この記事について

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要約

この論文は、キャベツの白い蝶を人工飼料を使用して制御された実験室条件で飼育するための詳細なプロトコルを提示し、これにより、初期の栄養と毒素曝露の正確な操作が可能になります。代表的な結果は、このプロトコルで重金属毒性をどのようにアッセイできるかを示しています。

要約

キャベツホワイトバタフライ(Pieris rapae)は、応用害虫防除研究および行動および栄養生態学の基礎研究にとって重要なシステムです。キャベツホワイトは、人工飼料で制御された条件で簡単に飼育できるため、蝶の世界のモデル生物になります。この論文では、重金属曝露の操作を使用して、この種を飼育するための基本的な方法を示します。一般的なプロトコルは、蝶が野外で捕獲され、温室ケージに産卵するように誘導され、幼虫として人工飼料に移される方法を示しています。これらの方法は、さまざまな研究課題について、蝶に印を付け、測定し、研究する方法を示しています。代表的な結果は、成分が異なる人工食を使用して、対照食と比較して蝶のパフォーマンスを評価する方法のアイデアを提供します。より具体的には、蝶はニッケルに対して最も耐性があり、銅に対して最も耐性が低く、中央のどこかに亜鉛の耐性がありました。これらの結果の考えられる説明は、いくつかのマスタード宿主植物におけるニッケルの過剰蓄積や、銅が以前に認識されていたよりも有毒である可能性があるという昆虫における最近の証拠を含む議論されています。最後に、議論は最初にプロトコルのバリエーションとこれらの方法のトラブルシューティングの方向性を確認してから、将来の研究がこの研究で使用される人工食をさらに最適化する方法を検討します。全体として、このプロトコルは、人工飼料でのキャベツ白の飼育と測定の詳細なビデオ概要を提供することにより、幅広い研究でこのシステムを使用するためのリソースを提供します。

概要

小さなキャベツホワイトバタフライ(Pieris rapae、以下「キャベツホワイト」)は、キャベツ、ブロッコリー、キャノーラなどのマスタード作物の国際的な害虫種です1,2,3。同時に、キャベツホワイトは生物学の研究のための強力なシステムであり、制御された実験室実験で簡単に飼育および操作できるため、一般的に使用される蝶モデルです4,5。キャベツの白い蝶に関する研究は、宿主の探索6,7,8、蜜資源の使用9,10,11、配偶者の選択と性淘汰12,13,14、翅のパターンの発達と進化15,16,17、および新規で変化する応答に関して重要な洞察を提供しました環境18,19。これらの洞察の多くは、キャベツの白を人工飼料4,20,21で飼育できるという事実に依存しており、栄養状態の悪さ22,23、生態学的に関連する汚染物質レベル24,25,26,27、または新しい宿主植物への移行を反映するように正確に操作できます28,29.本研究では、重金属への曝露に関する実験を使用して、実験室での人工飼料でキャベツシロチョウを飼育するための基本的な方法と、幼虫と成虫の主要なパフォーマンス測定を示します。これらの方法の多くの側面は、人工食餌で飼育することができる他の蝶30、31および蛾32、33、34に適用される。

この論文では、キャベツの白い蝶を飼育する一般的な方法を説明するために、金属耐性に関する実験が使用されます。重金属は、人間の製品、工業プロセスの劣化、および農薬、塗料、およびその他の製品での歴史的使用によるレガシー汚染に起因する一般的な人為的汚染物質です35,36,37,38。鉛、銅、亜鉛、ニッケルなどの多くの重金属は、土壌や水から植物組織に移動する可能性があり39,40,41,42、ほこり中の金属は植物の葉に堆積する可能性があり43,44,45、その結果、植物食性昆虫の幼虫への複数の曝露経路が生じます。人生の早い段階での重金属曝露は、動物の発達、特に神経組織に悪影響を与える可能性があり、高レベルは致命的となる可能性があります35,36,46,47,48。多くの研究は、害虫と益虫の両方を含む発育昆虫に対する金属曝露の悪影響を示しています49,50,51。重金属汚染物質の数が多く、それらが人間の環境で頻繁に共存するという事実52は、研究者が発達中の昆虫をさまざまなレベルと多様な金属の組み合わせにさらして、環境への影響を理解し、軽減できる正確な実験室方法が必要であることを意味します。

本研究では、キャベツホワイトの生存と発達に対する一般的な金属の影響を、人間環境における3つの一般的な汚染物質である銅(Cu)、亜鉛(Zn)、およびニッケル(Ni)に焦点を当てて対比します。たとえば、ミネソタ州の田舎の道路脇からのフォーブには、最大71ppmのZn、28ppmのCu、および5ppmのNi53が含まれています。この実験では、キャベツの白い蝶の人工飼料中のこれらの金属のレベルを、環境で見られるレベルに対応し、それを超えるレベルで操作します。人工食は、これらの金属の相対毒性を対比するために使用され、キャベツの白は、酵素や組織(銅と亜鉛; 図1)。全体を通して、このテキストは、この重要な蝶モデルシステムの飼育と研究方法を説明するための方法論の詳細とそれに付随するビデオ視覚化を提供します。

プロトコル

この研究は、USDA APHIS許可P526P-13-02979の下で実施されました。

1.実験蝶のコレクション

  1. 空中防虫ネットで大人の女性の蝶を捕まえます。キャベツホワイトは一般に、蜜植物と宿主植物(アブラナ科)が存在する、開放的で乱れた生息地で見られます。
    1. 太陽が出ていて気温が高いときに検索します。女性をターゲットにするには、ゆっくりと地面の近くで羽ばたき、植物に着地して前足骨で葉を「太鼓」(味わう)する個体を探します。
  2. 卵を収穫するためにケージに女性を設置します。
    注:野外で採集された雌は、平均して1〜2匹の雄12と交尾しており、捕獲後すぐに受精卵の産卵を開始する必要があります。野生の雌は産卵と交尾に自然光を必要とするので、ケージを温室または窓辺に置きます。
  3. 卵を収穫するために宿主植物を持つ雌を飼う。
    注:雌は、緑キャベツ、大根、ケール、コラード、 シロイヌナズナなどのさまざまな宿主植物を受け入れますが、植物が農薬で処理されていないことを確認してください。
    1. 花の水管に入ったケールの茎など、葉の圧力を維持するために、鉢または水を入れた容器に宿主植物を提示します。
    2. 研究者が卵を集めて直接食事に移したい場合は、最初に輪ゴムを使用して宿主植物の葉をプラスチックのコップの水の上に取り付け、次に端の周りにパラフィルムを引き伸ばします-葉に触れる女性はパラフィルムに産卵します(5を参照)。
  4. ケージには、鉢植えの植物に毎日水をやったり、特に乾燥した状態でタオルを濡らしたりするなど、相対湿度を高く保つためのものも含まれていることを確認してください。鉢植えの植物にケージで水をやる場合は、蝶が溜まった水に引っかかる可能性があるため、タオルが鉢の下にあることを確認してください。
  5. 特に経験豊富な個人と一緒に収容されている場合、蝶はすぐに使用することを学ぶ黄色のスポンジの上に提示された10%希釈蜂蜜水溶液で蝶を養う。
    1. 蝶がスポンジから餌をやるのを奨励するには、特に水筒を軽くスプレーした後、蝶をフィーダーに直接置きます。
    2. フィーダーをセットアップするには、まず黄色またはオレンジ色のスポンジを完全にすすぎ、次に60 mmのプラスチック製ペトリ皿に収まる小さな正方形に切ります。フィーダーを毎日交換し、マイルドな漂白剤溶液でスポンジを洗浄し、カビの成長を防ぐために徹底的にすすぎます。

2.人工食を作る

  1. まず、 表 1 のレシピまたはその他の関連ソースを使用して、実験に関連するレシピを決定します。焦点種または実験に固有の必要な変更を加えます。材料を計量する際に従うレシピを印刷します。
  2. 寒天を除くすべての乾燥成分を1つの容器に入れます。いくつかの成分が4°Cで保管されていることに注意して、成分がそれぞれの保管場所に戻されていることを確認し、事前に計量した乾燥成分混合物を5mLの亜麻仁油を入れたブレンダーに入れます。
  3. ダイエットバッチごとに、以下に詳述する手順に従います。
    1. 15 gの細かいメッシュの寒天と400 mLの蒸留水を、少なくとも1 Lの大きさのビーカーで混合します。寒天が沸騰に近づくまで電子レンジで加熱し、混合物全体に細かい泡を付け、沸騰を防ぐために30〜60秒ごとに混合物を攪拌します。
    2. この熱い寒天混合物に、ビタミン混合物は熱に敏感であるため、400mLの蛇口温度の蒸留水を加えて、乾燥成分と混合するのに適切な温度にします。
    3. 寒天混合物をブレンダーに加えて完全に混合し、必要に応じてブレンダーの端をこすります。
  4. 寒天が加熱されているので、端が触れている状態でカウンターに少なくとも74オンスのダイエットカップを置きます。食事を完全に混合した後、ブレンダーからダイエットカップに混合物を注ぎ、食事が各カップの底を覆うようにします。
  5. ダイエットが冷めたら、カップに蓋をしてダイエットカップにダイエットタイプのラベルを付けてトレーに積み重ね、使用するまで4°Cで最大1ヶ月間保存します。

3.人工食の移用と飼育

  1. ハウスホスト植物は、24°Cの気候チャンバーでメッシュカバー付きの30オンスのデリカップに蝶の卵を残します。1週間後、カップをチェックします-幼虫が孵化し、1齢後半または2齢期初期に、人工食への移行に適した時期であることを確認します。
  2. 幼虫を絵筆で人工食に移し、漂白剤スプレーで消毒し、幼虫の容器の間に水すすぎます。3匹の幼虫を各4オンスカップに移します。人工食はエネルギー密度が高く、高密度の幼虫を支えることができますが、幼虫密度の高いカップでは病気やカビが広がる可能性があるため、幼虫をカップに詰めることは避けてください。
  3. カップを側面のプラスチックビンに入れて、フラスがカップの底に落ちて食事から離れるようにし、カビや病気のリスクを減らします。
    1. ダイエットカップは、低から中程度の光レベルの制御された温度条件で収容します。透明なカップの蓋を覗いて、1〜2日ごとにカップのカビや病気を監視します。
    2. カビや病気のカップは、他のカップへの拡散を防ぐために隔離または冷凍することができます。

4.成虫の出現と取り扱い

  1. 幼虫が蛹化してダイエットカップに出てくるのを待ちます。成虫が出てきたら、羽が固まるまで数時間待ってから、マーキングのために羽を取り除きます。羽をそっとつかんで、きれいな手でカップから成虫の蝶を取り除き、4つの羽すべてを体に近づける方が安定したホールドであることに注意してください。
  2. 蝶に印を付けるには、乾いた個体を頭と胸部で持ち、先端の細かいシャーピーを使用して後翅に数字を軽くマークします。
    1. 翼のマーキングと性器の組み合わせを使用する性別の個人。メスは一般に背側前翅に2つの黒い斑点があり、後翅はより暗く黄色がかっていますが、オスは通常、背側前翅に明るい白い背景に1つの小さな黒い斑点があります54。
    2. この色は個人差や季節差があることから、腹部の特徴で性別を確認する - 男性は腹部の遠位端に2つの留め金を持ち、一般的に腹部は狭く、女性は生殖器の開口部が1つある。
  3. 片手で封筒を開き、蝶を頭と胸部で持ち、封筒に滑り込ませ、もう一方の手で封筒を通して羽をつかむことにより、大人をワックスグラシン封筒に移します。
    1. 封筒内で4つの翼がすべて正常に閉じていることを確認してください。
    2. 実験前に蝶を低温状態(5〜6°C)で最大1週間維持しますが、冷蔵庫から取り出したときに少なくとも1日は順応させます。

5. パフォーマンス対策

  1. 死んだ個体の翅の特徴を測定するには、片手で胸部を持ち、鉗子を使用してその基部の各翅を取り除くことにより、蝶の羽を取り除きます。翼をライトボックスに平らに置き、後で測定するために写真を撮ります。
  2. 繁殖力の推定値を取得するには、成虫を交配ケージに収容し、オスの生殖成熟に少なくとも1日、交尾に1日を許可します。解剖による卵数の設定された時点で雌を犠牲にするか、宿主植物で毎日卵を収集します。
  3. 卵の負荷を推定するには、女性の腹部を取り除き、1x PBSバッファーに入れ、腹側に沿ってスリットを切ります。
    1. 鉗子を使用して内臓をキューティクルから分離し、卵巣を腸、気管、および腹部の他の内容物から引き離します。
    2. 2つの卵巣のそれぞれにある4つのカールした卵巣をほどき、成熟した卵、卵黄、殻のある卵が未熟な卵胞に移行する場所に注目します。カウンターを使用して、一般的に0〜200個の卵の範囲の成熟卵の合計を集計するのに役立ちます。
  4. 解剖された女性の交配状態を判断するには、滑液包の丘疹を開き、その中の精母細胞を分離します。精母細胞が消化されると、それらは一般的に「尾」を発達させ、互いに入れ子になります。

6. ケーススタディ

注:成虫の雌のキャベツシロチョウは、実験集団を見つけるために2014年に野生から収集されました。成体の雌はカリフォルニア州デイビス近郊から生まれた(N = 8人の創設雌)。

  1. 蝶の飼育
    1. 温室内の自然光の下で「BugDorm」メッシュケージ(61 cm x 61 cm x 61 cm)に女性を収容します。宿主植物キャベツ(アブラナ属)の有機葉を産卵用に提供する。
    2. ケージ内の湿度を維持するために、毎日水をやり、各ケージ内のタオルの上に置く小さな鉢植えの植物(コスモス)を含めます。
    3. 新しい卵の入った葉を蓋に穴の開いた473 mLのプラスチックカップに移して毎日卵を集め、気候室に入れます。
    4. 毎日交換される小さなペトリ皿の黄色いスポンジを通してアクセスできる10%蜂蜜水溶液(有機蜂蜜を蒸留水で希釈することによって作られた)への 自由な アクセスを蝶に提供します。
  2. 人工食の準備
    1. 以前に開発された鱗翅目の食事の修正を使用して、キャベツの白い幼虫のための人工飼料を準備します4.1バッチの食事には、小麦胚芽50 g、カゼイン27 g、セルロース10 g、スクロース24 g、キャベツ粉15 g、ウェッソン塩ミックス9 g、トルラ酵母12 g、コレステロール3.6 g、ヴァンデルザントビタミンミックス10.5 g、メチルパラベン1.1 g、ソルビン酸1.5 gが含まれていました。 3 gのアスコルビン酸、および0.175 gのストレプトマイシン( 材料表を参照)。
    2. 複数のダイエットバッチ(表1)の乾燥成分を事前に計量し、完全に混合してダイエットタイプ間の均一性を高めてから、金属溶液と混合するために別々のバッチに細分化します。
    3. 乾燥成分を亜麻仁油と対応する金属混合物を入れたブレンダーに入れます。
      注:亜麻仁油は、過去の昆虫飼料提供者によって販売されていたため、本実験で使用されました。現在、同じ植物から作られた有機亜麻仁油が独占的に使用されていますが、亜麻仁油の商業提供者として添加物が含まれている可能性は低いです。
    4. 準備した食事を118 mL(4オンス)のプラスチック製デリカップに注ぎます。可溶性金属塩を使用して、焦点金属を人工食に加えます。植物の金属含有量(例えば、ニッケル蓄積55,56,57または植物の道端汚染58,59,60)の以前の観察と他の鱗翅目49,50,51の金属の耐性に基づいて金属濃度を目指します。
    5. 人工食に加えるために対応する量を服用する前に、金属塩を500〜1,000mLの蒸留水に溶かします。例えば、100 ppmのニッケル食を作るには、ブレンドする前に人工食に317.6 mLの1 M NiCl2 溶液を加えて、最終食濃度を100 mg/gのNi乾燥重量(約53 mg/g湿重量)にします。この量は、誘導結合プラズマ原子発光分光法に基づく平均測定濃度109.6ppm(表2)に相当します。
      注:金属のレベルは、ミネソタ大学の研究分析研究所によって6つのサンプルで推定されました。
  3. メンテナンス
    1. 宿主植物で収穫された卵を気候チャンバーで23°C、14:10日長で7日間維持します。この後、初期の2齢幼虫を人工食に移します。
    2. 移植時に、幼虫のバッチを飼料タイプと交絡させないように、特定の植物からの幼虫を4つの食事タイプに均等に分割します。幼虫(N = 合計346)を118 mLダイエットカップあたり2個体として移して、過密による病気の発生を減らし、成虫が最終的に閉じるための十分なスペースを確保します。
    3. 飼育カップの蓋にパンチ穴(蓋ごとに3つ)。カップを靴箱サイズのプラスチック製のゴミ箱に入れて飼育し、飼育室内の場所の体系的な影響を避けるために、さまざまな食事を散在させます。
    4. 幼虫のカップを14:10日長の23°Cの気候チャンバーに収容します(チャンバーの底に水の入ったビンがあり、湿度を約50%〜60%に保ち、家庭用湿度センサーで監視します)。カップがカビが生えた場合(このケーススタディでは合計約8カップ)、チャンバーからカップを取り外し、それらの個人を実験から外します。
    5. 幼虫が蛹化して飼育カップに出現するのを待ちます(N = 合計162)。
      注:この研究の飼育条件では、採卵から成虫の出現までの発育時間は平均して約25〜30日(20〜40日の範囲、例えば25,28)でした。
    6. 蛹が成虫の出現に近づいたら、新しく閉じた個体がないか毎日カップをチェックし、乾燥した翼で成虫を取り除きます。後翅の成虫に、先端の細かい黒いシャーピーを使用して、対応する個体番号(幼虫の移動時に割り当てられる)でラベルを付けます。各個人の性別を決定し、その数と出現日とともにグラシン封筒に印を付けます。成虫の蝶をグラシンエンベロープに入れ、さらに処理されるまで-20°Cで保管します。
      注:新興成人のごく一部は、飛行と成人の生存を妨げる翼の変形を示しています(5%-8%)。これらの個人は、これらの実験の生存分析から除外されます。
  4. 測定とデータ分析
    1. 生存率を、2齢(毛虫が餌にされたとき)から成虫の出現までの生存率として測定します。
      注:本研究は、さまざまな食事のパフォーマンスの尺度として生存期間と発達時間に焦点を当てました。
    2. 発育時間を、食事への移行から気候室での成虫の出現までの日数として測定します。
    3. データ分析のために、金属と濃度の間の相互作用を含む2つのモデルセットを実行します。
      注:両方の相互作用が有意であったため(F2,194 = 4.56、 開発 時間についてはp = 0.01、生存時間はX2 = 12.1、 p = 0.002)、研究は各金属の個別の分析を進めました。
    4. 生存率を分析するには、各金属のカイ二乗検定を実行して、翼が完全に無傷の成人期までの生存率に対する金属線量(4つのカテゴリーとして扱われる)の影響を検定します。
    5. 用量の有意な効果が検出されたら、フォローアップカイ二乗を実行して、各レベルを対照食と比較します。.発達時間(転移時から成虫としての出現時まで)を分析するために、発達時間に対する性別の影響をテストします。
      注:この実験では、どの金属についても、開発時間に対する性別の影響はなかったため(p > 0.10)、モデルでの考慮から除外しました。
    6. 金属ごとに個別のANOVAを実行して、開発時間に対する4つの濃度の影響をテストします。さらに、対照に対する各濃度のt検定を実行して、性能効果が見られる最小濃度を決定します。
      注:この研究では、すべての分析にJMP v16を使用しました。すべての生データはMendeley61で入手できます。

代表的な結果

概要
人工食を使用して、標準的な条件でキャベツの白い蝶を育て、特定の食事成分が蝶のパフォーマンスに及ぼす影響をテストできます。本研究では、人工飼料を用いて、汚染地域で生育する宿主植物に含まれるさまざまな金属の毒性を研究しました(図1)。幼虫は、3つの異なる金属の濃度が増加した飼料で飼育されました(図2;プロトコルのセクション6に示されている特定の方法論の詳細)。蝶の生存と発達は、銅と亜鉛の影響をより受け、ニッケルの影響を最も受けず(図3および図4)、人工飼料で飼育された蝶や蛾を用いた他の研究に匹敵する感度を示しました(図5)。

生存
蝶の幼虫は、銅、ニッケル、亜鉛、または対照を含む人工飼料に移され、各金属タイプは3つのレベルで濃度が変化しました(表3)。毒素の投与量が増加した幼虫の代表的な画像を図2に示します。ニッケルの生存率に対する金属濃度の影響はなかったが、銅と亜鉛の両方に有意な効果があった(表3および図3)。ポストホックカイ二乗比較では、亜鉛は最高レベルの亜鉛のみで対照食と比較して生存率の低下を示したことが示されました(1,000 ppm、事後比較X12 = 8.41、p = 0.004;図1)。銅はまた、使用された最高レベル(500 ppm、X1 2 = 7.00、p = 0.008)でのみ生存率の有意な低下を示しましたが、2つの最低レベル(50 ppmおよび100 ppm;図3)。

開発時間
現像時間に対する銅および亜鉛濃度の有意な影響があった(表 4および 図4)。銅濃度が増加するにつれて、開発時間が増加し、50ppm(p = 0.027; 図3)。亜鉛濃度が増加するにつれて、現像時間が増加し、100ppmから始まる対照から有意な偏差がありました(p = 0.03; 図4)。ニッケルの増加により、開発時間が長くなる傾向がありました(p = 0.08; 表4)、および各食餌と対照との比較は、100ppmから始まる有意な効果を示した(p = 0.022; 図4)。

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図1:蝶の組織と宿主植物で観察された焦点金属のレベル 。 (62からのデータ。銅、ニッケル、亜鉛のレベルは、ピエリス蝶の組織(実験室でチンゲン菜で飼育)と野生で収集されたマスタード(Bertorea sp.)について示されています。車は、交通量の多い道路53沿いの植物の葉に見られるレベルを示しています。この研究で使用された人工食中の金属のレベルは 表1に報告されています。点は平均を表し、エラーバーは標準誤差を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:毒素の濃度を高めた人工飼料に同じ日にキャベツの白い幼虫を移した画像。 この画像は、用量反応研究からの幼虫を示しています(有毒植物アリストロキアの乾燥植物材料を使用して 28 で提示)。写真提供:ESR この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:濃度が増加する金属食間の生存率の変動。 アスタリスクは、対照食と比較して生存率の有意な偏差を示す。食事中の正確な金属濃度を 表2に示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:現像時間に及ぼす金属濃度の影響。 アスタリスクは、対照に対して有意差がある最低金属濃度を示します(t検定を使用)。食事中の正確な金属濃度を 表2に示します。点は平均を表し、エラーバーは標準誤差を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:他の鱗翅目における金属耐性の要約。示されているのは、11件の既存の研究49、50、51、56、63、64、65、66、67、68からプロットされた複合生存データである。応答変数は、生存への悪影響が最初に見られる金属濃度のレベル(ppm)です。蝶はこの研究の結果を示しており、ニッケルの許容値はこの研究で測定されたものよりも高かったことを指摘しています。点は平均を表し、エラーバーは標準誤差を表します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

成分重量を量るgミリリットル
小麦胚芽乾燥成分50
セルロース乾燥成分10
キャベツ粉乾燥成分15
カゼイン乾燥成分27
蔗糖乾燥成分24
ウェッソンソルトミックス乾燥成分9
トルラ酵母乾燥成分12
コレステロール乾燥成分3.6
ビタミンミックス乾燥成分10.5
メチルパラベン乾燥成分0.75
ソルビン酸乾燥成分1.5
アスコルビン酸乾燥成分3
ストレプトマイシン乾燥成分0.175
亜麻仁油湿った材料5
寒天寒天15

表1:人工食のレシピ。 示されているのは、キャベツホワイトバタフライダイエットの1バッチに含まれる成分の重量(および量)です。乾燥成分(および亜麻仁油)は、寒天混合物とは別に調製されます(400 mLの沸騰水に溶解し、次に400 mLの室温水でより低温にします)。

ダイエットタイプ銅 (ppm)ニッケル (ppm)亜鉛(ppm)
銅 - "100 ppm"96.11.7569.9
ニッケル - "100 ppm"7.29109.668.9
亜鉛 - "100 ppm"7.961.06186.2
亜鉛 - "500 ppm"6.511.16708
コントロール5.890.5959.3

表2:食事中の金属の測定。 示されているのは、研究で使用された人工食のサブセットにおける銅、ニッケル、亜鉛の平均レベルです。ダイエット名(分析では「タイプ」)が左側に表示され、引用符で囲まれた値が計算されたレベルです。目標濃度は引用符で囲んで示しています。研究で使用された食事のサブセットを分析して、計算値が実現値で目標に達していることを確認しました。食事成分の組成にはわずかな変動があることが多く、報告された各系統は1回の反復のみを表すことに注意してください。

MetalピアソンX32P
銅 (N = 118)17.820.0005
ニッケル (N = 152)3.450.33
亜鉛 (N = 152)12.520.006

表3:生存に対する金属濃度の影響。 各金属のカイ二乗検定の結果を示し、対照食に対する3つの金属濃度を対比させた。

メタルFP
銅 (N = 61)F3,57 = 9.84<0.0001
ニッケル (N = 75)F3,71 = 2.350.079
亜鉛(N = 64)F3,60= 3.790.015

表4:現像時間に及ぼす金属濃度の影響。 各金属の個々のANOVAの結果を示しています。

データの可用性:

すべてのデータはMendeley61で利用可能です。

ディスカッション

本研究では、キャベツシロチョウ(Pieris rapae)を人工食で飼育し、重金属毒性の違いを調べました。そうすることで、この研究は、この操作が容易な蝶システムの飼育と実験室研究のための一般的な方法を提供します。この議論では、最初にここでレビューされた方法に関するより一般的な質問を検討し、次に科学的発見を確認してから、人工食の成分についての考察で締めくくります。

ここでレビューしたプロトコルは、キャベツの白い蝶の一般的な飼育方法の手順を示していますが、このプロトコルには微調整できる多くのポイントがあります。たとえば、ここで紹介するケーススタディではスポンジを使用して給餌していますが、他の研究者は蜂蜜水で満たされた歯の芯と絹の花で運が良かったです5。本研究では蜂蜜水を食品として使用していますが、他の研究者は砂糖溶液やゲータレードさえ使用しています。蛹の体重を量る必要がある場合、または出現のために他の条件に移動する必要がある場合(たとえば、休眠を誘発し、1か月間冷蔵する必要がある)、研究者は、水を噴霧してシルクアタッチメントを湿らせ、羽毛鉗子でつかみ、両面テープを使用して再度吊るすことで、カップから簡単に取り除くことができます。研究者が成虫の行動のためにケージに移動するタイミングに関してより柔軟性が必要な場合は、数週間冷蔵庫に保管できますが、給餌する必要があります。数日ごとに、蝶を取り出して希薄な蜂蜜水溶液を与えてください。屋内照明の下では、ピンを使用してテングを食品に広げることでこれを行うことができます。大人のパフォーマンスの側では、キャベツの白い蝶に幅広いフィットネス対策を講じることができます。体の大きさは、特定の段階、蛹、または成虫(犠牲にされるか、またはグラシンエンベロープに保持される)における幼虫の湿ったまたは乾燥した塊として、またはプログラムImageJ(12,24,25,28を参照)での翼の長さの測定によって測定することができる。雌の生涯産卵数は、宿主植物25,69,70での毎日の採卵を通じて測定でき、特定の形質のサイズはパフォーマンスの指標として測定できます。例えば、脳または個々の脳領域62、71、72の質量または体積、または胸部または飛翔筋62、70の質量またはタンパク質含有量。最後に、成人を行動研究で使用して、採餌または産卵の選択に対する食事操作の影響を調べる任意の数の質問をテストできます27,73。

飼育プロトコルが期待どおりに機能しない場合は、トラブルシューティングすべき側面がいくつかあります。まず、光のレベルが通常の大人の行動を引き出すのに十分高いかどうかを尋ねることができます。実験室に適応したピエリスの系統は蛍光灯の下で産卵しますが、野生型の系統で機能する唯一の人工光は強力な広域スペクトル温室ライトです。温室、窓辺、または屋外の自然光は、交尾と産卵行動を引き出すのに最適です。第二に、卵が孵化していない場合、または幼虫が発育の初期に死んでいる場合は、考慮すべきことがいくつかあります。宿主植物の材料は有機でなければならず、店からの「有機」植物は幼虫を殺すことができる化学物質で処理されることがあるので、自分の宿主植物を育てることがしばしば最善であることに注意してください。宿主の受け入れ率が低い場合は、窒素含有量の高い若い葉を試して、個々の葉の代わりに鉢植えの植物を提示し、雌が交配されるようにすることができます。女性は、2週齢の小さな芽でさえ、アブラナ属の播種を受け入れます。パラフィン法は卵をさまざまな条件に移すのに適していますが、合格率は植物全体よりも低くなる傾向があることに注意する必要があります。第三に、食事のすべての成分は高品質で期限切れになっていなければなりません。亜麻仁油は毎年交換し、冷蔵庫に保存する必要があります24,25。小麦胚芽、ビタミンミックス、抗生物質も涼しく保つ必要があります。第四に、ダイエットカップのセットアップを微調整することを検討できます。1オンスから15オンスまでの任意の数の使い捨てプラスチックカップタイプを飼育に使用できます。4オンスは成虫の出現を可能にするのに適したサイズであり、気候室にうまく詰め込まれていることがわかりました。蓋に突っ込んだ穴は空気の流れを可能にしますが、穴が多すぎると低湿度の状態で食事が乾燥する可能性があるため、この数を調整する必要がある場合があります。第五に、気候チャンバー内の条件は、カップの状態と組み合わせて調整する必要があるかもしれません。条件が乾燥しすぎると、幼虫が移動する前に卵のある宿主植物が乾燥し、蝶が出現する前に食事の入ったカップが乾燥する可能性があります。一方、条件が湿りすぎると、カップにカビや病気が潜む可能性があります。研究者は、メッシュの蓋、または蓋の多かれ少なかれ穴を使用して、カップ内の気流を調整する必要があるかもしれません。別の一般的な問題は、カップ内の温度変動と結露の蓄積を引き起こすのに十分明るいチャンバーライトです。調光ライトを使用することは、幼虫の飼育のための簡単なオプションです。

この論文の研究課題に関して、この研究では、キャベツの白はニッケルや亜鉛よりも銅に比較的敏感であることがわかりました。銅は、50 ppmという低い濃度での開発時間(図3および表3)および500 ppmでの生存(図4、表4)に重大な悪影響を及ぼしました。対照的に、生存に対するニッケルの悪影響はありませんでした(最大500ppm;図3)または100ppmでの開発時間への悪影響(図4)。キャベツ白は亜鉛に対してかなり耐性があり、生存効果は1,000ppmでしか見られず(図3)、100ppmから発育時間への悪影響が見られました(図4)。蝶の組織とマスタード(それらの宿主植物;図1)、亜鉛に対する耐性が比較的高いことが予想されました。しかし、銅に対する感受性とニッケルの耐性は、蝶の組織中のニッケルのレベルが非常に低く(図1)、微量栄養素としての銅の必要性を考えると、やや予想外でした。これらの予想外の発見は、他の蝶や蛾におけるこれらの金属の耐性を考慮した後、以下で議論されます。

現在のデータを他の鱗翅目で測定された金属感受性と比較するために、既存の研究からのデータは、重金属が生存に悪影響を及ぼした最小濃度についてまとめられました49,50,51,56,63,64,65,66,67,68;これらの研究は、蛾、特に害虫種(ガレリアメロネラ、リマントリアディスパー、プルテラキシロステラ、スポドプテラsp.)に焦点を当てていました。この研究で測定された感度値はすべて、これらの他の種について測定された範囲に近いです(図5)。しかし、この研究におけるニッケル耐性の尺度は予想よりも高いようです-500ppmでの生存の有意な効果はありませんでしたが、Pieris rapaeに関する以前の研究では、自然に組織のレベルが低いにもかかわらず、ニッケルに対する非常に高い耐性(1,000ppmから始まる有意な効果56)も発見されました(図1).この研究における銅感受性の尺度は、鱗翅目の研究にとっても下限にあるようです。人工食を使用すると、相対的な金属感受性の便利で制御された比較が可能になりますが、食事の成分が絶対金属感受性の測定を変える可能性があることに注意することが重要です。たとえば、食事中のビタミンCは金属誘発性の酸化ストレスを相殺することができ74、食事中の抗生物質は金属の処理に対する微生物の影響を変える可能性があります75。将来の興味深い研究は、特に鱗翅目の腸内微生物76,77と抗酸化特性を持つ可能性のある蜜成分78の機能的役割に関する質問を考えると、金属毒性への影響をテストするためにそのような食事成分を体系的に操作することです。さらに、種間の食事要件のばらつきは種間比較を困難にする可能性があり、人工飼料ベースの方法は宿主植物の操作で補完されるべきです。

これらの蝶はニッケルに特に耐性があり、銅に敏感です。以前の研究では、Pieridaeが好む植物を含むマスタードファミリーの多くの植物が、草食動物に対する防御メカニズムとしてニッケルを過剰に蓄積することが指摘されています55,56,63,79,80,81。この過剰蓄積は植物組織で1,000ppmを超えており、これはほとんどの植物で見られるものよりも桁違いに大きいです(図1)。以前に推測されたように、ピエリスはそのようなニッケルアキュムレータによる過去の選択のためにニッケルに対して特に高い耐性を持っている可能性があります26。銅は昆虫の餌に含まれる微量栄養素としてはあまり研究されていませんが、主に採血昆虫ではありますが、生殖と免疫に小さな役割を果たしているという証拠がいくつかあります(例:82,83)。銅は他の動物よりも蝶においてそれほど重要な生理学的役割を果たさない可能性があり84,85,86、銅が鉛、カドミウム、水銀と同じくらい昆虫の汚染物質である可能性があることを強調した最近の研究と一致しています(例えば、87,88,89)。ピエリスは低レベルで銅汚染を回避することが示されていますが90、植物における銅の移動性(葉や花への移動など)も、懸念される金属汚染物質としてフラグを立てています91。

これらの結果は、キャベツシロチョウに対するこれらの金属の相対毒性に関する興味深いデータを提供する一方で、この論文は、この強力なシステムを育てる方法の詳細な視覚的説明として一般的に役立つことも目的としています。キャベツホワイトは、制御された実験室実験4,5で飼育および操作が容易であり、宿主検索6,7,8、採餌9,10,11、および性淘汰12,13,14の研究を容易にします。人工食でこれらの蝶を飼育する能力は、比較のための一般的な庭の条件を作成し、栄養素、毒素、さらには新しい宿主植物を操作する上で重要です。ただし、この人工食は必ずしもこの種の最適な人工食ではなく、将来の操作で改善される可能性があることに注意することが重要です。たとえば、この食事(および他の鱗翅目食)の塩ミックスは、もともと脊椎動物用に開発されたものであり、ほとんどの昆虫が必要とするものよりも高いカルシウムレベルを持っています92,93。したがって、私たちの飼育努力のいくつかは、より低いカルシウムレベルのカスタムソルトミックス(例えば、62)を作り、他のものは、多くの昆虫種にもっと適しているかもしれない「ベックの塩ミックス」を利用しました94。私たち自身の操作では、蝶は元の濃度と比較して、小麦胚芽が比較的少なく、セルロースが比較的多いほど優れたパフォーマンスを発揮することもわかりました4。さらに注意が必要な分野の1つは、脂質源と食事中の濃度です。たとえば、過去の研究では、亜麻仁油(この研究で使用)からリン脂質に移行すると、人工飼料でのPierisの交配率と成長率が向上することが示されています95。人工食における特定の脂肪酸の補給は、追加のプラスの効果をもたらす可能性がある96,97。Pieris98,99の人工食を最適化することで、栄養生態学100,101,102、進化生態学、生態毒性学に関する興味深い質問に取り組む機会が生まれます。これらの人工食アプローチにより、研究者は、認知進化における特定の脂質の役割103、毒素への事前適応28、汚染物質の毒性を低減する食事成分104、または栄養素間の化学量論的相互作用105に関する質問に取り組むことができます。

開示事項

著者には、宣言する利益相反はありません。

謝辞

この仕事の飼育中の学部助手、特にレジーナ・クランディナとレア・スミカルスキーのサポートに感謝します。キャロリン・カリノフスキーは、他の鱗翅目の金属毒性に関する文献の編集を支援しました。この作業は、ミネソタ大学の生態学、進化、行動学部の夏の研究助成金によって可能になりました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1-L Pyrex beakerFisher Scientific07-250-059
500 mL graduated cylinderFisher Scientific03-007-43
60-mm plastic petri dish lidFisher Scientific08-757-100B
Ascorbic AcidFrontier6015
BlenderAmazon - Ninja StoreBL610 Professional
Cabbage FlourFrontier1086
CaseinFrontier1100
CelluoseFrontier3425
CholsterolSigmaC3045
Cups for rearing (4 oz)Wasserstrom6094583purchase with matching lids
Fine Mesh AgarSigma
Flaxseed OilamazonB004R63VI6
Floral water tubes, 2.8 x 0.8inchAmazon - Yimaa DirectB08BZ969DK
Glassine envelopes (1 3/4 x 2 7/8 INCHES)Amazon - Wizard Coin SupplyB0045FG90G
Mesh Cages (15.7 x 15.7 x 23.6")AmazonB07SK6P94S
Methyl ParabenFrontier7685
Ohaus Portable ScaleFisher Scientific02-112-228
Organic HoneyAmazonB07DHQQFGM
Photo studio portable lightboxAmazonB07T6TNYJ1
Plastic bin, shoebox sizeAmazonB09L3B3V1R
Plastic disposable transfer pipetsFisher Scientific13-680-50
Sorbic AcidSigmaS1626
SpatulasFisher Scientific14-357Q
StreptomycinSigmaS9137
SucroseTarget
Torula YeastFrontier1720
Vanderzant vitamin mixFrontierF8045
Weigh boatsFisher Scientific01-549-750
Wesson Salt MixFrontierF8680
Wheat GermFrontierG1659
Wooden handled butterfly net, 12" hoopAmazon - Educational ScienceB00O5JDLVC
Yellow spongesAmazon-CeloxB0B8HTHY5B

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