JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה המשתמשת במהדק טלאי כדי לחקור את התגובות החשמליות של נוירונים מוטוריים לגירוי חוט השדרה (SCS) ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה, אשר יכולה לסייע לחוקרים לשפר את כישוריהם בהפרדת חוט השדרה ובשמירה על קיום התא בו זמנית.

Abstract

גירוי חוט השדרה (SCS) יכול לשחזר ביעילות את תפקוד המנוע לאחר פגיעה בחוט השדרה (SCI). מאחר שהנוירונים המוטוריים הם היחידה האחרונה לביצוע התנהגויות סנסומוטוריות, לימוד ישיר של התגובות החשמליות של נוירונים מוטוריים באמצעות SCS יכול לעזור לנו להבין את ההיגיון הבסיסי של אפנון מוטורי בעמוד השדרה. כדי לתעד בו זמנית מאפייני גירוי מגוונים ותגובות תאיות, מהדק טלאי הוא שיטה טובה לחקור את המאפיינים האלקטרופיזיולוגיים בקנה מידה של תא יחיד. עם זאת, ישנם עדיין כמה קשיים מורכבים בהשגת מטרה זו, כולל שמירה על כדאיות התא, הפרדה מהירה של חוט השדרה מהמבנה הגרמי, ושימוש ב- SCS כדי לגרום בהצלחה לפוטנציאלי פעולה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט באמצעות מהדק טלאי כדי לחקור את התגובות החשמליות של נוירונים מוטוריים ל- SCS עם רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה, אשר יכול לעזור לחוקרים לשפר את כישוריהם בהפרדת חוט השדרה ושמירה על כדאיות התא בו זמנית לחקור בצורה חלקה את המנגנון החשמלי של SCS על נוירון מוטורי ולהימנע מניסוי וטעות מיותרים.

Introduction

גירוי חוט השדרה (SCS) יכול לשחזר ביעילות את תפקוד המנוע לאחר פגיעה בחוט השדרה (SCI). אנדריאס רווואלד ועמיתיו דיווחו כי SCS מאפשר תפקוד של מנוע הגפיים התחתונות ותא המטען בתוך יום אחד1. חקר המנגנון הביולוגי של SCS להתאוששות מוטורית הוא תחום מחקר קריטי וטרנדי לפיתוח אסטרטגיית SCS מדויקת יותר. לדוגמה, הצוות של גרגואר קורטין הראה כי נוירונים מעוררים Vsx2 ונוירונים Hoxa10 בחוט השדרה הם תאי העצב העיקריים לתגובה ל-SCS, ונוירומודולציה ספציפית לתא אפשרית כדי לשחזר את יכולת ההליכה של חולדה לאחר SCI2. עם זאת, מחקרים מעטים מתמקדים במנגנון החשמלי של SCS בקנה מידה של תא יחיד. אף על פי שידוע היטב כי גירוי הזרם הישר העל-גבי יכול לעורר את פוטנציאלי הפעולה (APs) בניסוי הדיונון הקלאסי 3,4,5, עדיין לא ברור כיצד הגירוי החשמלי הפועם לסירוגין, כגון SCS, משפיע על יצירת האות המוטורי.

בהתחשב במורכבות של מעגלים עצביים תוך שדרתיים, בחירה מתאימה לאוכלוסיית תאים חשובה לחקר המנגנון החשמלי של SCS. למרות ש-SCS משחזר את התפקוד המוטורי על-ידי הפעלת המסלול הפרופריוספטיבי6, הנוירונים המוטוריים הם היחידה הסופית לביצוע הפקודה המוטורית, הנגזרת משילוב קלט מידע פרופריוספציה7. לכן, לימוד ישיר של המאפיינים החשמליים של נוירונים מוטוריים עם SCS יכול לעזור לנו להבין את ההיגיון הבסיסי של אפנון מוטורי בעמוד השדרה.

כידוע, מהדק טלאי היא השיטה הסטנדרטית להקלטה אלקטרופיזיולוגית תאית ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה במיוחד8. לכן, מחקר זה מתאר שיטה המשתמשת במהדק טלאי כדי לחקור את התגובות החשמליות של נוירונים מוטוריים ל-SCS. בהשוואה למהדק טלאימוח 9, מהדק המדבקה של חוט השדרה קשה יותר מהסיבות הבאות: (1) חוט השדרה מוגן על ידי תעלת החוליות בנפח זעיר, מה שדורש מיקרומניפולציה עדינה מאוד ותחזוקה קפדנית של קור כקרח כדי להשיג יכולת קיום טובה יותר של התא. (2) מכיוון שחוט השדרה דק מכדי להיות מאובטח על מגש החיתוך, יש לטבול אותו באגרוז בנקודת התכה נמוכה ולקצץ אותו לאחר התמצקותו.

לפיכך, שיטה זו מספקת פרטים טכניים בניתוח חוט השדרה ושמירה על כדאיות התא בו זמנית כדי ללמוד בצורה חלקה את המנגנון החשמלי של SCS על נוירונים מוטוריים ולמנוע ניסויים וטעויות מיותרות.

Protocol

הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים אישרה את כל הניסויים בבעלי חיים והמחקרים נערכו בהתאם לתקנות הרלוונטיות לרווחת בעלי חיים.

1. הכנת בעלי חיים

  1. חיות
    1. מידע על דיור: חולדות Sprague-Dawley זכרים (10-14 ימים לאחר הלידה, P10-P14) בסביבה ספציפית נטולת פתוגנים.
      הערה: תנאי החדר נשמרו ב 20 ° C ± 2 ° C, לחות: 50%-60%, עם מחזור אור / כהה של 12 שעות. לבעלי החיים הייתה גישה חופשית למזון ולמים.
    2. תייגו את הנוירונים המוטוריים בנסיגה לאחור: הזריקו פלואורו-זהב (FG) לשריר הטיביאליס הקדמי ושריר הגסטרוקנמיוס הדו-צדדי (2% במי מלח סטריליים, 50 מיקרוליטר לשריר) כדי לתייג את הנוירונים המוטוריים יומיים לפני ההקרבה.
  2. פתרונות
    1. הכינו תמיסת חיתוך: ערבבו 120 mM כולין כלוריד, 2.6 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 1.25 mM NaH 2 PO4, 0.5 mM CaCl 2, 7 mM MgCl 2, 1.3 mM חומצה אסקורבית, 15 mM גלוקוז. ערבבו מראש את התמיסה עם 95% O 2 ו-5% CO2 (התאימו ל-pH 7.4 עם KOH) למשך 30 דקות לפני הנתיחה והפריסה. מצננים את התמיסה עם קרח כתוש.
    2. הכנת נוזל מוחי מלאכותי (ACSF): לערבב 126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.2 mM NaH2PO4; 1.3 mM MgCl 2, 2.4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 ו-10 mM גלוקוז. יש לבעבע מראש את התמיסה עם 95% O 2 ו-5% CO2 למשך 30 דקות לפני הדגירה.
    3. הכנת תמיסה תוך-תאית: לערבב 126 mM K-Gluconate, 2 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 0.2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM Na 2 ATP, 0.4mM Na2 GTP, 10 mM K-Phosphocreatine, ו 0.5% Neurobiotin (pH 7.25 ו 305 mOsm / Kg). מצננים את התמיסה עם קרח כתוש.
    4. הכינו ג'ל אגרוז בהתכה נמוכה: המסו 4 גרם אגרוז ב-100 מ"ל של תמיסת חיתוך, והשתמשו ברוטור ערבוב מגנטי כדי להמיס אותו במלואו. ב 30 דקות לפני ההטבעה, לחמם את נקודת ההתכה נמוכה agarose בתנור מיקרוגל עם עוצמה גבוהה במשך 1 דקות, ולאחר מכן להעביר אותו לתוך אמבט מים 39 ° C כדי לשמור על המצב הנוזלי.
  3. הכנת מכשירים
    1. הניחו קרח כתוש על מגש הזילוח (איור משלים 1A) 10 דקות לפני הזילוח. הניחו את המגש האנטומי (איור משלים 1B) ואת מגש החיתוך (איור משלים 1C) עם רצועת מים בטמפרטורה של -80°C למשך הלילה מראש.
    2. מניחים את תא הדגירה עם רשת ניילון בתנור ב 45 מעלות צלזיוס לילה מראש.
    3. השתמשו באגרוז בנקודת התכה נמוכה כדי ליצור מראש שיפוע של 35° ופלטפורמה בעובי 2 מ"מ (איור משלים 1D). לאחר התמצקות הג'ל, הניחו אותם במרכז צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ כדי לתמוך בחוט השדרה בהליכים הבאים.
  4. זילוח תוך לבבי
    1. מרדימים את החולדות עם 2.5% טריברומואתנול (160 μL/10 גרם) באמצעות הזרקה תוך צפקית. ודאו שהחולדות מורדמות לחלוטין על ידי אימות חוסר התגובה לגירויים חיצוניים, כגון צביטה עדינה של הבוהן.
    2. כאשר ההרדמה המתאימה מאושרת, מניחים את החולדות בשכיבה ומשתקים אותן בצלחת פטרי מלאה בג'ל סיליקה.
    3. חותכים חתך עור אורכי של 5 מ"מ באופן קאודלי לתהליך הקסיפואיד, ולאחר מכן מרחיבים באופן מלא את החלל התת עורי. חתכו חתך עור אורכי בקוטר 2 ס"מ לאורך קו האמצע הגחוני כדי לחשוף באופן מלא את דופן החזה החיצונית, החל מהחתך הנ"ל וכלה בחלק העליון של החזה.
    4. השתמשו בפינצטה עם שיניים כדי להרים את הקסיפואיד (איור משלים 2A), ואז השתמשו במספריים עדינים כדי לחתוך את הסרעפת. חתכו את עצם החזה לאורך שני הצדדים של תהליך הקסיפואיד כדי לפתוח את בית החזה ולחשוף את הלב (איור משלים 2B).
      הערה: יש להקפיד לשמר את כלי החזה הפנימיים משני הצדדים; אחרת, זה עלול לגרום לדימום מסיבי.
    5. השתמש בפינצטה חסרת שיניים כדי להרים את החדר השמאלי. הכניסו מחט 22G לקודקוד החדר השמאלי לאורך ציר האורך של החדר השמאלי (איור משלים 2C). בינתיים, שימו לב לפעימת הדם הקצבית בצינור הזילוח, או שהמחט עלולה לנקב בחדר הימני, מה שעלול להוביל לאפקט זילוח גרוע.
      הערה: אין להשתמש בפינצטה עם שיניים; אחרת זה עלול לגרום לדליפת דם נוספת מאתר החזקת הפינצטה.
    6. השתמשו במספריים עדינים כדי לחתוך את האטריום הימני (איור משלים 2C), ואז הזריקו ידנית 100 מ"ל של נוזל מחורר קר כקרח בקצב של כ-2 מ"ל/שנייה תוך דקה אחת.
      הערה: כאשר הכבד והכפות של חולדות מחווירים, ולא זורם דם מהאטריום הימני, ניתן להשיג זילוח טוב.
  5. דיסקציה של חוט השדרה (איור 1)
    1. הניחו את החולדה במצב נוטה, וחתכו את עמוד השדרה בעמוד השדרה האיליאק העליון הקדמי (בערך L4 ברמת החוליות) ובנקודת הסטת העקמומיות של עמוד החזה (בערך רמת חוליה T6), בהתאמה (איור 1A). לאחר מכן, הניחו מיד את עמוד השדרה המבודד בתמיסה המחומצנת הקרה כקרח כדי לשטוף את שאריות הדם ורקמת השומן; הליך זה מועיל לשמירה על ניקיון השדה האופרטיבי בהליכים הבאים.
      הערה: השרירים הפארא-ספינליים צריכים להיות שמורים, מה שתורם לקיבוע הבא של עמוד השדרה באמצעות סיכת חרקים.
    2. העבירו מיד את עמוד השדרה המבודד למגש האנטומי (איור 1B) כאשר הצד הגבי כלפי מעלה והקצה הרוסטרלי קרוב למפעיל. מלאו את המגש האנטומי ב-50 מ"ל של תמיסת חיתוך קרה כקרח מחומצנת ברציפות (איור 1B).
    3. השתמשו בארבע סיכות חרקים כדי לקבע את עמוד השדרה על-ידי חדירה לשרירים הפארא-ספינליים (איור 1B).
    4. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, חתכו את הפדיקור של החוליות משני הצדדים מהקצה הרוסטרלי בעזרת המיקרו-מספריים, שניתן לכנותו "למינקטומיה" (איור 1C). שימו לב לא לפגוע בחוט השדרה. בינתיים, השתמש בפינצטה בעלת השיניים הזעירות כדי להרים את גוף החוליה החתוך.
    5. לאחר כריתת הלמינקטומיה, אין להפריד את חוט השדרה מתעלת עמוד השדרה באופן מיידי. במקום זאת, השתמשו במיקרו-מספריים כדי לחתוך את הדורה מאטר לאורך קו האמצע הגבי, אשר תורם לספיגת חומרי מזון בין תאים ו-ACSF מחומצן (איור 1D).
      הערה: לעולם אל תקרע את הדורה מאטר. רק חיתוך הדורה מאטר על ידי מיקרו-מספריים מותר; אחרת, שורש העצב והפרנכימה בעמוד השדרה ייפגעו קשות!
    6. הרימו את החלק הרוסטרלי של חוט השדרה, ואז חתכו בזהירות את שורש העצב עם כ-1 מ"מ שמורים (איור 1E). לאחר הפרדת חוט השדרה מתעלת החוליות, השתמשו בשתי סיכות חרקים כדי לקבע את חוט השדרה כשהצד הגחוני כלפי מעלה (איור 1F).
    7. השתמשו במיקרו-מספריים כדי לחתוך את הדורה מאטר לאורך קו האמצע הגחוני (איור 1F). חותכים את שורשי העצבים המיותרים עם כ 1 מ"מ שמור.
      הערה: העצב הרבה יותר עקשן מחוט השדרה. אם שורש העצב השמור ארוך מדי (>1 מ"מ), הוויברטום אינו יכול לחתוך את שורש העצב, מה שעלול להוביל לקרע רציני בפרנכימה בעמוד השדרה.
    8. השתמשו במיקרו-מספריים כדי להפריד את ההגדלה המותנית לאורך של 6-7 מ"מ (איור 1G).
  6. הטבעה באגרוז הנמס נמוך
    1. הניחו את ההגדלה המותנית בשיפוע של 35 מעלות (איור 1H) כאשר הצד הגבי כלפי מעלה והקצה הקאודלי כלפי מטה. השתמשו בנייר סינון סופג כדי להסיר מים בשפע על פני הרקמה (איור 1H).
    2. מזגו באיטיות את ג'ל האגרוז המותך לתוך צלחת פטרי שמכילה את ההגדלה המותנית (איור 1I).
      הערה: אין לשפוך מהר מדי, אחרת יצטברו בועות בג'ל.
    3. מניחים את צלחת הפטרי הנ"ל בתערובת מי קרח כדי לקרר את הג'ל בהקדם האפשרי, מה שתורם לשמירה על פעילות התאים.
    4. חתכו את הג'ל לקובייה בגודל 15 מ"מ x 10 מ"מ x 10 מ"מ והרכיבו אותו על דיסק הדגימה עם דבק-על (איור 1J).
  7. חיתוך
    1. הניחו את דיסק הדגימה במגש החיתוך הקפוא מראש, ולאחר מכן שפכו את תמיסת החיתוך הקרה כקרח (איור 1K). מבעבעים ברציפות עם 95% CO 2 ו-5% O2 לתוך מגש החיתוך.
    2. הגדר את פרמטרי הוויברטום: עובי: 350 מיקרומטר; מהירות: 0.14-0.16 מ"מ לשנייה, משרעת: 1.0 מ"מ ותדר רטט: 85 הרץ.
    3. קצרו 2-3 פרוסות מתאימות לכל בעל חיים. רשמו 1-2 תאי עצב מוטוריים בריאים מסוג FG+ בכל פרוסה, עם טווח של 5-6 תאים לכל חיה.
  8. דגירה
    1. השתמשו בפינצטה של שקף הכיסוי כדי לחתוך פרוסה (איור 1L) והכניסו אותה לתא הדגירה המלא ב-ACSF מחומצן ברציפות. הניחו את תא הדגירה באמבט מים בטמפרטורה של 32°C למשך 30 דקות, ולאחר מכן המשיכו לדגור עליו בטמפרטורת החדר (RT) למשך 30 דקות נוספות לפני ההקלטה.
      הערה: ההליכים לעיל, מהרדמה ועד קבלת הפרוסה הראשונה, צריכים להסתיים תוך 20-30 דקות כדי לשמור על הכדאיות של התאים ככל האפשר. הנוירונים המוטוריים בכל פרוסה יכולים לשמור על יכולת הקיום שלהם במשך כ-6-7 שעות.

2. הקלטת מהדק טלאי עם SCS (איור 2)

  1. ההכנות
    1. יש לנקב את תא ההקלטה עם ACSF מבעבע ברציפות בקצב של כ-1-2 מ"ל/דקה. כוונן את קצב הזרימה בנפרד באמצעות לוח הבקרה במשאבה הפריסטלטית.
    2. הכניסו פרוסה לתא ההקלטה. השתמש בחוט פלטינה בצורת U עם חוטי ניילון כדי לייצב היטב את הפרוסה במקומה.
    3. השתמש במיקרוסקופ ניגודיות הפרדה אדום (IR-DIC) כדי לצפות בפרוסה. תחת עדשת 4x אובייקטיבית, לאשר כי אורך השורש הגבי הוא כ 1 מ"מ. מצא את האזור שבו השורש הגבי נכנס לפרנכימה, ולאחר מכן העבר את שדה הראייה המרכזי לאזור זה.
    4. חברו את מחולל הדופק באמצעות אלקטרודות מותאמות אישית (איור 2A).
  2. תצורת SCS
    1. מקמו את האנודה של SCS ליד קו האמצע הגבי דרך מערכת המיקרומניפולציה (איור 2B).
    2. מקמו את הקתודה של SCS ליד אזור הכניסה של השורש הגבי (DREZ) דרך מערכת המיקרומניפולציה (איור 2B).
  3. מיקוד והדמיה של תאים
    1. השתמש IR-DIC עם עדשה אובייקטיבית 10x למצוא בערך את האזור הדורסולטרלי של העמודה המוטורית, שבו רוב הנוירונים המוטוריים ממוקמים. לאחר מכן, העבר את שדה הראייה המרכזי לאזור זה.
    2. עברו לעדשה אובייקטיבית פי 60 כדי למצוא תא עצב בריא עם משטח חלק ובהיר וגרעינים בלתי נראים (איור 2C,F).
    3. הנמיכו מעט את עוצמת האינפרא-אדום והפעילו את מקור האור הפלואורסצנטי. העבירו את מסנן האור למסנן העירור האולטרה-סגול בפס רחב (איור 2D,G), כדי לבחור נוירון מוטורי חיובי ל-FG (FG+) מתאים (איור 2E,H).
    4. השתמש באלקטרודות יניקה כדי להחיל גירוי סף מנוע 1x על השורש הגבי. אם פוטנציאל פעולה מעורר מזוהה בתאי העצב המוטוריים (איור משלים 3), הוא מאשר שהפעילות של השורש הגבי תקינה. אם לא, יש לזרוק פרוסה זו.
  4. הקלטת מהדק טלאי
    1. ממלאים את המיקרופיפטה בתמיסה התוך תאית ומכניסים אותה למחזיק האלקטרודות. השתמש במערכת micromanipulation כדי להוריד את פיפטה לתוך האמבטיה ACSF. התנגדות פיפטה נע בין 5-8 MΩ.
    2. החל כמות קטנה של לחץ חיובי על פיפטה כדי לפוצץ את האבק ואת פסולת התא.
      1. הנמיכו את האלקטרודה כדי להתקרב לתא. כאשר פיפטה נוגעת בפני השטח של נוירון FG+, כניסה קטנה של הממברנה הופכת גלויה ברמת הקצה. שחררו את הלחץ החיובי.
      2. לאחר מכן, להחיל כמות קטנה של לחץ שלילי על פיפטה באמצעות מזרק. זה יוצר כמות קטנה של יניקה שמושכת את קרום התא למגע עם פיפטת הזכוכית. שים לב תמיד להתנגדות הכוללת בממשק התוכנה עד שערך ההתנגדות עולה לג'יגה (>1 GΩ). לאחר מכן, gigaseal נוצר.
    3. הדקו את פוטנציאל הממברנה ב- -70 mV, ולאחר מכן לחצו על כפתור פיצוי הקיבול המהיר בממשק התוכנה של המגבר. הפעילו בעדינות לחץ שלילי חולף כדי לקרוע את קרום התא, ולאחר מכן לחצו על כפתור פיצוי הקיבול האיטי בממשק התוכנה של המגבר. בשלב זה, מתקבלת תצורה טובה של תא שלם.
    4. עבור למצב מהדק זרם על ידי לחיצה על לחצן IC בממשק התוכנה ורשום את פוטנציאל קרום המנוחה (RMP).
    5. החל את SCS עבור 1-2 s עם משרעת של 1-10 mA, בעוד רוחב הדופק ואת התדר קבועים ב 210 μs ו 40 הרץ, בהתאמה. קבע את סף המנוע על ידי הגדלה איטית של משרעת הגירוי עד לנקודת הגישה הראשונה.
    6. הבחינו בין נוירונים מוטוריים בירי מושהה ומיידי באמצעות הזרקת זרם דה-פולריזציה של 5 שניות סביב בסיס הריאו במצב מהדק זרם10,11,12. נוירונים מוטוריים יורים מיידית: בסיס נמוך יכול לגרום לירי מיידי וחוזר ונשנה עם תדירות ירי יציבה; נוירונים מוטוריים של ירי מושהה: בסיס גבוה יכול לגרום להתחלה מאוחרת של ירי חוזר עם קצב ירי מואץ (איור 3).
    7. כאשר SCS כבוי, המשך לתעד את פוטנציאל הממברנה ללכידת הירי הספונטני של נקודות גישה.
    8. בצע הקלטות מהדק מתח הקלטות מהדק מתח עבור זרם פוסט-סינפטי מעורר (EPSC) כאשר SCS מופעל וכבוי. פרמטר הגירוי הוא סף מנוע 1x, 210 μs, 2 הרץ.

תוצאות

הודות לתחזוקה הקפדנית בטמפרטורה נמוכה במהלך הפעולה העדינה (איור משלים 1, איור משלים 2 ואיור 1), יכולת הקיום של התא הייתה טובה מספיק כדי לבצע רישומים אלקטרופיזיולוגיים עוקבים. כדי לדמות את התרחיש הקליני ככל האפשר, השתמשנו במיקרומניפולציה כדי למקם את הקתודה והאנודה ש...

Discussion

מידע התנועה המווסת על ידי SCS מתכנס לבסוף לנוירונים המוטוריים. לכן, לקיחת הנוירונים המוטוריים כיעד המחקר עשויה לפשט את תכנון המחקר ולחשוף את מנגנון הנוירומודולציה של SCS באופן ישיר יותר. כדי לתעד בו זמנית מאפייני גירוי מגוונים ותגובות תאיות, מהדק טלאי הוא שיטה טובה לחקור את המאפיינים האלקטר?...

Disclosures

ללא

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין לחוקרים צעירים (52207254 ו-82301657) והקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (2022M711833).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Adenosine 5’-triphosphate magnesium saltSigmaA9187
Ascorbic AcidSigmaA4034
CaCl2·2H2OSigmaC5080
Choline ChlorideSigmaC7527
Cover slide tweezersVETUS36A-SAClip a slice
D-GlucoseSigmaG8270
EGTASigmaE4378
Fine scissorsRWD Life ScienceS12006-10Cut the diaphragm
Fluorescence Light SourceOlympus U-HGLGPS
Fluoro-GoldFluorochromeFluorochromeLabel the motor neuron
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrateSigmaG8877
HEPESSigmaH3375
infrared CCD cameraDage-MTIIR-1000E
KClSigmaP5405
K-gluconateSigmaP1847
Low melting point agaroseSigmaA9414
MgSO4·7H2OSigmaM2773
Micromanipulator Sutter Instrument MP-200
Micropipette pullerSutter instrumentP1000
Micro-scissors Jinzhongwa1020Laminectomy
Microscope for anatomyOlympus SZX10
Microscope for ecletrophysiologyOlympus BX51WI
Micro-toothed tweezersRWD Life ScienceF11008-09Lift the cut vertebral body
NaClSigmaS5886
NaH2PO4SigmaS8282
NaHCO3SigmaV900182
Na-PhosphocreatineSigmaP7936
Objective lens for ecletrophysiologyOlympus LUMPLFLN60XWworking distance 2 mm 
Osmometer Advanced FISKE 210
Patch-clamp amplifier Axon Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizerAxon Digidata 1550B
pH meter Mettler Toledo FE28
Slice AnchorMultichannel systemSHD-27H
Spinal cord stimulatiorPINST901
Toothed tweezerRWD Life ScienceF13030-10Lift the xiphoid
VibratomeLeicaVT1200S
Wide band ultraviolet excitation filterOlympus U-MF2

References

  1. Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
  2. Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
  3. Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
  4. Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
  5. Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
  6. Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
  7. Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
  8. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  9. Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525 (2016).
  10. Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385 (2021).
  11. Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586 (2018).
  12. Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046 (2014).
  13. Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
  14. Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696 (2020).
  15. Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
  16. Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
  17. Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917 (2022).
  18. Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
  19. Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358 (2022).
  20. Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
  21. Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312 (2012).
  22. Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
  23. Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
  24. Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
  25. Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
  26. Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
  27. Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
  28. Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Ex Vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved