosecha el colgajo, separe las almohadillas de grasa en el aspecto inferior en los lados medial y lateral del colgajo. Use la cauterización bipolar (consulte la Tabla de materiales) para cauterizar las almohadillas de grasa cerca del borde de la incisión, prestando atención a no dañar el pedículo epigástrico inferior superficial (Figura 2).

Figura 1: Dibujo del colgajo en el abdomen del animal. La línea media se utiliza como marcador para localizar la ubicación del colgajo epigástrico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Solap totalmente elevado. La almohadilla de grasa se conserva en la parte proximal del colgajo para preservar la vascularización proveniente del pedículo epigástrico inferior superficial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Preparación de vasos e inducción de isquemia

NOTA: El colgajo se cosecha completamente en esta etapa, pero los vasos aún no están preparados para el preacondicionamiento isquémico.

1. Antes de la preparación del vaso femoral, inyecte una dosis única de 17,5 UI de heparina sódica a través de la vena del pene.
   NOTA: Esta inyección se realiza exponiendo el glande, sosteniendo el pene externamente usando pinzas Adson atraumáticas, identificando la vena del pene e inyectando superficialmente y a lo largo de la vena del pene con una jeringa de 27 G.
2. Para crear una mejor exposición, coloque al animal dentro de un retractor de autoretención Lone Star (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Los soportes elásticos Lone Star alejan la piel del sitio quirúrgico, lo que permite una mejor vista de los vasos. El investigador ahora debe trabajar bajo un microscopio quirúrgico (aumento de 40x).
3. Para exponer los vasos, use dos pinzas microquirúrgicas # 4 para diseccionar los vasos femorales tanto proximal como distalmente a la aparición de los vasos epigástricos superficiales. No sostenga los vasos directamente, sino que use los fórceps para separar suavemente el tejido conectivo capa por capa abriendo y cerrando los fórceps verticalmente a los vasos.
4. En los vasos femorales distales, limpie la fascia y libere suavemente el nervio de la arteria y la vena. Usando un 8-0 sutura de nylon (consulte la Tabla de materiales), ligar los vasos femorales distales eludiendo el soporte de la aguja microquirúrgica debajo de la arteria y la vena, sujetando la sutura y atando estos vasos (Figura 3). El nervio no debe ser dañado ni atado para minimizar la morbilidad postoperatoria.
   NOTA: Los cirujanos pueden usar uno de los fórceps para tirar suavemente de la fascia lateral al nervio con una mano y usar otro par para separar completamente el nervio de los vasos.
5. Usando un 8-0 sutura, ligar los vasos distales justo después de la aparición de los vasos epigástricos, dejando una distancia de 1 mm después del origen pedicular. Esto asegura que ningún flujo inverso pase a través del SIEA desde las ramas profundas durante las fases isquémicas.
   NOTA: La figura 3 muestra los vasos femorales distales ligados después de la aparición del pedículo SIEA.
6. En los vasos femorales proximales, repita el mismo proceso de limpieza del tejido conectivo. Sin embargo, separe la arteria y la vena entre sí para permitir un pinzamiento eficiente. Esto se puede lograr colocando suavemente fórceps cerrados entre la arteria y la vena y abriendo lentamente los tforceps en la dirección de carrera de los vasos.
7. Para inducir isquemia intermitente, coloque pinzas microquirúrgicas por separado en cada arteria y vena femoral proximal (Figura 4).
8. Cuando se completen las lesiones isquémicas, suturar el colgajo a su posición original, alineando las marcas tal como se dibujaron antes del operatorio (paso 4.2.2). Suture el colgajo usando una sutura con nylon 3-0 (ver Tabla de materiales), comenzando en el pliegue inguinal medialmente, alrededor del colgajo y terminando en el pliegue inguinal lateralmente.
   NOTA: A lo largo del pliegue inguinal, se puede usar la misma sutura para colocar puntos interrumpidos. Esto permite a los investigadores abrir esta área sin afectar el cierre del colgajo.
9. Para verificar el suministro de sangre al colgajo, inyecte 0,25 ml de fluoresceína sódica estéril (10%, ver Tabla de materiales) en la vena del pene utilizando la misma técnica y herramientas descritas para la inyección de solución salina de heparina (paso 5.1). Después de 3 minutos, encienda una lámpara UV-366 nm de onda larga (luz de excitación fluoresceína) para revelar las áreas fluorescentes correspondientes a las áreas perfundidas.
10. Después del cierre y la verificación, extienda metronidazol triturado (consulte la Tabla de materiales) a lo largo de las suturas para evitar la automutilación, y rocíe vendaje líquido en la misma área.
11. Antes de la recuperación del animal de la anestesia, administrar carprofeno (2-5 mg / kg) por vía subcutánea.
12. Los investigadores ahora pueden acceder a los vasos femorales, la única fuente de alimentación para el colgajo, para probar regímenes experimentales de preacondicionamiento isquémico durante varios días seguidos. En todos los días de la cirugía, proporcione una dosis de 2-5 mg / kg de carprofeno por vía subcutánea.
13. Al final del período de preacondicionamiento isquémico, para eliminar el colgajo del suministro de sangre epigástrica, cauterice inferior a la almohadilla de grasa a lo largo del borde inferior del colgajo.

Figura 3: Vista microscópica de los vasos femorales. Los vasos femorales distales están atados. El nervio se ha conservado. El lado de la disección es el pliegue inguinal derecho (R). Ampliación: 40x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Pinzamiento de los vasos femorales proximales utilizando dos pinzas microquirúrgicas separadas. Esto permite un mejor control del pinzamiento, asegurando la ausencia de flujo venoso arterial y retrógrado. (A) muestra los dos vasos femorales izquierdos (L) sujetados. Los vasos epigástricos inferiores superficiales son visibles (SIEA/SIEV). (B) muestra una arteria femoral pinzada y una vena femoral antes del pinzamiento, en el pliegue inguinal derecho del animal (R). Ampliación: 40x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Cuidados postoperatorios

1. Administrar carprofeno (2-5 mg/kg) por vía subcutánea una vez al día durante 4 días después de la operación y una vez después de cualquier sedación suplementaria.
2. Durante las primeras 24 h, observe al animal dos veces. Luego, evalúe el animal y el colgajo al menos una vez al día hasta el final del estudio.
   NOTA: El animal debe ser brillante, alerta y reactivo. Si hay signos de infecciones oportunistas sistémicas (es decir, letargo o pérdida de peso), el animal debe ser sacrificado siguiendo los protocolos aprobados por la institución.
3. Controle el colgajo para detectar necrosis temprana (antes de la ligadura en el día postoperatorio 5 [POD5]), dehiscencia del sitio quirúrgico, infección, hematoma, isquemia y / o autofagia del colgajo.
4. Si hay dehiscencia en el sitio quirúrgico, desbridar los márgenes de la cicatriz, limpiar el sitio con povidona yodada al 10% antes de enjuagar bien con agua estéril o solución salina estéril, y cerrar la herida con suturas de nylon 3-0 interrumpidas.
5. Al final del estudio, eutanasia al animal con una inyección IV de 0.1-0.2 mL de solución de fenobarbital sódico al 31% o con el protocolo recomendado por el IACUC local. Confirmar la muerte por la ausencia de latidos cardíacos y movimientos respiratorios.

Resultados

Todos los colgajos fueron viables en POD5, mostrando una buena vascularización por el SIEA solo. La figura 5 muestra el colgajo antes y después de la inyección IV de fluoresceína, mostrando una vascularización completa.

Figura 5: Angiografía con fluoresceína intravenosa inmediata (POD0).

Discusión

Este artículo describe un modelo de colgajo fasciocutáneo reproducible cosechado en ratas, lo que permite la evaluación de IP. Este protocolo quirúrgico paso a paso proporciona a los grupos de investigación un modelo confiable para probar diferentes regímenes de PI. Al prevenir cualquier vascularización que no sea el pedículo, este modelo permite estudiar la neovascularización del colgajo desde el lecho de la herida y el margen. Este estudio realizó la ligadura en POD5, ya que estudios previos han observado la ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe Luer-Lok Tip	BD	309628
3-0 Ethilon 18” Black Monofilament Nylon suture	Ethicon	ETH-663H
8-0 Ethilon 12” Black Monofilament Nylon suture	Ethicon	1716G
Adson Atraumatic Forceps	Aesculap Surgical Instruments	BD51R
Akorn Fluorescein Injection USP 10% Single Dose Vial 5 mL	Akorn	17478025310
Betadine Solution 5% Povidone-Iodine Antiseptic Microbicide	PBS Animal Health	11205
Bipolar Cords	ASSI	ASSI.ATK26426
Buprenorphine Hydrochloride Injection	PAR Pharmaceutical	3003406C	This concentration needs to be diluted for rodents.
Depilatory product – Nair Hair remover lotion	Nair	NC0132811
Ear tag applier	World Precision Instruments	NC0038715
Gauze Sponges	Curity	6939
Isoflurane Auto-Flow Anesthesia Machine	E-Z Systems	EZ-190F
Isoflurane, USP	Patterson Veterinary	1403-704-06
Jewelers Bipolar Forceps Non-Stick 11 cm, straight pointed tip, 0.25 mm tip diameter	ASSI	ASSI.BPNS11223
Lone Star elastic stays	Cooper Surgical	3311-1G
Lone star Self-retaining retractor	Cooper Surgical	3304G
Metronidazole tablets USP	Teva	500111-333-06
Micro spring handle scissors	AROSurgical	11.603.14
Microscope (surgical)	Leica	M525 F40
Microsurgical clamp applying forceps	Ambler Surgical	31-906
Microsurgical clamps (x2)	Millennium Surgical	18-B1V
Microsurgical Dumont #4 forceps	Dumont Swiss made	1708-4TM-PO
Microsurgical needle holder	ASSI	B-14-8
Needle holder	World Precision Instruments	501246
Nosecone for Anesthesia	World Precision Instruments	EZ-112
Pixel analysis software	GNU Image Manipulation Program v2.10	GIMP	GNU Open licence
PrecisionGlide Needle 27 G	BD	305109
Ragnell Scissors	Roboz Surgical	RS-6015
Rimadyl (carprofen)	Zoetis	10000319	This concentration needs to be diluted for rodents
Scientific Elizabethan collar (e-collar) for Rats	Braintree Scientific	NC9263311
Small animal ear tag	National Band & Tag Company	Style 1005-1
Small Animal Heated Operating Table (Adjustable)	Peco Services Ltd	69023
Sterile towel drape	Dynarex Corporation	4410
Sterile water for injection and irrigation	Hospira	0409488724-1
Surgical scrub – BD ChloraPrep Hi-Lite Orange 3 mL applicator with Sterile Solution	BD	930415
UV lamp	UVP	UVL-56
Webcol Alcohol prep pads	Simply Medical	5110