Le volet axial de l’artère épigastrique inférieure superficielle pour étudier les effets de préconditionnement ischémique dans un modèle de rat

Résumé

Ce protocole décrit la récolte, la suture et la surveillance des lambeaux fasciocutanés chez le rat qui permettent une bonne visualisation et manipulation du flux sanguin à travers les vaisseaux épigastriques inférieurs superficiels au moyen du clampage et de la ligature des vaisseaux fémoraux. Ceci est essentiel pour les études impliquant un préconditionnement ischémique.

Résumé

Les lambeaux fasciocutanés (FCF) sont devenus l’étalon-or pour la reconstruction de défauts complexes en chirurgie plastique et reconstructive. Cette technique de préservation musculaire permet de transférer des tissus vascularisés pour couvrir tout défaut important. Le FCF peut être utilisé comme rabats pédiculés ou comme rabats libres; cependant, dans la littérature, les taux d’échec pour le FCF pédiculé et le FCF libre sont supérieurs à 5%, ce qui laisse place à l’amélioration de ces techniques et à l’expansion des connaissances dans ce domaine. Le préconditionnement ischémique (PI) a été largement étudié, mais les mécanismes et l’optimisation du régime I.P. restent à déterminer. Ce phénomène est en effet peu exploré en chirurgie plastique et reconstructive. Ici, un modèle chirurgical est présenté pour étudier le régime I.P. dans un modèle de lambeau fasciocutané axial de rat, décrivant comment évaluer de manière sûre et fiable les effets de I.P. sur la survie du lambeau. Cet article décrit l’intervention chirurgicale complète, y compris des suggestions pour améliorer la fiabilité de ce modèle. L’objectif est de fournir aux chercheurs un modèle reproductible et fiable pour tester divers schémas de préconditionnement ischémique et évaluer leurs effets sur la capacité de survie des volets.

Introduction

La chirurgie plastique et reconstructive est en constante évolution. Le développement des lambeaux musculaires, fasciocutanés et perforateurs a permis d’offrir des reconstructions de meilleure qualité tout en réduisant la morbidité. En combinant ces connaissances anatomiques améliorées avec des compétences techniques améliorées, les chirurgiens reconstructeurs peuvent effectuer des transferts de lambeaux libres lorsque les défauts ne sont pas proches d’une solution locale. Cependant, alors que la chirurgie du lambeau perforateur est actuellement la technique la plus avancée en chirurgie reconstructive, la littérature rapporte un taux d’échec de 5% dans les transferts de lambeaux libres ^1,2,3, et jusqu’à 20% pour la reconstruction de lambeau pédiculé 4,5,6. Une défaillance partielle à totale du volet se produit lorsque le pédicule du volet est compromis, il est donc essentiel de rechercher continuellement des améliorations aux techniques actuelles. Une des méthodes pour améliorer la survie du lambeau est de favoriser sa néovascularisation sur le lit de la plaie, permettant ainsi la perfusion par une source autre que le pédicule. Le préconditionnement ischémique (PI) a été initialement décrit dans un modèle cardiaque⁷, démontrant qu’un organe exposé à une ischémie contrôlée survit à un degré plus élevé après avoir perdu son approvisionnement en sang primaire en subissant une néovascularisation induite par l’ischémie. Plusieurs auteurs ont étudié ce principe fondamental pour optimiser la survie des lambeaux dans les modèles précliniques et cliniques ^8,9,10.

L’avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes pour améliorer la survie du lambeau est sa facilité de mise en œuvre, consistant en des tests de pince / pince de la source sanguine. Dans le modèle du rat, les auteurs précédents ont utilisé le lambeau superficiel de l’artère épigastrique inférieure (SIEA) pour étudier l’I.P. en serrant le pédicule principal^11,12,13. Néanmoins, plusieurs problèmes techniques peuvent être rencontrés avec ce modèle, et la littérature manque de protocoles bien décrits.

Par conséquent, ce travail vise à fournir aux chercheurs une description détaillée d’une technique d’approvisionnement en volets SIEA chez le rat avec une dissection étendue des vaisseaux fémoraux pour permettre des études I.P. sur un modèle de volet fasciocutané axial. Ce modèle conserve l’intégrité des vaisseaux épigastriques et manipule plutôt les vaisseaux fémoraux, qui sont plus résistants. Nous partageons notre expérience et nos outils pour améliorer l’étude de ce phénomène et augmenter la réplicabilité de cette procédure.

Protocole

Le Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee a approuvé le protocole expérimental (protocole IACUC- #2022N000099). Les auteurs ont suivi la liste de contrôle des lignes directrices ARRIVE (Animal Research: Reporting In Vivo Experiments) pour ce travail. Tous les animaux ont reçu des soins sans cruauté conformément au Guide de l’Institut national de la santé pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Au total, 12 rats Lewis mâles (250-350 g, âgés de 8 à 10 semaines) ont été utilisés pour toutes les expériences.

1. Préparation des animaux

REMARQUE: Les rats ont un taux métabolique élevé et des réserves de graisse limitées; Par conséquent, ne les ayez pas rapidement avant la chirurgie et ne limitez jamais l’eau avant la chirurgie.

1. Pour toutes les procédures, endormir l’animal en utilisant de l’isoflurane à 3% à 5% dans la chambre du vaporisateur de précision à l’isoflurane (voir le tableau des matériaux). Lorsque l’animal est bien sous sédatif, réduire la dose d’isoflurane à 1 % à 3 % par un cône nasal.
   REMARQUE : Un deuxième chercheur doit surveiller en permanence la fréquence respiratoire et adapter la dose d’isoflurane.
2. À 2 jours avant la chirurgie initiale, placez un collier électronique en plastique (de la taille d’un rat; voir le tableau des matériaux) sur l’animal et utilisez une suture en nylon 3-0 pour fixer le collier électronique sur les côtés dorsal et ventral du cou de l’animal. Prévoir 2 jours pour l’acclimatation à ce collier électronique; Il doit être bien ajusté mais ne pas obstruer les voies respiratoires de l’animal.

2. Soins préopératoires

1. Le jour de la chirurgie initiale, rasez la partie antérieure inférieure de l’abdomen, en dégageant la zone de la partie latérale de l’animal jusqu’à légèrement au-delà de la ligne médiane.
2. Ensuite, utilisez un produit dépilatoire (crème dépilatoire; voir Tableau des matières) pour enlever tous les poils restants dans cette zone (la face antérieure inférieure de l’abdomen comme décrit à l’étape précédente).
3. Bien laver et sécher la zone avec un gommage chirurgical et une solution de bétadine (10% povidone-iode).
4. Administrer 0,05 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée.

3. Surveillance peropératoire

1. Assurez-vous que l’animal reste sur 1% -3% isoflurane via un vaporisateur de précision et un cône nasal tout au long de la chirurgie. Surveillez la fréquence respiratoire, la respiration et le niveau de saturation en oxygène de l’animal par observation visuelle et un oxymètre de pouls de rongeur conçu pour un rat.
   NOTE: La fréquence respiratoire typique est de 80-90 cycles par minute^14,15. Toute réaction indiquant la conscience observée pendant la chirurgie nécessite une augmentation du taux d’isoflurane.
2. Placez l’animal sur un coussin chauffant pendant toute la durée de la chirurgie, car la température corporelle des rongeurs se refroidit rapidement sous anesthésie.

4. Prélèvement épigastrique des lambeaux

1. Placez l’animal en décubitus dorsal. Rasez l’abdomen du dessous du pli inguinal au-dessus du niveau du processus xiphoïde.
2. À l’aide d’un stylo et d’une règle à peau stérile, marquez d’abord la ligne médiane de l’abdomen de l’animal, puis le pli inguinal. Une incision le long de la ligne de pli inguinal expose les vaisseaux épigastriques inférieurs ramifiés des vaisseaux fémoraux.
   1. Avant l’incision, dessinez le futur lambeau sous la forme d’un ovale ou d’un rectangle jusqu’à 6 cm verticalement et 3 cm horizontalement, en s’étendant crânienment à partir du pli inguinal.
   2. Dessinez cinq ou six marques équidistantes perpendiculaires aux limites du volet. Ceux-ci servent de guides pour mieux réaligner la peau une fois que le lambeau a été soulevé et qu’il est suturé à nouveau en place (Figure 1).
3. À l’aide de ciseaux Ragnell (voir Tableau des matériaux), faites une incision longitudinale de 3 à 4 cm sur le pli inguinal.
   REMARQUE: Les chercheurs doivent faire preuve de prudence et tirer la peau vers le haut pour éviter d’endommager les vaisseaux.
4. Exposer et identifier les vaisseaux fémoraux et épigastriques à l’aide de pinces microchirurgicales #4 des bijoutiers (voir Tableau des matériaux), en ouvrant et en fermant les pinces pour séparer le fascia et accéder aux vaisseaux qui se trouvent sous le coussinet adipeux inguinal.
5. Utilisez l’incision inguinale pour commencer l’incision à lambeau à l’aide des ciseaux Ragnell. Faites attention à saper toute l’épaisseur de la peau et du tissu conjonctif sur le muscle abdominal.
   1. Pour faciliter la récolte des volets, assurez-vous que les ciseaux suivent le bon plan de dissection en poussant vers le muscle et en écartant les lames des ciseaux. Effectuez ce sapage du volet en vous déplaçant dans une direction coordonnée autour du dessin du volet.
      NOTE: Pour déterminer le plan approprié, aucun microvaisseau ne doit rester présent sous le plan de dissection.
6. Lorsque l’extrémité initiale du lambeau est libérée de la peau environnante, poursuivre l’approvisionnement du lambeau en sapant de la partie distale à la partie proximale, en utilisant les pointes de ciseaux Ragnell pour séparer le lambeau du muscle tout en cautérisant les vaisseaux perforateurs et les vaisseaux du plexus dermique autour du lambeau. Cela garantit que tout le sang circule vers le lambeau via les vaisseaux épigastriques.
   NOTE: Il faut veiller à ne pas endommager le système vasculaire du lambeau en tirant trop fort ou en tordant la peau pendant la récolte du lambeau. Il est suggéré de placer soigneusement la partie libérée du lambeau sur le pouce de la main du chirurgien tout en travaillant sur la partie proximale du lambeau.
7. Une fois le lambeau entièrement récolté, les branches des vaisseaux épigastriques inférieurs superficiels sont visibles sur l’aspect profond de la peau. Essayez d’encapsuler l’intégralité des deux branches du SIEA avec le volet en soulevant doucement le volet vers le haut pour visualiser les vaisseaux.
8. Une fois le lambeau récolté, séparez les coussinets graisseux sur la face inférieure sur les côtés médial et latéral du rabat. Utilisez la cautérisation bipolaire (voir le tableau des matériaux) pour cautériser les coussinets graisseux près du bord de l’incision, tout en veillant à ne pas endommager le pédicule épigastrique superficiel inférieur (Figure 2).

Figure 1 : Dessin du lambeau sur l’abdomen de l’animal. La ligne médiane est utilisée comme marqueur pour localiser l’emplacement du lambeau épigastrique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Rabat entièrement surélevé. Le coussinet graisseux est conservé à la partie proximale du lambeau pour préserver la vascularisation provenant du pédicule épigastrique superficiel inférieur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Préparation des vaisseaux et induction de l’ischémie

REMARQUE : Le volet est entièrement récolté à ce stade, mais les vaisseaux ne sont pas encore préparés pour le préconditionnement ischémique.

1. Avant la préparation du vaisseau fémoral, injecter une dose unique de 17,5 UI d’héparine de sodium par la veine pénienne.
   REMARQUE: Cette injection se fait en exposant le gland, en tenant le pénis à l’extérieur à l’aide d’une pince Adson atraumatique, en identifiant la veine pénienne et en injectant superficiellement et le long de la veine du pénis à l’aide d’une seringue de 27 G.
2. Pour créer une meilleure exposition, placez l’animal dans un rétracteur auto-retenant Lone Star (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE: Les haubans élastiques Lone Star éloignent la peau du site chirurgical, ce qui permet une meilleure vue des vaisseaux. Le chercheur doit maintenant travailler sous un microscope chirurgical (grossissement 40x).
3. Pour exposer les vaisseaux, utilisez deux pinces microchirurgicales #4 pour disséquer les vaisseaux fémoraux à la fois proximale et distale à l’émergence des vaisseaux épigastriques superficiels. Ne tenez pas les vaisseaux directement, mais utilisez plutôt les pinces pour séparer doucement le tissu conjonctif couche par couche en ouvrant et en fermant la pince verticalement aux vaisseaux.
4. Sur les vaisseaux fémoraux distaux, nettoyez le fascia et libérez doucement le nerf de l’artère et de la veine. Utilisation d’un 8-0 suture en nylon (voir le tableau des matériaux), ligaturer les vaisseaux fémoraux distaux en contournant le porte-aiguille microchirurgical sous l’artère et la veine, en serrant la suture et en attachant ces vaisseaux (Figure 3). Le nerf ne doit pas être blessé ni attaché pour minimiser la morbidité postopératoire.
   REMARQUE: Les chirurgiens peuvent utiliser l’une des pinces pour tirer doucement le fascia latéral au nerf avec une main et utiliser une autre paire pour séparer complètement le nerf des vaisseaux.
5. Utilisation d’un 8-0 suture, ligaturer les vaisseaux distaux juste après l’émergence des vaisseaux épigastriques, en laissant une distance de 1 mm après l’origine du pédicule. Cela garantit qu’aucun flux inverse ne traverse le SIEA à partir des branches profondes pendant les phases ischémiques.
   NOTE: La figure 3 montre les vaisseaux fémoraux distaux ligaturés après l’émergence du pédicule SIEA.
6. Sur les vaisseaux fémoraux proximaux, répétez le même processus de nettoyage du tissu conjonctif. Cependant, séparez l’artère et la veine l’une de l’autre pour permettre un serrage efficace. Cela peut être réalisé en plaçant doucement des pinces fermées entre l’artère et la veine et en ouvrant lentement les pinces dans le sens de marche des vaisseaux.
7. Pour induire une ischémie intermittente, placez des pinces microchirurgicales séparément sur chaque artère fémorale proximale et veine (Figure 4).
8. Lorsque les lésions ischémiques sont terminées, suturer le volet à sa position initiale, en alignant les marques comme dessinées avant l’opération (étape 4.2.2). Suturer le volet à l’aide d’une suture de course avec du nylon 3-0 (voir le tableau des matériaux), en commençant par le pli inguinal médialement, autour du rabat, et en terminant au pli inguinal latéralement.
   REMARQUE: Le long du pli inguinal, la même suture peut être utilisée pour placer des points interrompus. Cela permet aux chercheurs d’ouvrir cette zone sans affecter la fermeture du volet.
9. Pour vérifier l’apport sanguin au lambeau, injecter 0,25 mL de fluorescéine stérile sodique (10 %, voir le tableau des matières) dans la veine du pénis en utilisant la même technique et les mêmes outils que ceux décrits pour l’injection de solution saline d’héparine (étape 5.1). Après 3 min, faire briller une lampe UV-366 nm à ondes longues (lumière d’excitation à la fluorescéine) pour révéler les zones fluorescentes correspondant aux zones perfusées.
10. Après la fermeture et la vérification, étaler le métronidazole broyé (voir le tableau des matières) le long des sutures pour prévenir l’automutilation et vaporiser un pansement liquide dans la même zone.
11. Avant la récupération de l’animal de l’anesthésie, administrer du carprofène (2-5 mg / kg) par voie sous-cutanée.
12. Les chercheurs peuvent maintenant accéder aux vaisseaux fémoraux, la seule source d’alimentation du volet, pour tester des régimes expérimentaux de préconditionnement ischémique pendant plusieurs jours d’affilée. Chaque jour de chirurgie, fournir une dose de 2-5 mg / kg de Carprofène par voie sous-cutanée.
13. À la fin de la période de préconditionnement ischémique, pour retirer le lambeau de l’approvisionnement en sang épigastrique, cautériser inférieur au coussinet graisseux le long du bord inférieur du lambeau.

Figure 3 : Vue microscopique des vaisseaux fémoraux. Les vaisseaux fémoraux distaux sont attachés. Le nerf a été préservé. Le côté dissection est le pli inguinal droit (R). Grossissement: 40x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Serrage des vaisseaux fémoraux proximaux à l’aide de deux pinces microchirurgicales distinctes. Cela permet un meilleur contrôle du serrage, assurant l’absence de flux veineux artériel et rétrograde. (A) montre les deux vaisseaux fémoraux gauche (L) serrés. Les vaisseaux épigastriques inférieurs superficiels sont visibles (SIEA/SIEV). (B) présente une artère fémorale serrée et une veine fémorale avant serrage, sur le pli inguinal droit de l’animal (R). Grossissement: 40x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Soins postopératoires

1. Administrer du carprofène (2-5 mg / kg) par voie sous-cutanée une fois par jour pendant 4 jours postopératoires et une fois après toute sédation supplémentaire.
2. Pendant les 24 premières h, observez l’animal deux fois. Ensuite, évaluez l’animal et le volet au moins une fois par jour jusqu’à la fin de l’étude.
   REMARQUE : L’animal doit être vif, alerte et réactif. S’il y a des signes d’infections opportunistes systémiques (c.-à-d. léthargie ou perte de poids), l’animal doit être euthanasié selon les protocoles approuvés par l’établissement.
3. Surveiller le lambeau pour détecter une nécrose précoce (avant la ligature du jour 5 postopératoire [POD5]), une déhiscence du site chirurgical, une infection, un hématome, une ischémie et / ou une autophagie du lambeau.
4. S’il y a déhiscence du site chirurgical, débrider les bords de la cicatrice, nettoyer le site avec 10% de povidone iodée avant de rincer abondamment avec de l’eau stérile ou une solution saline stérile, et fermer la plaie à l’aide de sutures en nylon 3-0 interrompues.
5. À la fin de l’étude, euthanasier l’animal avec une injection intraveineuse de 0,1 à 0,2 mL de solution de phénobarbital de sodium à 31 % ou avec le protocole recommandé par l’IACUC local. Confirmer la mort par l’absence de battements cardiaques et de mouvements respiratoires.

Résultats

Tous les volets étaient viables sur POD5, montrant une bonne vascularisation par le SIEA seul. La figure 5 montre le lambeau avant et après l’injection de fluorescéine IV, montrant une vascularisation complète.

Figure 5 : Angiographie immédiate à la fluorescéine intraveineuse (POD0)....

Discussion

Cet article décrit un modèle de lambeau fasciocutané reproductible récolté chez le rat, permettant une évaluation I.P. Ce protocole chirurgical étape par étape donne aux groupes de recherche un modèle fiable pour tester différents schémas IP. En empêchant toute vascularisation autre que le pédicule, ce modèle permet d’étudier la néovascularisation du lambeau à partir du lit et de la marge de la plaie. Cette étude a effectué la ligature sur POD5, car des études antérieures ont observé l’autonomis...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Syringe Luer-Lok Tip	BD	309628
3-0 Ethilon 18” Black Monofilament Nylon suture	Ethicon	ETH-663H
8-0 Ethilon 12” Black Monofilament Nylon suture	Ethicon	1716G
Adson Atraumatic Forceps	Aesculap Surgical Instruments	BD51R
Akorn Fluorescein Injection USP 10% Single Dose Vial 5 mL	Akorn	17478025310
Betadine Solution 5% Povidone-Iodine Antiseptic Microbicide	PBS Animal Health	11205
Bipolar Cords	ASSI	ASSI.ATK26426
Buprenorphine Hydrochloride Injection	PAR Pharmaceutical	3003406C	This concentration needs to be diluted for rodents.
Depilatory product – Nair Hair remover lotion	Nair	NC0132811
Ear tag applier	World Precision Instruments	NC0038715
Gauze Sponges	Curity	6939
Isoflurane Auto-Flow Anesthesia Machine	E-Z Systems	EZ-190F
Isoflurane, USP	Patterson Veterinary	1403-704-06
Jewelers Bipolar Forceps Non-Stick 11 cm, straight pointed tip, 0.25 mm tip diameter	ASSI	ASSI.BPNS11223
Lone Star elastic stays	Cooper Surgical	3311-1G
Lone star Self-retaining retractor	Cooper Surgical	3304G
Metronidazole tablets USP	Teva	500111-333-06
Micro spring handle scissors	AROSurgical	11.603.14
Microscope (surgical)	Leica	M525 F40
Microsurgical clamp applying forceps	Ambler Surgical	31-906
Microsurgical clamps (x2)	Millennium Surgical	18-B1V
Microsurgical Dumont #4 forceps	Dumont Swiss made	1708-4TM-PO
Microsurgical needle holder	ASSI	B-14-8
Needle holder	World Precision Instruments	501246
Nosecone for Anesthesia	World Precision Instruments	EZ-112
Pixel analysis software	GNU Image Manipulation Program v2.10	GIMP	GNU Open licence
PrecisionGlide Needle 27 G	BD	305109
Ragnell Scissors	Roboz Surgical	RS-6015
Rimadyl (carprofen)	Zoetis	10000319	This concentration needs to be diluted for rodents
Scientific Elizabethan collar (e-collar) for Rats	Braintree Scientific	NC9263311
Small animal ear tag	National Band & Tag Company	Style 1005-1
Small Animal Heated Operating Table (Adjustable)	Peco Services Ltd	69023
Sterile towel drape	Dynarex Corporation	4410
Sterile water for injection and irrigation	Hospira	0409488724-1
Surgical scrub – BD ChloraPrep Hi-Lite Orange 3 mL applicator with Sterile Solution	BD	930415
UV lamp	UVP	UVL-56
Webcol Alcohol prep pads	Simply Medical	5110