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Resumen

Este documento presenta un protocolo detallado para criar la mariposa blanca de la col en condiciones de laboratorio controladas con una dieta artificial, que permite manipulaciones precisas de la nutrición temprana y la exposición a toxinas. Los resultados representativos muestran cómo se puede ensayar la toxicidad de metales pesados con este protocolo.

Resumen

La mariposa blanca de la col (Pieris rapae) es un sistema importante para la investigación aplicada al control de plagas y la investigación básica en ecología conductual y nutricional. Las coles blancas se pueden criar fácilmente en condiciones controladas con una dieta artificial, lo que las convierte en un organismo modelo del mundo de las mariposas. En este artículo, se utiliza una manipulación de la exposición a metales pesados para ilustrar los métodos básicos para criar esta especie. El protocolo general ilustra cómo las mariposas pueden ser atrapadas en el campo, inducidas a poner huevos en jaulas de invernadero y transferidas como larvas a dietas artificiales. Los métodos muestran cómo las mariposas pueden ser marcadas, medidas y estudiadas para una variedad de preguntas de investigación. Los resultados representativos dan una idea de cómo las dietas artificiales que varían en componentes se pueden utilizar para evaluar el rendimiento de las mariposas en relación con una dieta de control. Más específicamente, las mariposas eran más tolerantes al níquel y menos tolerantes al cobre, con una tolerancia al zinc en algún lugar en el medio. Se discuten posibles explicaciones para estos resultados, incluida la hiperacumulación de níquel en algunas plantas huésped de mostaza y la evidencia reciente en insectos de que el cobre puede ser más tóxico de lo que se apreciaba anteriormente. Finalmente, la discusión primero revisa las variaciones del protocolo y las instrucciones para solucionar estos métodos, antes de considerar cómo la investigación futura podría optimizar aún más la dieta artificial utilizada en este estudio. En general, al proporcionar una descripción detallada en video de la cría y medición de las claras de repollo en dietas artificiales, este protocolo proporciona un recurso para usar este sistema en una amplia gama de estudios.

Introducción

La pequeña mariposa blanca de la col (Pieris rapae, en adelante "col blanca") es una especie de plaga cosmopolita de cultivos de mostaza, como la col, el brócoli y la canola 1,2,3. Al mismo tiempo, la col blanca es un poderoso sistema para la investigación en biología y un modelo de mariposa comúnmente utilizado, ya que pueden ser fácilmente criadas y manipuladas en experimentos de laboratorio controlados 4,5. La investigación sobre las mariposas blancas de la col ha proporcionado información crítica con respecto a la búsqueda de huéspedes 6,7,8, el uso de recursos de néctar9,10,11, la elección de pareja y la selección sexual 12,13,14, el desarrollo y la evolución del patrón de alas15,16,17, y las respuestas a nuevos y cambiantes Ambientes18,19. Muchas de estas ideas se basan en el hecho de que las claras de repollo pueden criarse con dietas artificiales 4,20,21, que pueden manipularse con precisión para reflejar malas condiciones nutricionales 22,23, niveles de contaminantes ecológicamente relevantes 24,25,26,27, o transiciones a nuevas plantas hospederas28,29. El presente estudio utiliza un experimento sobre la exposición a metales pesados para ilustrar los métodos básicos para criar mariposas blancas de col con una dieta artificial en el laboratorio y las medidas clave de rendimiento de larvas y adultos. Muchos aspectos de estos métodos se aplican a otras mariposas30,31 y polillas32,33,34 que pueden criarse con una dieta artificial.

En este documento, se utiliza un experimento sobre la tolerancia al metal para ilustrar los métodos generales de cría de mariposas blancas de repollo. Los metales pesados son un contaminante antropogénico común derivado de la degradación de productos humanos, procesos industriales y contaminación heredada por uso histórico en pesticidas, pinturas y otros productos35,36,37,38. Muchos metales pesados, incluidos el plomo, el cobre, el zinc y el níquel, pueden pasar del suelo y el agua al tejido vegetal 39,40,41,42, y los metales en el polvo pueden depositarse en las hojas de las plantas 43,44,45, lo que resulta en múltiples rutas de exposición a larvas de insectos fitófagos. La exposición temprana a metales pesados puede tener efectos negativos en el desarrollo animal, especialmente en el tejido neural, y los niveles altos pueden ser letales 35,36,46,47,48. Varios estudios han demostrado los efectos negativos de la exposición a metales en los insectos en desarrollo, incluyendo tanto plagas como insectos beneficiosos 49,50,51. El gran número de contaminantes de metales pesados, y el hecho de que a menudo coexisten en ambientes humanos52, significa que se necesitan métodos de laboratorio precisos en los que los investigadores puedan exponer a los insectos en desarrollo a diferentes niveles y combinaciones de diversos metales para comprender y mitigar sus efectos ambientales.

El presente trabajo contrasta los impactos de los metales comunes en la supervivencia y el desarrollo del repollo blanco, centrándose en el cobre (Cu), el zinc (Zn) y el níquel (Ni), tres contaminantes comunes en los entornos humanos. Por ejemplo, los forbs de las carreteras rurales de Minnesota contienen hasta 71 ppm Zn, 28 ppm Cu y 5 ppm Ni53. Este experimento manipula los niveles de estos metales en dietas artificiales de mariposas blancas de col a niveles correspondientes y superiores a los niveles observados en el medio ambiente. Se utiliza una dieta artificial para contrastar la toxicidad relativa de estos metales, prediciendo que las claras de col serían más sensibles a los contaminantes metálicos que no son parte integral de su fisiología (níquel) en relación con los que se producen, aunque a niveles pequeños, en enzimas y tejidos (cobre y zinc; Figura 1). En todo momento, este texto proporciona detalles metodológicos y visualizaciones de video acompañantes para ilustrar los métodos de crianza e investigación de este importante sistema modelo de mariposas.

Protocolo

Esta investigación se llevó a cabo bajo el permiso USDA APHIS P526P-13-02979.

1. Colección de mariposas experimentales

  1. Atrapa mariposas hembras adultas con una red de insectos aérea. Los blancos de col se encuentran generalmente en hábitats abiertos y perturbados con plantas de néctar y plantas hospederas (en la familia Brassicaceae) presentes.
    1. Busca cuando el sol está fuera y la temperatura es cálida. Para apuntar a las hembras, busque individuos que revoloteen lentamente, cerca del suelo y aterricen en las plantas para "tamborilear" (probar) las hojas con sus foretarsi.
  2. Coloque a las hembras en jaulas para cosechar huevos.
    NOTA: Las hembras recolectadas en el campo, en promedio, se han apareado con uno o dos machos12, y deben comenzar a poner huevos fértiles poco después de la captura. Las hembras capturadas en la naturaleza necesitan luz natural para ovipositar y aparearse, así que coloque la jaula en un invernadero o alféizar de la ventana.
  3. Hembras domésticas con una planta huésped para cosechar huevos.
    NOTA: Las hembras aceptarán una variedad de plantas huésped, incluyendo col verde, rábano, col rizada, berza y Arabidopsis, pero asegúrese de que las plantas no hayan sido tratadas con ningún pesticida.
    1. Presente las plantas hospederas en macetas o en recipientes con agua para mantener la presión de las hojas, como tallos de col rizada en tubos de agua florales.
    2. Si el investigador desea recolectar huevos y transferirlos directamente a la dieta, primero use una banda elástica para unir una hoja de la planta huésped a la parte superior de un vaso de plástico con agua, y luego estire un trozo de parafilm alrededor del borde: las hembras que tocan la hoja ovipositarán sobre la parapelícula (ver5).
  4. Asegúrese de que la jaula también contenga algo para mantener alta la humedad relativa, por ejemplo, mediante el riego diario de una planta en maceta o la humectación de una toalla, especialmente en condiciones secas. Si las plantas en maceta se riegan en la jaula, asegúrese de que haya una toalla debajo de la maceta, ya que las mariposas pueden atascarse en el agua de la piscina.
  5. Alimente a las mariposas con una solución de agua de miel diluida al 10% presentada en una esponja amarilla, que las mariposas aprenden a usar rápidamente, especialmente si se alojan con personas experimentadas.
    1. Para alentar a las mariposas a alimentarse de esponjas, colóquelas directamente en el alimentador, especialmente después de rociar ligeramente con una botella de agua, lo que a menudo hace que sobresalgan su probóscide.
    2. Para configurar el alimentador, primero enjuague bien las esponjas amarillas o naranjas y luego córtelas en cuadrados pequeños que quepan en placas de Petri de plástico de 60 mm. Cambie los comederos diariamente y limpie las esponjas en una solución de lejía suave, seguida de un enjuague completo para evitar el crecimiento de moho.

2. Hacer dietas artificiales

  1. Primero, use la receta en la Tabla 1, u otras fuentes relevantes, para determinar la receta relevante para un experimento. Hacer las modificaciones necesarias específicas para la especie focal o experimento. Imprima una receta para seguir mientras pesa los ingredientes.
  2. Pesa todos los ingredientes secos, excepto el agar, en un recipiente. Asegúrese de que los ingredientes se vuelvan a colocar en su respectiva ubicación de almacenamiento, teniendo en cuenta que varios ingredientes se almacenan a 4 ° C. Coloque la mezcla de ingredientes secos previamente pesada en una licuadora con 5 ml de aceite de linaza.
  3. Para cada lote de dieta, siga los pasos que se detallan a continuación.
    1. Mezcle 15 g de agar de malla fina con 400 ml de agua destilada en un vaso de precipitados de al menos 1 L de tamaño. Calentar en el microondas hasta que el agar esté a punto de hervir, con burbujas finas en toda la mezcla, revolviendo la mezcla cada 30-60 s para evitar que hierva.
    2. A esta mezcla de agar caliente, agregue 400 ml de agua destilada a temperatura de grifo para llevarla a una temperatura adecuada para mezclar con los ingredientes secos, ya que la mezcla de vitaminas es sensible al calor.
    3. Agregue la mezcla de agar a la licuadora y mezcle bien, raspando los bordes de la licuadora si es necesario.
  4. A medida que el agar se está calentando, coloque al menos setenta tazas de dieta de cuatro onzas en el mostrador con los bordes tocándose. Después de mezclar bien la dieta, vierta la mezcla de la licuadora en tazas de dieta, asegurándose de que la dieta cubra el fondo de cada taza.
  5. Después de que la dieta se enfríe, coloque tapas en las tazas, etiquete las tazas de dieta con el tipo de dieta, apilarlas en bandejas y almacenar hasta 1 mes a 4 ° C hasta que se use.

3. Transferencia y crianza con dietas artificiales

  1. Hojas de plantas huésped de casa con huevos de mariposa en tazas de delicatessen de 30 oz con una cubierta de malla en una cámara climática de 24 ° C. Después de 1 semana, verifique las tazas, asegurándose de que las larvas hayan eclosionado y en la etapa tardía del primer estadio o principios del segundo estadio, un buen momento para la transferencia a la dieta artificial.
  2. Transfiera las larvas a la dieta artificial con un pincel, desinfectándolas con un aerosol de lejía y un enjuague con agua entre recipientes de larvas. Transfiera tres larvas a cada taza de 4 oz. Si bien la dieta artificial es densa en energía y puede soportar altas densidades de larvas, evite empacar las larvas en tazas, ya que las enfermedades y el moho pueden propagarse en tazas con alta densidad larval.
  3. Coloque las tazas en un recipiente de plástico en sus lados para que el frass caiga al fondo de las tazas y lejos de la dieta, reduciendo el riesgo de moho y enfermedades.
    1. Aloje las tazas de dieta en condiciones de temperatura controlada con niveles de luz bajos a moderados. Controle las tazas para detectar moho y enfermedades cada 1-2 días mirando a través de las tapas transparentes.
    2. Las tazas con moho o enfermedad pueden ponerse en cuarentena o congelarse para evitar que se propaguen a otras tazas.

4. Emergencia y manipulación de adultos

  1. Permita que las larvas pupan y emerjan en las tazas de dieta. Cuando los adultos emerjan, dales unas horas para que sus alas se endurezcan antes de quitarlas para marcarlas. Retire las mariposas adultas de las copas con las manos limpias agarrando suavemente sus alas, teniendo en cuenta que agarrar las cuatro alas más cerca de su cuerpo es una sujeción más estable.
  2. Para marcar las mariposas, sostenga a los individuos secos por la cabeza y el tórax y use un sharpie de punta fina para marcar ligeramente un número en su ala posterior.
    1. Individuos sexuales que usan una combinación de marcas de alas y genitales; Las hembras generalmente tienen dos manchas negras en su ala anterior dorsal y alas posteriores más oscuras y amarillentas, mientras que los machos generalmente tienen una mancha negra más pequeña en el ala anterior dorsal sobre un fondo blanco más brillante54.
    2. Dado que esta coloración muestra variación individual y estacional, confirme el sexo utilizando rasgos abdominales: los machos tienen dos claspers en el extremo distal de su abdomen y un abdomen más estrecho en general, mientras que las hembras tienen una sola abertura genital.
  3. Transfiera a los adultos a sobres de vidrio de cera abriendo el sobre con una mano, sosteniendo la mariposa por la cabeza y el tórax, deslizándola en el sobre y agarrando las alas a través del sobre con la otra mano.
    1. Asegúrese de que las cuatro alas estén cerradas normalmente dentro del sobre.
    2. Mantenga las mariposas en condiciones frías (5-6 ° C) hasta 1 semana antes de la experimentación, pero permita al menos 1 día para aclimatarse cuando se saque de la nevera.

5. Medidas de rendimiento

  1. Para medir los rasgos de las alas en individuos muertos, retire las alas de la mariposa sosteniendo el tórax en una mano y usando fórceps para quitar cada ala en su base. Coloque las alas planas en una caja de luz y tome fotografías para mediciones posteriores.
  2. Para obtener estimaciones de fecundidad, aloje a los adultos en jaulas de apareamiento, permitiendo al menos 1 día para la maduración reproductiva de los machos y 1 día para el apareamiento. Sacrifica hembras en puntos de tiempo establecidos para el conteo de huevos a través de la disección, o recolecta huevos cada día en las plantas huésped.
  3. Para estimar las cargas de huevos, retire el abdomen de la hembra, colóquelo en 1x tampón PBS y corte una hendidura a lo largo del lado ventral.
    1. Use fórceps para separar las entrañas de la cutícula, luego retire los ovarios del intestino, la tráquea y otros contenidos del abdomen.
    2. Desenrolle los cuatro ovarioles rizados dentro de cada uno de los dos ovarios, observando dónde los óvulos maduros, yemas y sin cáscara pasan a los folículos inmaduros. Use un contador para ayudar a contar el total de huevos maduros, generalmente de 0 a 200 huevos.
  4. Para determinar el estado de apareamiento de una hembra disecada, abra la bursa copulatrix y separe los espermatóforos dentro. A medida que se digieren los espermatóforos, generalmente desarrollan una "cola" y se anidan entre sí.

6. Estudio de caso

NOTA: Las hembras adultas de mariposas blancas de col fueron recolectadas de la naturaleza en 2014 para fundar las poblaciones experimentales. Las hembras adultas se originaron cerca de Davis, California (N = 8 hembras fundadoras).

  1. Alojamiento de las mariposas
    1. Aloje a las hembras en jaulas de malla "BugDorm" (61 cm x 61 cm x 61 cm) bajo luz natural en un invernadero. Proporcionar una hoja orgánica de la col de la planta huésped (Brassica oleracea) para la oviposición.
    2. Para mantener la humedad en las jaulas, incluya una pequeña planta en maceta (Cosmos), regada diariamente, colocada encima de una toalla dentro de cada jaula.
    3. Recoja los huevos diariamente transfiriendo hojas con huevos nuevos a vasos de plástico de 473 ml con agujeros en la tapa y colóquelos en una cámara climática.
    4. Proporcione a las mariposas acceso ad libitum a una solución de agua con miel al 10% (hecha diluyendo miel orgánica con agua destilada), accesible a través de una esponja amarilla en una pequeña placa de Petri que se cambia diariamente.
  2. Preparación de dietas artificiales
    1. Preparar dietas artificiales para larvas blancas de repollo utilizando modificaciones de dietas de lepidópteros previamente desarrolladas4. Un lote de dieta contenía 50 g de germen de trigo, 27 g de caseína, 10 g de celulosa, 24 g de sacarosa, 15 g de harina de repollo, 9 g de mezcla de sal Wesson, 12 g de levadura Torula, 3.6 g de colesterol, 10.5 g de mezcla de vitaminas Vanderzant, 1.1 g de metilparabeno, 1.5 g de ácido sórbico, 3 g de ácido ascórbico y 0,175 g de estreptomicina (ver Tabla de materiales).
    2. Pesa previamente los ingredientes secos para múltiples lotes de dieta (Tabla 1) y mezcla bien para aumentar la homogeneidad entre los tipos de dieta antes de subdividirlos en lotes separados para mezclarlos con soluciones metálicas.
    3. Coloque los ingredientes secos en una licuadora con aceite de linaza y la mezcla de metales correspondiente.
      NOTA: El aceite de linaza se utilizó en el presente experimento, ya que fue vendido por un proveedor anterior de dietas de insectos. Ahora, el aceite de linaza orgánico se usa exclusivamente, que está hecho de la misma planta, pero es menos probable que contenga aditivos como proveedores comerciales de aceite de linaza.
    4. Vierta la dieta preparada en vasos de plástico de 118 ml (4 oz). Use sales metálicas solubles para agregar metales focales a las dietas artificiales. Apunte a concentraciones de metales basadas en observaciones previas del contenido de metal de las plantas (por ejemplo, acumulación de níquel 55,56,57 o contaminación de las plantas en la carretera 58,59,60) y tolerancia de metales en otros lepidópteros 49,50,51.
    5. Disuelva las sales metálicas en 500-1,000 ml de agua destilada antes de tomar las cantidades correspondientes para agregar a las dietas artificiales. Por ejemplo, para hacer la dieta de níquel de 100 ppm, agregue 317.6 ml de solución de NiCl2 a 1 M a la dieta artificial antes de mezclar para obtener una concentración final de la dieta de 100 mg / g de peso seco de Ni (aproximadamente 53 mg / g de peso húmedo). Esta cantidad se traduce en una concentración medida promedio de 109.6 ppm (Tabla 2) basada en la espectroscopia de emisión atómica de plasma acoplado inductivamente.
      NOTA: Los niveles de metales fueron estimados por los Laboratorios Analíticos de Investigación de la Universidad de Minnesota con seis muestras.
  3. Mantenimiento
    1. Mantener los huevos cosechados en plantas hospedadoras en cámaras climáticas a 23 °C en fotoperiodos 14:10 durante 7 días. Después de esto, transfiera las larvas tempranas del segundo estadio a la dieta artificial.
    2. En la transferencia, divida uniformemente las larvas de una planta determinada en los cuatro tipos de dieta para evitar confundir lotes de larvas con el tipo de dieta. Transfiera las larvas (N = 346 en total) como dos individuos por taza de dieta de 118 ml para reducir la incidencia de la enfermedad por hacinamiento y permitir un amplio espacio para que los adultos eventualmente se cierren.
    3. Perfore agujeros (tres por tapa) en las tapas de las tazas de crianza. Coloque las tazas en contenedores de plástico del tamaño de una caja de zapatos para la cría, con las diferentes dietas intercaladas para evitar cualquier efecto sistemático de ubicación en la cámara de cría.
    4. Aloje las copas de larvas en cámaras climáticas a 23 °C en fotoperiodos 14:10 (con contenedores de agua en el fondo de la cámara para mantener la humedad alrededor del 50%-60%, monitoreados con un sensor de humedad doméstico). En el caso de que las tazas se enmohezcan (alrededor de ocho tazas en total en este estudio de caso), retire las tazas de la cámara y retire a esos individuos del experimento.
    5. Permitir que las larvas pupan y emerjan en las copas de cría (N = 162 en total).
      NOTA: Para las condiciones de crianza en este estudio, el tiempo de desarrollo desde la recolección de óvulos hasta la emergencia adulta promedió alrededor de 25-30 días (que van desde 20-40 días, por ejemplo,25,28).
    6. A medida que las pupas se acercan a la emergencia adulta, revise las copas diariamente en busca de individuos recién cerrados y retire a los adultos con las alas secas. Etiquete a los adultos en sus alas posteriores con su número individual correspondiente (asignado en la transferencia larval) usando un sharpie negro de punta fina. Determine el sexo de cada individuo y marque en un sobre de vidrio junto con su número y fecha de emergencia. Coloque las mariposas adultas en sobres de vidrio y guárdelas a -20 ° C hasta su posterior procesamiento.
      NOTA: Una pequeña fracción de adultos emergentes muestran deformidades en las alas que interferirían con el vuelo y la supervivencia adulta (5%-8%); Estos individuos son excluidos de los análisis de supervivencia para estos experimentos.
  4. Medición y análisis de datos
    1. Mida la supervivencia como supervivencia desde el segundo estadio (cuando las orugas se colocaron en dieta) hasta la emergencia adulta.
      NOTA: El presente estudio se centró en la supervivencia y el tiempo de desarrollo como medidas de rendimiento en las diferentes dietas.
    2. Mida el tiempo de desarrollo como el número de días entre la transferencia a dietas y la emergencia adulta en la cámara climática.
    3. Para el análisis de datos, ejecute dos conjuntos de modelos que incluyan interacciones entre el metal y la concentración.
      NOTA: Como ambas interacciones fueron significativas (F 2,194 = 4.56, p = 0.01 para el tiempo de desarrollo y X2 = 12.1, p = 0.002 para la supervivencia), el estudio procedió con un análisis separado de cada metal.
    4. Para analizar la supervivencia, realice pruebas de chi-cuadrado para cada metal para probar los efectos de la dosis de metal (tratada como cuatro categorías) en la supervivencia hasta la edad adulta con las alas completamente intactas.
    5. Cuando se detecta un efecto significativo de la dosis, realice un seguimiento de chi-cuadrado para comparar cada nivel con la dieta de control. Para analizar el tiempo de desarrollo (desde el momento de la transferencia hasta la emergencia como adulto), pruebe los efectos del sexo en el tiempo de desarrollo.
      NOTA: Como no hubo efecto del sexo en el tiempo de desarrollo, (p > 0.10) para ningún metal en este experimento, lo eliminamos de la consideración en el modelo.
    6. Ejecute un ANOVA separado para cada metal para probar el efecto de las cuatro concentraciones en el tiempo de desarrollo. Además, ejecute pruebas t para cada concentración relativa al control para determinar la concentración mínima donde se observa un efecto de rendimiento.
      NOTA: En este estudio, JMP v16 se utilizó para todos los análisis. Todos los datos brutos están disponibles en Mendeley61.

Resultados Representativos

Visión general
La dieta artificial se puede utilizar para criar mariposas blancas de repollo en condiciones estándar para probar los efectos de ciertos ingredientes de la dieta en el rendimiento de la mariposa. En el presente trabajo, se utilizaron dietas artificiales para estudiar la toxicidad de diferentes metales encontrados en plantas hospederas que crecen en áreas contaminadas (Figura 1). Las larvas se criaron con dietas que contenían concentraciones crecientes de tres metales diferentes (Figura 2; detalles metodológicos específicos presentados en la sección 6 del protocolo). La supervivencia y el desarrollo de las mariposas se vieron más afectados por el cobre y el zinc y menos afectados por el níquel (Figura 3 y Figura 4), con una sensibilidad comparable a otros estudios con mariposas y polillas criadas con dietas artificiales (Figura 5).

Supervivencia
Las larvas de mariposa se transfirieron a dietas artificiales que contenían cobre, níquel, zinc o control, donde cada tipo de metal varió en concentración en tres niveles (Tabla 3). En la Figura 2 se muestra una imagen representativa de larvas a una dosis creciente de toxina. No hubo un efecto de la concentración de metales sobre la supervivencia del níquel, pero hubo un efecto significativo tanto para el cobre como para el zinc (Tabla 3 y Figura 3). Las comparaciones chi-cuadrado post-hoc demostraron que el zinc mostró una disminución en la supervivencia en relación con la dieta de control solo en el nivel más alto de zinc (1,000 ppm, comparación post-hoc X12 = 8.41, p = 0.004; Figura 1). El cobre también mostró una disminución significativa en la supervivencia solo en los niveles más altos utilizados (500 ppm, X12 = 7.00, p = 0.008), aunque hubo un aumento beneficioso no significativo en la supervivencia en los dos niveles más bajos (50 ppm y 100 ppm; Figura 3).

Tiempo de desarrollo
Hubo un efecto significativo de la concentración de cobre y zinc en el tiempo de desarrollo (Tabla 4 y Figura 4). A medida que aumentaba la concentración de cobre, hubo un aumento en el tiempo de desarrollo, con una desviación significativa del control a partir de 50 ppm (p = 0,027; Figura 3). A medida que aumentaba la concentración de zinc, hubo un aumento en el tiempo de desarrollo, con una desviación significativa del control a partir de 100 ppm (p = 0,03; Figura 4). Hubo una tendencia a aumentar el níquel para resultar en tiempos de desarrollo más largos (p = 0,08; Tabla 4), y las comparaciones de cada dieta con el control mostraron efectos significativos a partir de 100 ppm (p = 0,022; Figura 4).

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Figura 1: Niveles observados de metales focales en el tejido de mariposa y plantas huésped. (Datos de62.) Se muestran niveles de cobre, níquel y zinc para el tejido de mariposa Pieris (criado en bok choy en el laboratorio) y las mostazas silvestres recolectadas (Bertorea sp.). Los automóviles indican los niveles observados en las hojas de las plantas a lo largo de las carreteras de alto tráfico53. Los niveles de metales en las dietas artificiales utilizadas en este estudio se informan en la Tabla 1; Los puntos representan medias y las barras de error representan el error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Imagen de larvas blancas de col transferidas el mismo día a dietas artificiales de concentración creciente de una toxina. Esta imagen muestra larvas de un estudio dosis-respuesta (presentado en 28 utilizando material vegetal seco para la planta tóxica Aristolochia). Foto por ESR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Variación en la supervivencia a través de dietas metálicas de concentraciones crecientes. Los asteriscos indican una desviación significativa en la supervivencia en relación con la dieta de control. Las concentraciones exactas de metales en las dietas se enumeran en la Tabla 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Efectos de la concentración de metales en el tiempo de desarrollo. Los asteriscos indican la concentración de metal más baja para la que hay una diferencia significativa en relación con el control (utilizando una prueba t). Las concentraciones exactas de metales en las dietas se enumeran en la Tabla 2. Los puntos representan medias y las barras de error representan el error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Resumen de tolerancia al metal en otros lepidópteros. Se muestran datos compuestos de supervivencia trazados de 11 estudios existentes 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68. La variable de respuesta es el nivel (en ppm) de concentración de metal donde se observan por primera vez efectos negativos sobre la supervivencia. Las mariposas indican los resultados de este estudio, señalando que los valores de tolerancia para el níquel fueron más altos que los medidos en este estudio. Los puntos representan medias y las barras de error representan el error estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

IngredientePesar comogMl
Germen de trigoIngredientes secos50
CelulosaIngredientes secos10
Harina de colIngredientes secos15
CaseínaIngredientes secos27
SacarosaIngredientes secos24
Mezcla de sal WessonIngredientes secos9
Levadura TorulaIngredientes secos12
ColesterolIngredientes secos3.6
Mezcla de vitaminasIngredientes secos10.5
MetilparabenoIngredientes secos0.75
Ácido sórbicoIngredientes secos1.5
Ácido ascórbicoIngredientes secos3
EstreptomicinaIngredientes secos0.175
Aceite de linazaingredientes húmedos5
Agar-agaragar-agar15

Tabla 1: Receta para dieta artificial. Se muestran los pesos (y volúmenes) de los ingredientes en un lote de la dieta de la mariposa blanca de repollo. Los ingredientes secos (y el aceite de linaza) se preparan por separado de la mezcla de agar (disuelta en 400 ml de agua hirviendo, luego llevada a una temperatura más fría con 400 ml de agua a temperatura ambiente).

Tipo de dietaCobre (ppm)Níquel (ppm)Zinc (ppm)
Cobre-"100 ppm"96.11.7569.9
Níquel-"100 ppm"7.29109.668.9
Zinc-"100 ppm"7.961.06186.2
Zinc-"500 ppm"6.511.16708
Control5.890.5959.3

Tabla 2: Medidas de metales en dietas. Se muestran los niveles medios de cobre, níquel y zinc en un subconjunto de las dietas artificiales utilizadas en el estudio. El nombre de la dieta ("tipo" en el análisis) se muestra a la izquierda, con valores entre comillas que son el nivel calculado. La concentración objetivo se muestra entre comillas. Se analizó un subconjunto de dietas utilizadas en el estudio para garantizar que los valores calculados estuvieran en el objetivo con los valores realizados; Cabe señalar que a menudo hay un pequeño grado de variación en la composición de los componentes de la dieta, y cada línea reportada representa solo una réplica.

MetalPearson X32P
Cobre (N = 118)17.820.0005
Níquel (N = 152)3.450.33
Zinc (N = 152)12.520.006

Tabla 3: Efectos de la concentración de metales en la supervivencia. Se muestran los resultados de una prueba de chi-cuadrado para cada metal, contrastando tres concentraciones de metal en relación con una dieta de control.

MetalFP
Cobre (N = 61)F3,57 = 9,84<0,0001
Níquel (N = 75)F3,71 = 2,350.079
Zinc (N = 64)F3,60= 3,790.015

Tabla 4: Efectos de la concentración de metales en el tiempo de desarrollo. Se muestran los resultados de ANOVA individuales para cada metal.

Disponibilidad de datos:

Todos los datos están disponibles en Mendeley61.

Discusión

En esta investigación, las mariposas blancas de col (Pieris rapae) se criaron con una dieta artificial para examinar las diferencias en la toxicidad de los metales pesados. Al hacerlo, este estudio proporciona métodos generales para la cría y estudios de laboratorio de este sistema de mariposas fácil de manipular. Esta discusión primero considera preguntas más generales sobre los métodos revisados aquí, luego revisa nuestros hallazgos científicos antes de concluir con reflexiones sobre los componentes de la dieta artificial.

El protocolo revisado aquí da pasos de un método general de cría para las mariposas blancas de repollo, pero hay muchos puntos dentro de este protocolo que se pueden modificar. Por ejemplo, mientras que el estudio de caso presentado aquí utiliza esponjas para la alimentación, otros investigadores han tenido suerte con mechas dentales y flores de seda llenas de agua de miel5. Mientras que el presente estudio utiliza agua con miel como alimento, otros investigadores han utilizado soluciones de azúcar e incluso Gatorade. Si las pupas necesitan ser pesadas o trasladadas a otras condiciones de emergencia (p. ej., inducir la diapausa y necesitar almacenamiento en frío durante 1 mes), el investigador puede retirarlas fácilmente de las copas rociándolas con agua para humedecer sus accesorios de seda y agarrarlas con pinzas de plumas, luego volver a colgarlas con cinta adhesiva de doble cara. Si los investigadores necesitan más flexibilidad en términos de cuándo las mariposas adultas se trasladan a jaulas para el comportamiento adulto, pueden mantenerse en el refrigerador durante varias semanas, pero necesitan ser alimentadas. Cada varios días, las mariposas deben ser sacadas para ser alimentadas con una solución diluida de agua de miel. Bajo iluminación interior, esto se puede hacer usando un alfiler para desenrollar su probóscide en la comida. En el extremo del rendimiento adulto, se puede tomar una amplia gama de medidas de acondicionamiento físico en las mariposas blancas de repollo. El tamaño del cuerpo se puede medir como la masa húmeda o seca de larvas en ciertas etapas, pupas o adultos (sacrificadas o mantenidas en sobres de vidrio), o mediante la medición de la longitud del ala en el programa ImageJ (ver 12,24,25,28). La fecundidad de por vida de las hembras se puede medir a través de la recolección diaria de huevos en plantas huésped 25,69,70, y el tamaño de rasgos específicos se puede medir como una métrica de rendimiento; Por ejemplo, la masa o el volumen del cerebro o regiones cerebrales individuales 62,71,72, o el contenido de masa o proteína del tórax o músculo de vuelo 62,70. Finalmente, los adultos pueden ser utilizados en estudios de comportamiento para probar cualquier número de preguntas que examinen el efecto de la manipulación de la dieta en la elección de forrajeo u oviposición27,73.

Si el protocolo de crianza no funciona como se esperaba, hay algunos aspectos que solucionar. Primero, uno puede preguntarse si los niveles de luz son lo suficientemente altos como para provocar un comportamiento adulto normal. Mientras que las líneas adaptadas al laboratorio de Pieris pondrán huevos bajo luz fluorescente, la única luz artificial que funciona para líneas de tipo salvaje son las potentes luces de invernadero de amplio espectro. La luz natural en invernaderos, alféizares de ventanas o al aire libre funciona mejor para provocar el comportamiento de apareamiento y puesta de huevos. En segundo lugar, si los huevos no están eclosionando o si las larvas están muriendo temprano en el desarrollo, hay algunas cosas a considerar. El material de la planta huésped debe ser orgánico, teniendo en cuenta que las plantas "orgánicas" de las tiendas a veces se tratan con productos químicos que pueden matar larvas, por lo que criar las propias plantas huésped a menudo es lo mejor. Si la tasa de aceptación del huésped es menor, se pueden intentar hojas más jóvenes con mayor contenido de nitrógeno, presentando plantas en macetas en lugar de hojas individuales y asegurando que las hembras se apareen. Las hembras aceptarán la siembra de Brassica, incluso pequeños brotes que tienen 2 semanas de edad. El método de parafina funciona bien para transferir huevos a diferentes condiciones, pero debe tenerse en cuenta que la tasa de aceptación tiende a ser menor que la de las plantas enteras. En tercer lugar, todos los componentes de la dieta deben ser de alta calidad y no caducados. El aceite de linaza debe reemplazarse anualmente y almacenarse en la nevera24,25. El germen de trigo, la mezcla de vitaminas y los antibióticos también deben mantenerse frescos. Cuarto, uno puede considerar ajustar la configuración de la taza de dieta. Se puede usar cualquier número de tipos de vasos de plástico desechables para criar, de 1 oz a 15 oz. Hemos encontrado que 4 onzas es un buen tamaño para permitir la emergencia de adultos y se empaqueta muy bien en nuestras cámaras climáticas. Los agujeros perforados en las tapas permiten el flujo de aire, pero demasiados agujeros pueden secar la dieta en condiciones de baja humedad, por lo que es posible que sea necesario ajustar este número. En quinto lugar, las condiciones en la cámara climática pueden necesitar ser ajustadas en combinación con las condiciones de la copa. Si las condiciones son demasiado secas, las plantas huésped con huevos pueden secarse antes de que las larvas puedan ser transferidas, y las tazas con dieta pueden secarse antes de que emerjan las mariposas. Por otro lado, si las condiciones son demasiado húmedas, las copas pueden albergar moho y enfermedades. Los investigadores pueden necesitar ajustar el flujo de aire en las tazas mediante el uso de tapas de malla, o más o menos agujeros en las tapas. Otro problema común son las luces de la cámara que son lo suficientemente brillantes como para causar cambios de temperatura en las tazas y una acumulación de condensación; El uso de luces de atenuación es una opción fácil para la cría de larvas.

Con respecto a las preguntas de investigación en este documento, este estudio encontró que los blancos de repollo eran relativamente más sensibles al cobre que al níquel o al zinc. El cobre tuvo impactos negativos significativos en el tiempo de desarrollo a concentraciones tan bajas como 50 ppm (Figura 3 y Tabla 3) y en la supervivencia a 500 ppm (Figura 4, Tabla 4). Por el contrario, no hubo efectos negativos del níquel sobre la supervivencia (hasta 500 ppm; Figura 3) o efectos negativos sobre el tiempo de desarrollo a 100 ppm (Figura 4). Los blancos de col fueron bastante tolerantes al zinc, con efectos de supervivencia observados solo a 1,000 ppm (Figura 3) y efectos negativos en el tiempo de desarrollo a partir de 100 ppm (Figura 4). Basado en las concentraciones relativamente mayores de zinc en el tejido de mariposa y mostazas (su planta huésped; Figura 1), se esperaba que se observara una tolerancia relativamente mayor al zinc. Sin embargo, la sensibilidad al cobre y la tolerancia del níquel fueron algo inesperadas dados los niveles muy bajos de níquel en el tejido de mariposa (Figura 1) y la necesidad de cobre como micronutriente. Estos hallazgos inesperados se discuten a continuación después de considerar la tolerancia de estos metales en otras mariposas y polillas.

Para comparar los datos actuales con la sensibilidad a los metales medida en otros lepidópteros, se recopilaron datos de estudios existentes sobre la concentración mínima, donde los metales pesados impactaron negativamente la supervivencia 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68; estos estudios se centraron en las polillas, especialmente en las especies de plagas (Galleria mellonella, Lymantria dispar, Plutella xylostella, Spodoptera sp.). Todos los valores de sensibilidad medidos en este estudio se acercan al rango medido para estas otras especies (Figura 5). Sin embargo, la medida de tolerancia al níquel en este estudio parece ser más alta de lo esperado: aunque no hubo un efecto significativo de supervivencia a 500 ppm, el estudio anterior sobre Pieris rapae también encontró una tolerancia muy alta para el níquel (efectos significativos a partir de 1,000 ppm56), a pesar de los bajos niveles en su tejido de forma natural (Figura 1). La medida de la sensibilidad al cobre en este estudio también parece estar en el extremo inferior para los estudios de lepidópteros. Si bien el uso de una dieta artificial permite una comparación conveniente y controlada de la sensibilidad relativa al metal, es importante tener en cuenta que los componentes de la dieta podrían alterar la medición de la sensibilidad absoluta al metal. Por ejemplo, la vitamina C en la dieta podría compensar el estrés oxidativo inducido por metales74, o los antibióticos en la dieta podrían alterar cualquier efecto de los microbios en el procesamiento de metales75. Una línea interesante de investigación futura sería manipular sistemáticamente tales componentes de la dieta para probar los efectos sobre la toxicidad de los metales, especialmente dadas las preguntas sobre el papel funcional de los microbios intestinales de lepidópteros 76,77 y los componentes del néctar que pueden tener propiedades antioxidantes78. Además, la variación en los requisitos dietéticos entre especies puede hacer que las comparaciones interespecíficas sean desafiantes, y los métodos artificiales basados en la dieta deben complementarse con manipulaciones de las plantas huésped.

Estas mariposas son particularmente tolerantes al níquel y sensibles al cobre. Investigaciones anteriores han observado que muchas plantas de la familia de la mostaza, que incluye plantas favorecidas por Pieridae, hiperacumulan níquel como mecanismo defensivo contra los herbívoros 55,56,63,79,80,81. Esta hiperacumulación es de más de 1.000 ppm en el tejido vegetal, que es órdenes de magnitud mayor que lo que se ve en la mayoría de las plantas (Figura 1). Es posible que Pieris tenga una tolerancia particularmente alta al níquel debido a la selección pasada por tales acumuladores de níquel, como se especuló anteriormente26. Si bien el cobre se ha estudiado con menos frecuencia como micronutriente en las dietas de insectos, existe cierta evidencia de que desempeña un pequeño papel en la reproducción y la inmunidad, aunque principalmente en insectos que se alimentan de sangre (por ejemplo, 82,83). Es posible que el cobre desempeñe un papel fisiológico menos importante en las mariposas que en otros animales 84,85,86, consistente con trabajos recientes que destacan cómo el cobre puede ser un contaminante tan preocupante para los insectos como el plomo, el cadmio y el mercurio (por ejemplo, 87,88,89). Si bien se ha demostrado que el pieris evita la contaminación por cobre en niveles bajos90, la movilidad del cobre en las plantas (por ejemplo, moviéndose hacia las hojas y las flores) también lo ha marcado como un contaminante metálico preocupante91.

Si bien estos resultados proporcionan datos interesantes sobre la toxicidad relativa de estos metales para las mariposas blancas de la col, este documento también pretende ser de uso general como una ilustración visual detallada de los métodos para criar este poderoso sistema. Las coles blancas son fáciles de criar y manipular en experimentos de laboratorio controlados 4,5 facilitando estudios de búsqueda de hospedadores 6,7,8, forrajeo9,10,11 y selección sexual12,13,14. La capacidad de criar estas mariposas con una dieta artificial es clave para crear condiciones comunes de jardín para comparaciones y para manipular nutrientes, toxinas e incluso nuevas plantas huésped. Sin embargo, es importante tener en cuenta que esta dieta artificial no es necesariamente la dieta artificial óptima para esta especie, y probablemente podría mejorarse con futuras manipulaciones. Por ejemplo, la mezcla de sal en esta dieta (y otras dietas de lepidópteros) se desarrolló originalmente para vertebrados y tiene niveles de calcio más altos que lo que la mayoría de los insectos necesitan92,93. Por lo tanto, algunos de nuestros esfuerzos de cría han hecho mezclas de sal personalizadas con niveles más bajos de calcio (por ejemplo, 62), y otros hacen uso de la "mezcla de sal de Beck", que puede ser más apropiada para muchas especies de insectos94. En nuestras propias manipulaciones, también encontramos que las mariposas se desempeñaron mejor con relativamente menos germen de trigo y relativamente más celulosa en comparación con las concentraciones originales4. Un área que necesita más atención es la fuente de lípidos y la concentración en la dieta. Por ejemplo, trabajos anteriores han demostrado que el cambio del aceite de linaza (utilizado en este estudio) a los fosfolípidos aumentó las tasas de apareamiento y las tasas de crecimiento de Pieris en dietas artificiales 95. La suplementación de ácidos grasos específicos en dietas artificiales puede tener efectos positivos adicionales96,97. La optimización de la dieta artificial de Pieris98,99 crea oportunidades para abordar preguntas interesantes sobre ecología nutricional 100,101,102, ecología evolutiva y ecotoxicología. Estos enfoques de dieta artificial permiten a los investigadores abordar preguntas sobre el papel de lípidos específicos en la evolución cognitiva 103, la preadaptación a toxinas28, los componentes dietéticos que reducen la toxicidad de los contaminantes 104 o las interacciones estequiométricas entre nutrientes105.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Estamos agradecidos por el apoyo de los asistentes de pregrado durante la crianza de este trabajo, en particular Regina Kurandina y Rhea Smykalski. Carolyn Kalinowski ayudó a compilar literatura sobre la toxicidad de metales en otros lepidópteros. Este trabajo fue posible gracias a una beca de investigación de verano del Departamento de Ecología, Evolución y Comportamiento de la Universidad de Minnesota.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1-L Pyrex beakerFisher Scientific07-250-059
500 mL graduated cylinderFisher Scientific03-007-43
60-mm plastic petri dish lidFisher Scientific08-757-100B
Ascorbic AcidFrontier6015
BlenderAmazon - Ninja StoreBL610 Professional
Cabbage FlourFrontier1086
CaseinFrontier1100
CelluoseFrontier3425
CholsterolSigmaC3045
Cups for rearing (4 oz)Wasserstrom6094583purchase with matching lids
Fine Mesh AgarSigma
Flaxseed OilamazonB004R63VI6
Floral water tubes, 2.8 x 0.8inchAmazon - Yimaa DirectB08BZ969DK
Glassine envelopes (1 3/4 x 2 7/8 INCHES)Amazon - Wizard Coin SupplyB0045FG90G
Mesh Cages (15.7 x 15.7 x 23.6")AmazonB07SK6P94S
Methyl ParabenFrontier7685
Ohaus Portable ScaleFisher Scientific02-112-228
Organic HoneyAmazonB07DHQQFGM
Photo studio portable lightboxAmazonB07T6TNYJ1
Plastic bin, shoebox sizeAmazonB09L3B3V1R
Plastic disposable transfer pipetsFisher Scientific13-680-50
Sorbic AcidSigmaS1626
SpatulasFisher Scientific14-357Q
StreptomycinSigmaS9137
SucroseTarget
Torula YeastFrontier1720
Vanderzant vitamin mixFrontierF8045
Weigh boatsFisher Scientific01-549-750
Wesson Salt MixFrontierF8680
Wheat GermFrontierG1659
Wooden handled butterfly net, 12" hoopAmazon - Educational ScienceB00O5JDLVC
Yellow spongesAmazon-CeloxB0B8HTHY5B

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