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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo describe un método que utiliza una pinza de parche para estudiar las respuestas eléctricas de las neuronas motoras a la estimulación de la médula espinal (SCS) con alta resolución espacio-temporal, lo que puede ayudar a los investigadores a mejorar sus habilidades para separar la médula espinal y mantener la viabilidad celular simultáneamente.

Resumen

La estimulación de la médula espinal (SCS, por sus siglas en inglés) puede restaurar eficazmente la función locomotora después de una lesión de la médula espinal (SCI, por sus siglas en inglés). Debido a que las neuronas motoras son la unidad final para ejecutar los comportamientos sensoriomotores, el estudio directo de las respuestas eléctricas de las neuronas motoras con SCS puede ayudarnos a comprender la lógica subyacente de la modulación motora espinal. Para registrar simultáneamente diversas características de estímulos y respuestas celulares, un patch-clamp es un buen método para estudiar las características electrofisiológicas a escala de una sola célula. Sin embargo, todavía existen algunas dificultades complejas para lograr este objetivo, incluido el mantenimiento de la viabilidad celular, la separación rápida de la médula espinal de la estructura ósea y el uso del SCS para inducir con éxito potenciales de acción. Aquí, presentamos un protocolo detallado que utiliza patch-clamp para estudiar las respuestas eléctricas de las neuronas motoras al SCS con alta resolución espacio-temporal, lo que puede ayudar a los investigadores a mejorar sus habilidades para separar la médula espinal y mantener la viabilidad celular al mismo tiempo para estudiar sin problemas el mecanismo eléctrico del SCS en la neurona motora y evitar pruebas y errores innecesarios.

Introducción

La estimulación de la médula espinal (SCS, por sus siglas en inglés) puede restaurar eficazmente la función locomotora después de una lesión de la médula espinal (SCI, por sus siglas en inglés). Andreas Rowald et al. informaron que el SCS permite la función locomotora y troncal de las extremidades inferiores en un solo día1. La exploración del mecanismo biológico del SCS para la recuperación locomotora es un campo de investigación crítico y de tendencia para desarrollar una estrategia de SCS más precisa. Por ejemplo, el equipo de Grégoire Courtine demostró que la interneurona excitadora Vsx2 y las neuronas Hoxa10 en la médula espinal son las neuronas clave para la respuesta al SCS, y la neuromodulación específica de la célula es factible para restaurar la capacidad de caminar de la rata después de la LME2. Sin embargo, pocos estudios se centran en el mecanismo eléctrico del SCS a escala de una sola célula. Aunque es bien sabido que el estímulo de corriente continua supraumbral puede provocar los potenciales de acción (AP) en el experimento clásico del calamar 3,4,5, aún no está claro cómo la estimulación eléctrica alterna pulsada, como la SCS, afecta a la generación de señales motoras.

Dada la complejidad de los circuitos neuronales intraespinales, la selección adecuada de la población celular es importante para investigar el mecanismo eléctrico del SCS. Aunque el SCS restaura la función motora mediante la activación de la vía propioceptiva6, las neuronas motoras son la unidad final para ejecutar el comando motor, derivado de la integración de la información de la propiocepción de entrada aferente7. Por lo tanto, el estudio directo de las características eléctricas de las neuronas motoras con SCS puede ayudarnos a comprender la lógica subyacente de la modulación motora espinal.

Como sabemos, el patch-clamp es el método de referencia para el registro electrofisiológico celular con una resolución espacio-temporal extremadamente alta8. Por lo tanto, este estudio describe un método que utiliza una pinza de parche para estudiar las respuestas eléctricas de las neuronas motoras al SCS. En comparación con el parche cerebral9, el parche clamp de la médula espinal es más difícil debido a las siguientes razones: (1) La médula espinal está protegida por el canal vertebral con un volumen minúsculo, lo que requiere una micromanipulación muy fina y un riguroso mantenimiento en frío para obtener una mejor viabilidad celular. (2) Debido a que la médula espinal es demasiado delgada para asegurarla en la bandeja de corte, debe sumergirse en agarosa de bajo punto de fusión y recortarse después de la solidificación.

Por lo tanto, este método proporciona detalles técnicos para diseccionar la médula espinal y mantener la viabilidad celular al mismo tiempo para estudiar sin problemas el mecanismo eléctrico del SCS en las neuronas motoras y evitar pruebas y errores innecesarios.

Protocolo

El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales aprobó todos los experimentos con animales y los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con las normas pertinentes de bienestar animal.

1. Preparación de los animales

  1. Animales
    1. Información sobre el alojamiento: Aloje ratas macho Sprague-Dawley (Postnatal 10-14 días, P10-P14) en un ambiente específico libre de patógenos.
      NOTA: Las condiciones de la habitación se mantuvieron a 20 °C ± 2 °C, humedad: 50%-60%, con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Los animales tenían libre acceso a comida y agua.
    2. Etiquetar las neuronas motoras retrógradamente: Inyectar Fluoro-Gold (FG) en el tibial bilateral anterior y en el músculo gastrocnemio (2% en solución salina estéril, 50 μL por músculo) para etiquetar retrógradamente las neuronas motoras 2 días antes del sacrificio.
  2. Soluciones
    1. Prepare la solución de corte: Mezcle 120 mM de cloruro de colina, 2,6 mM de KCl, 26 mM de NaHCO 3, 1,25 mM de NaH 2 PO4, 0,5 mM de CaCl 2, 7 mM de MgCl 2, 1,3 mM de ácido ascórbico, 15 mM de glucosa. Pre-burbujee la solución con 95% deO2 y 5% de CO2 (ajuste a pH 7.4 con KOH) durante 30 minutos antes de la disección y el corte. Enfríe la solución con hielo picado.
    2. Preparar líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF): Mezclar 126 mM de NaCl, 3 mM de KCl, 1,2 mM de NaH2PO4; 1,3 mM de MgCl 2, 2,4 mM de CaCl2, 26 mM de NaHCO3 y 10 mM de glucosa. Preburbujee la solución con 95% deO2 y 5% de CO2 durante 30 minutos antes de la incubación.
    3. Preparar la solución intracelular: Mezclar 126 mM de K-gluconato, 2 mM de KCl, 2 mM de MgCl 2, 0,2 mM de EGTA, 10 mM de HEPES, 4 mM de Na 2 ATP, 0,4 mM de Na2GTP, 10 mM de K-fosfocreatina y0,5% de neurobiotina (pH 7,25 y 305 mOsm/kg). Enfríe la solución con hielo picado.
    4. Prepare gel de agarosa de bajo punto de fusión: Disuelva 4 g de agarosa en 100 ml de solución de corte y use un rotor de agitación magnética para disolverlo por completo. A los 30 minutos antes de la inmersión, calentar la agarosa de bajo punto de fusión en el horno microondas a alta potencia durante 1 min, y luego transferirla a un baño de agua a 39 °C para mantener el estado líquido.
  3. Preparación del instrumento
    1. Coloque hielo picado en la bandeja de perfusión (Figura suplementaria 1A) 10 min antes de la perfusión. Coloque la bandeja anatómica (Figura complementaria 1B) y la bandeja de corte (Figura complementaria 1C) con una banda de agua a -80 °C durante la noche con antelación.
    2. Coloque la cámara de incubación con malla de nailon en el horno a 45 °C durante la noche con anticipación.
    3. Utilice agarosa de bajo punto de fusión para prefabricar una pendiente de 35° y una plataforma de 2 mm de espesor (Figura complementaria 1D). Después de la solidificación del gel, colóquelos en el centro de una placa de Petri de 35 mm para sostener la médula espinal en los próximos procedimientos.
  4. Perfusión intracárdica
    1. Anestesiar a las ratas con tribromoetanol al 2,5% (160 μL/10 g) mediante inyección intraperitoneal. Asegúrese de que las ratas estén completamente anestesiadas verificando la falta de respuesta a estímulos externos, como un suave pellizco del dedo del pie.
    2. Cuando se confirme la anestesia adecuada, coloque a las ratas en decúbito supino e inmovilícelas en la placa de Petri llena de gel de sílice.
    3. Realice una incisión cutánea longitudinal de 5 mm caudalmente hasta la apófisis xifoides, luego expanda completamente el espacio subcutáneo. Realice una incisión longitudinal de 2 cm en la piel a lo largo de la línea media ventral para exponer completamente la pared torácica externa, comenzando con la incisión mencionada anteriormente y terminando con la parte superior del tórax.
    4. Use pinzas dentadas para levantar el xifoides (Figura complementaria 2A) y luego use tijeras finas para cortar el diafragma. Cortar el esternón a lo largo de ambos lados de la apófisis xifoides para abrir el tórax y exponer el corazón (Figura complementaria 2B).
      NOTA: Tenga cuidado de preservar los vasos torácicos internos en ambos lados; de lo contrario, puede causar un sangrado masivo.
    5. Use pinzas desdentadas para levantar el ventrículo izquierdo. Inserte una aguja de 22 G en el ápice del ventrículo izquierdo a lo largo del eje longitudinal del ventrículo izquierdo (Figura complementaria 2C). Mientras tanto, observe la pulsación rítmica de la sangre en el tubo de perfusión, o la aguja puede perforarse en el ventrículo derecho, lo que puede provocar un efecto de perfusión deficiente.
      NOTA: No se debe utilizar pinza dentada; de lo contrario, puede causar una fuga de sangre adicional del sitio de sujeción de la pinza.
    6. Use unas tijeras finas para cortar la aurícula derecha (Figura complementaria 2C), luego inyecte manualmente 100 ml de líquido perfundidor helado a una velocidad de aproximadamente 2 ml/s en 1 minuto.
      NOTA: Cuando el hígado y las patas de las ratas se vuelven pálidos y no fluye sangre por la aurícula derecha, se puede lograr una buena perfusión.
  5. Disección de la médula espinal (Figura 1)
    1. Coloque a la rata en decúbito prono y corte la columna vertebral en la espina ilíaca anterosuperior (aproximadamente a nivel vertebral L4) y el punto de desplazamiento de la curvatura de la columna torácica (aproximadamente el nivel vertebral T6), respectivamente (Figura 1A). Luego, coloque inmediatamente la columna vertebral aislada en la solución perfundida oxigenada helada para lavar la sangre residual y el tejido graso; Este procedimiento es beneficioso para mantener limpio el campo operativo en los procedimientos posteriores.
      NOTA: Los músculos paraespinales deben reservarse, lo que favorece la posterior fijación de la columna vertebral mediante el uso de un alfiler para insectos.
    2. Transfiera inmediatamente la columna vertebral aislada a la bandeja anatómica (Figura 1B) con el lado dorsal hacia arriba y el extremo rostral cerca del operador. Llene la bandeja anatómica con 50 ml de solución de corte helada oxigenada continuamente (Figura 1B).
    3. Use cuatro clavos de insectos para fijar la columna vertebral penetrando los músculos paraespinales (Figura 1B).
    4. Bajo el microscopio de disección, corte los pedículos vertebrales de ambos lados desde el extremo rostral con la microtijera, lo que se puede denominar "laminectomía" (Figura 1C). Preste atención para no dañar la médula espinal. Mientras tanto, use las pinzas microdentadas para levantar el cuerpo vertebral cortado.
    5. Después de la laminectomía, no separe la médula espinal del canal espinal inmediatamente. En su lugar, utilice una microtijera para cortar la duramadre a lo largo de la línea media dorsal, que favorece la absorción de nutrientes entre las células y la ACSF oxigenada (Figura 1D).
      NOTA: Nunca desgarre la duramadre. Solo se permite cortar la duramadre con una microtijera; De lo contrario, la raíz nerviosa y el parénquima espinal se dañarán gravemente.
    6. Levante la parte rostral de la médula espinal, luego corte con cuidado la raíz nerviosa con aproximadamente 1 mm reservado (Figura 1E). Después de separar la médula espinal del canal vertebral, use 2 clavos para insectos para fijar la médula espinal con el lado ventral hacia arriba (Figura 1F).
    7. Use una microtijera para cortar la duramadre a lo largo de la línea media ventral (Figura 1F). Corta las raíces nerviosas redundantes con aproximadamente 1 mm reservado.
      NOTA: El nervio es mucho más tenaz que la médula espinal. Si la raíz nerviosa reservada es demasiado larga (>1 mm), el vibrátomo no puede cortar la raíz nerviosa, lo que puede provocar un desgarro grave en el parénquima espinal.
    8. Utilice una microtijera para separar el agrandamiento lumbar a una longitud de 6-7 mm (Figura 1G).
  6. Incrustación en la agarosa de bajo punto de fusión
    1. Coloque el agrandamiento lumbar en la pendiente de 35 ° (Figura 1H) con el lado dorsal hacia arriba y el extremo caudal hacia abajo. Utilice un papel de filtro absorbente para eliminar la abundante agua de la superficie del tejido (Figura 1H).
    2. Vierta lentamente el gel de agarosa fundido en la placa de Petri que contiene el agrandamiento lumbar (Figura 1I).
      NOTA: No vierta demasiado rápido, o se acumularán burbujas en el gel.
    3. Coloque la placa de Petri anterior en la mezcla de agua helada para enfriar el gel lo antes posible, lo que favorece el mantenimiento de la actividad de las células.
    4. Recorte el gel en un cubo de 15 mm x 10 mm x 10 mm y móntelo en el disco de muestra con superpegamento (Figura 1J).
  7. Rebanar
    1. Coloque el disco de muestra en la bandeja de corte precongelada, luego vierta la solución de corte helada (Figura 1K). Burbujear continuamente con 95% de CO2 y 5% deO2 en la bandeja de corte.
    2. Ajuste los parámetros del vibratomo: espesor: 350 μm; velocidad: 0,14-0,16 mm/s, amplitud: 1,0 mm y frecuencia de vibración: 85 Hz.
    3. Coseche 2-3 rodajas adecuadas por animal. Registre 1-2 neuronas motoras FG+ sanas por corte, con un rango de 5-6 células por animal.
  8. Incubación
    1. Use pinzas deslizantes para sujetar una rebanada (Figura 1L) y colóquela en la cámara de incubación llena de ACSF oxigenado continuamente. Coloque la cámara de incubación en un baño de agua a 32 °C durante 30 minutos y luego continúe incubándola a temperatura ambiente (RT) durante otros 30 minutos antes del registro.
      NOTA: Los procedimientos anteriores, desde la anestesia hasta la obtención de la primera rebanada, deben completarse dentro de los 20-30 minutos para mantener la viabilidad de las células tanto como sea posible. Las neuronas motoras de cada corte pueden mantener su viabilidad durante aproximadamente 6-7 h.

2. Registro de patch-clamp con SCS (Figura 2)

  1. Preparativos
    1. Perfundir la cámara de grabación con ACSF de burbujas continuas a una velocidad de aproximadamente 1-2 ml/min. Ajuste el caudal individualmente a través del panel de control de la bomba peristáltica.
    2. Coloque una rebanada en la cámara de grabación. Use el alambre de platino en forma de U con hilos de nailon para estabilizar firmemente la rebanada en su lugar.
    3. Utilice un microscopio infrarrojo de contraste de interferencia diferencial (IR-DIC) para observar el corte. Bajo la lente del objetivo 4x, confirme que la longitud de la raíz dorsal es de aproximadamente 1 mm. Encuentre el área donde la raíz dorsal ingresa al parénquima, luego mueva el campo de visión central a esta área.
    4. Conecte el generador de impulsos con electrodos hechos a medida (Figura 2A).
  2. Configuración de SCS
    1. Coloque el ánodo de SCS cerca de la línea media dorsal a través del sistema de micromanipulación (Figura 2B).
    2. Coloque el cátodo de SCS cerca de la zona de entrada de la raíz dorsal (DREZ) a través del sistema de micromanipulación (Figura 2B).
  3. Focalización celular e imágenes
    1. Utilice IR-DIC con una lente de objetivo de 10x para encontrar aproximadamente la región dorsolateral de la columna motora, donde se encuentran la mayoría de las neuronas motoras. Luego, mueva el campo de visión central a esta área.
    2. Cambie a una lente de objetivo de 60x para encontrar una neurona sana con una superficie lisa y brillante y núcleos invisibles (Figura 2C, F).
    3. Baje ligeramente la intensidad de los infrarrojos y encienda la fuente de luz de fluorescencia. Cambie el filtro de luz al filtro de excitación ultravioleta de banda ancha (Figura 2D, G), para seleccionar una neurona motora FG positiva (FG+) adecuada (Figura 2E, H).
    4. Utilice electrodos de succión para aplicar 1 estimulación del umbral motor a la raíz dorsal. Si se detecta un potencial de acción evocado en las neuronas motoras (Figura suplementaria 3), se confirma que la actividad de la raíz dorsal está intacta. De lo contrario, esta porción debe descartarse.
  4. Grabación de patch-clamp
    1. Llene la micropipeta con la solución intracelular e insértela en el portaelectrodos. Utilice el sistema de micromanipulación para bajar la pipeta al baño ACSF. La resistencia de la pipeta oscila entre 5 y 8 MΩ.
    2. Aplique una pequeña cantidad de presión positiva a la pipeta para eliminar el polvo y los residuos celulares.
      1. Baje el electrodo para acercarse a la celda. Cuando la pipeta toca la superficie de la neurona FG+, se hace visible una pequeña hendidura de la membrana a nivel de la punta. Libere la presión positiva.
      2. A continuación, aplique una pequeña cantidad de presión negativa a la pipeta con una jeringa. Esto crea una pequeña cantidad de succión que hace que la membrana celular entre en contacto con la pipeta de vidrio. Siempre preste atención a la resistencia total en la interfaz del software hasta que el valor de resistencia aumente a gigaohmios (>1 GΩ). A continuación, se forma el gigaseal.
    3. Sujete el potencial de membrana a -70 mV, luego presione el botón de compensación rápida de capacitancia en la interfaz de software del amplificador. Aplique suavemente una presión negativa transitoria para romper la membrana celular, luego presione el botón de compensación de capacitancia lenta en la interfaz de software del amplificador. En este punto, se obtiene una buena configuración de la célula entera.
    4. Cambie al modo de pinza amperimétrica haciendo clic en el botón IC en la interfaz del software y registre el potencial de membrana en reposo (RMP).
    5. Aplique el SCS durante 1-2 s con una amplitud de 1-10 mA, mientras que el ancho de pulso y la frecuencia se fijan en 210 μs y 40 Hz, respectivamente. Determinar el umbral motor aumentando lentamente la amplitud de estimulación hasta que se observe el primer PA.
    6. Distinga las neuronas motoras de disparo retardado e inmediato utilizando una inyección de corriente despolarizante de 5 s alrededor de la reobase en el modo de pinza de corriente10,11,12. Activación inmediata de las neuronas motoras: Una reobase baja puede inducir una activación inmediata y repetitiva con una frecuencia de disparo estable; Neuronas motoras de disparo retardado: La reobase alta puede inducir un inicio tardío de disparo repetitivo con una velocidad de disparo acelerada (Figura 3).
    7. Cuando el SCS está apagado, continúe registrando el potencial de membrana para capturar el disparo espontáneo de los AP.
    8. Realice grabaciones de pinza amperimétrica para la corriente postsináptica excitatoria (EPSC) cuando SCS está encendido y apagado. El parámetro de estimulación es 1x umbral motor, 210 μs, 2 Hz.

Resultados

Gracias al riguroso mantenimiento a baja temperatura durante la operación fina (Figura suplementaria 1, Figura suplementaria 2 y Figura 1), la viabilidad de la celda fue lo suficientemente buena como para realizar registros electrofisiológicos posteriores. Para simular al máximo el escenario clínico, utilizamos la micromanipulación para colocar el cátodo y el ánodo del SCS cerca de la línea media dorsal y el DREZ, respectivamente (Figura 2

Discusión

La información de movimiento modulada por el SCS finalmente converge a las neuronas motoras. Por lo tanto, tomar las neuronas motoras como objetivo de investigación puede simplificar el diseño del estudio y revelar el mecanismo de neuromodulación del SCS de manera más directa. Para registrar simultáneamente diversas características de estímulos y respuestas celulares, un patch-clamp es un buen método para estudiar las características electrofisiológicas a escala de una sola célula. Sin embargo, todavía exist...

Divulgaciones

Ninguno

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China para Jóvenes Académicos (52207254 y 82301657) y el Fondo de Ciencias Postdoctorales de China (2022M711833).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Adenosine 5’-triphosphate magnesium saltSigmaA9187
Ascorbic AcidSigmaA4034
CaCl2·2H2OSigmaC5080
Choline ChlorideSigmaC7527
Cover slide tweezersVETUS36A-SAClip a slice
D-GlucoseSigmaG8270
EGTASigmaE4378
Fine scissorsRWD Life ScienceS12006-10Cut the diaphragm
Fluorescence Light SourceOlympus U-HGLGPS
Fluoro-GoldFluorochromeFluorochromeLabel the motor neuron
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrateSigmaG8877
HEPESSigmaH3375
infrared CCD cameraDage-MTIIR-1000E
KClSigmaP5405
K-gluconateSigmaP1847
Low melting point agaroseSigmaA9414
MgSO4·7H2OSigmaM2773
Micromanipulator Sutter Instrument MP-200
Micropipette pullerSutter instrumentP1000
Micro-scissors Jinzhongwa1020Laminectomy
Microscope for anatomyOlympus SZX10
Microscope for ecletrophysiologyOlympus BX51WI
Micro-toothed tweezersRWD Life ScienceF11008-09Lift the cut vertebral body
NaClSigmaS5886
NaH2PO4SigmaS8282
NaHCO3SigmaV900182
Na-PhosphocreatineSigmaP7936
Objective lens for ecletrophysiologyOlympus LUMPLFLN60XWworking distance 2 mm 
Osmometer Advanced FISKE 210
Patch-clamp amplifier Axon Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizerAxon Digidata 1550B
pH meter Mettler Toledo FE28
Slice AnchorMultichannel systemSHD-27H
Spinal cord stimulatiorPINST901
Toothed tweezerRWD Life ScienceF13030-10Lift the xiphoid
VibratomeLeicaVT1200S
Wide band ultraviolet excitation filterOlympus U-MF2

Referencias

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  5. Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
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