脊髄刺激時の運動ニューロンにおける全細胞パッチクランプ記録のための脊髄スライスの ex vivo 調製

要約

このプロトコルは研究者が脊髄を分け、細胞生存率を同時に維持することの彼らの技術を改善するのを助けることができる高い時空間決断の脊髄の刺激(SCS)への運動ニューロンの電気応答を調査するのにパッチ・クランプを使用して方法を記述する。

要約

脊髄刺激(SCS)は、脊髄損傷(SCI)後の自発運動機能を効果的に回復させることができます。運動ニューロンは感覚運動行動を実行する最後のユニットであるため、SCSによる運動ニューロンの電気的応答を直接研究することは、脊髄運動調節の根底にあるロジックを理解するのに役立ちます。多様な刺激特性と細胞応答を同時に記録するには、パッチクランプが単一細胞スケールで電気生理学的特性を研究するのに適した方法です。しかし、この目標を達成するには、細胞の生存率を維持すること、脊髄を骨構造から迅速に分離すること、SCSを使用して活動電位をうまく誘導することなど、まだいくつかの複雑な困難があります。本稿では、運動ニューロンのSCSに対する電気的応答を高い時空間分解能で研究し、脊髄の分離と細胞生存率の維持を同時に行う技術を向上させ、運動ニューロン上のSCSの電気的メカニズムを円滑に研究し、無駄な試行錯誤を避けるための詳細なプロトコールを提示する。

概要

脊髄刺激(SCS)は、脊髄損傷(SCI)後の自発運動機能を効果的に回復させることができます。Andreas Rowaldらは、SCSが下肢の自発運動と体幹機能を1日で可能にすることを報告しました¹。自発運動回復のためのSCSの生物学的メカニズムを探ることは、より正確なSCS戦略を開発するための重要かつトレンドの研究分野です。例えば、Grégoire Courtineのチームは、脊髄の興奮性Vsx2介在ニューロンとHoxa10ニューロンがSCSに応答する重要なニューロンであり、細胞特異的なニューロモデュレーションがSCI²後のラットの歩行能力を回復するために実行可能であることを実証しました。しかし、単一細胞スケールでのSCSの電気的メカニズムに焦点を当てた研究はほとんどありません。古典的なイ^{カ実験3,4,5}では、閾値超の直流刺激が活動電位(AP)を誘発できることはよく知られていますが、SCSなどのパルス交流電気刺激が運動信号の生成にどのように影響するかはまだ不明です。

脊髄内神経回路の複雑さを考えると、SCSの電気的メカニズムを調べるためには、細胞集団の適切な選択が重要です。SCSは固有受容経路⁶を活性化することによって運動機能を回復させるが、運動ニューロンは、固有受容感覚情報の求心性入力⁷の統合から導かれる運動指令を実行する最後の単位である。したがって、SCSで運動ニューロンの電気的特性を直接研究することは、脊髄運動調節の根底にある論理を理解するのに役立ちます。

周知のように、パッチクランプは、極めて高い時空間分解能を有する細胞電気生理学的記録のゴールデンスタンダードな方法^である8。そこで、本研究では、SCSに対する運動ニューロンの電気的応答を研究するためにパッチクランプを用いて方法を検討する。脳パッチクランプ⁹と比較して、脊髄パッチクランプは、以下の理由により、より困難である:(1)脊髄は、より優れた細胞生存率を得るために、非常に細かいマイクロマニピュレーションと厳密な氷冷メンテナンスを必要とする、小さな体積の脊柱管によって保護されている。(2)脊髄は細すぎて切断トレイに固定できないため、低融点アガロースに浸漬し、固化後にトリミングする必要があります。

したがって、この方法は、脊髄を解剖し、同時に細胞の生存率を維持するための技術的な詳細を提供し、運動ニューロン上のSCSの電気的メカニズムをスムーズに研究し、不必要な試行錯誤を回避します。

プロトコル

施設動物実験委員会は、すべての動物実験を承認し、研究は関連する動物福祉規則に従って実施されました。

1.動物の調製

1. 動物
   1. 住居情報:特定の病原体のない環境での雄のSprague-Dawleyラット(出生後10〜14日、P10〜P14)を飼育します。
      注:室内条件は20°C±2°C、湿度:50%〜60%、12時間の明暗サイクルで維持されました。動物は食べ物と水を自由に入手できました。
   2. 運動ニューロンを逆行性に標識する:フルオロゴールド(FG)を両側脛骨筋前部および腓腹筋に注射して(滅菌生理食塩水で2%、筋肉あたり50μL)、犠牲の2日前に運動ニューロンを逆行性標識します。
2. ソリューション
   1. 切断液を調製する:120 mM 塩化コリン、2.6 mM KCl、26 mM NaHCO 3、1.25 mM NaH 2 PO₄、0.5 mM CaCl 2、7 mM MgCl₂、_1.3 mM アスコルビン酸、15 mM グルコースを混合します。解剖およびスライスの前に、95% O 2および5% CO₂で溶液を30分間プレバブル化します(KOHでpH 7.4に調整します)。砕いた氷で溶液を冷やします。
   2. 人工脳脊髄液(ACSF)の調製:126 mM NaCl、3 mM KCl、1.2 mM NaH₂PO4を混合します。1.3 mM MgCl 2、2.4 mM CaCl₂、26 mM NaHCO₃、および 10 mM グルコース。インキュベーションの前に、溶液を95%O 2および5%CO₂で30分間プレバブル化します。
   3. 細胞内溶液の調製:126 mM K-グルコン酸、2 mM KCl、2 mM MgCl 2、0.2 mM EGTA、10 mM HEPES、4 mM Na 2 ATP、0.4 mM Na₂GTP、10 mM K-クレアチン、および0.5%ニューロビオチン(pH 7.25および305 mOsm/Kg)を混合します。砕いた氷で溶液を冷やします。
   4. 低融点アガロースゲルの調製:4gのアガロースを100mLの切断液に溶解し、磁気攪拌ローターを使用して完全に溶解します。包埋の30分前に、低融点アガロースを電子レンジで高出力で1分間加熱した後、39°Cのウォーターバスに移して液体状態を維持します。
3. 装置の準備
   1. 灌流の10分前に砕いた氷を灌流トレイ(補足図1A)に置きます。解剖学的トレイ(補足図1B)とカッティングトレイ(補足図1C)を水バンドで-80°Cで一晩前置きます。
   2. ナイロンメッシュのインキュベーションチャンバーを45°Cのオーブンに一晩入れておきます。
   3. 低融点アガロースを使用して、35°の傾斜と厚さ2mmのプラットフォームをプレハブします(補足図1D)。ゲルが固まったら、35mmのシャーレの中央に置き、次の手順で脊髄を支えます。
4. 心臓内灌流
   1. 腹腔内注射により、ラットに2.5%トリブロモエタノール(160 μL / 10 g)を麻酔します。.足の指を軽くつまむなどの外部刺激に反応しないことを確認して、ラットが完全に麻酔されていることを確認します。
   2. 適切な麻酔が確認されたら、ラットを仰臥位に置き、シリカゲルで満たされたペトリ皿に固定します。
   3. 剣状突起まで5mmの縦方向の皮膚切開を尾側に切り、皮下空間を完全に広げます。腹側正中線に沿って2cmの縦方向の皮膚切開を切り、上記の切開から胸の上部まで、胸壁の外側を完全に露出させます。
   4. 歯付きピンセットを使用して剣状骨を持ち上げ( 補足図2A)、次に細いハサミを使用して横隔膜を切断します。剣状突起の両側に沿って胸骨を切断して胸を開き、心臓を露出させます(補足図2B)。
      注意: 両側の胸部内血管を保存するように注意してください。そうしないと、大量の出血を引き起こす可能性があります。
   5. 歯のないピンセットを使用して左心室を持ち上げます。22Gの針を左心室の縦軸に沿って左心室の頂点に挿入します(補足図2C)。その間、灌流チューブ内のリズミカルな血液脈動を観察したり、針が右心室に穿刺したりして、灌流効果が低下する可能性があります。
      注意: 歯付きピンセットは使用しないでください。そうしないと、ピンセット保持部位から余分な血液漏れを引き起こす可能性があります。
   6. 細いハサミで右心房を切断し(補足図2C)、100mLの氷冷灌流液を1分以内に約2mL/sの速度で手動で注入します。
      注:ラットの肝臓と足が青白くなり、右心房から血液が流れ出ない場合、良好な灌流を達成できます。
5. 脊髄解剖(図1)
   1. ラットを腹臥位に置き、上前腸骨棘(L4椎レベル程度)と胸柱の湾曲シフトポイント(約T6椎レベル)でそれぞれ脊椎を切断します(図1A)。次に、分離された脊椎をすぐに酸素化された氷冷灌流溶液に入れて、残留血液と脂肪組織を洗い流します。この手順は、後続の手順で手術野を清潔に保つのに役立ちます。
      注:傍脊髄筋は、昆虫ピンを使用して脊椎を固定するための予備となる必要があります。
   2. 隔離された脊椎をすぐに解剖学的トレイ(図1B)に移し、背側を上にして、吻側の端をオペレーターに近づけます。解剖学的トレイに50 mLの連続酸素化氷冷切断液を充填します(図1B)。
   3. 4本の昆虫ピンを使用して、傍脊髄筋を貫通して脊椎を固定します(図1B)。
   4. 解剖顕微鏡下で、両側の椎弓根を吻側端からマイクロハサミで切断し、「椎弓切除術」と呼ぶことができます(図1C)。脊髄を傷つけないように注意してください。その間、マイクロ歯ピンセットを使用して、切断した椎体を持ち上げます。
   5. 椎弓切除術後、すぐに脊髄を脊柱管から分離しないでください。代わりに、マイクロハサミを使用して、細胞と酸素化されたACSFの間の栄養取り込みを助長する背側正中線に沿って硬膜を切断します(図1D)。
      注意: 硬膜は絶対に引き裂かないでください。硬膜をマイクロハサミで切断することのみが許可されています。そうしないと、神経根と脊椎実質が深刻な損傷を受けます!
   6. 脊髄の吻側部分を持ち上げ、神経根を約1mm確保して慎重に切断します(図1E)。脊髄を脊柱管から分離した後、2本の昆虫ピンを使用して腹側を上にして脊髄を固定します(図1F)。
   7. マイクロハサミを使用して、腹側正中線に沿って硬膜を切断します(図1F)。余分な神経根を約1mmの予備で切り取ります。
      注:神経は脊髄よりもはるかに粘り強いです。予備神経根が長すぎる(>1mm)と、ビブラトームが神経根を切断できず、脊椎実質に深刻な裂傷が生じる可能性があります。
   8. マイクロハサミを使用して、腰椎の拡大を6〜7 mmの長さに分離します(図1G)。
6. 低融点アガロースへの包埋
   1. 腰椎拡大を35°の斜面(図1H)に置き、背側を上にして尾端を下にします。吸収性の濾紙を使用して、組織表面に付着した豊富な水分を取り除きます(図1H)。
   2. 溶融したアガロースゲルを、腰椎肥大の入ったシャーレにゆっくりと注ぎます(図1I)。
      注意: 注ぎすぎると、ゲルに気泡が溜まります。
   3. 上記のシャーレを氷水混合物に入れて、できるだけ早くゲルを冷却すると、細胞の活性を維持するのに役立ちます。
   4. ゲルを15 mm x 10 mm x 10 mmの立方体にトリミングし、瞬間接着剤で試料ディスクに取り付けます(図1J)。
7. スライス
   1. 試料ディスクを凍結済みのカッティングトレイに置き、氷冷したカッティング溶液を注ぎます(図1K)。95%CO2と5%_O2でカッティングトレイに連続的に泡立てます。
   2. ビブラトームパラメータを設定します:厚さ:350μm;速度:0.14-0.16 mm / s、振幅:1.0 mm、振動周波数:85 Hz。
   3. 動物ごとに2〜3枚の適切なスライスを収穫します。スライスごとに1〜2個の健康なFG +運動ニューロンを記録し、動物あたり5〜6個の細胞の範囲で記録します。
8. 潜伏
   1. カバースライドピンセットを使用してスライスをクリップし(図1L)、連続的に酸素化されたACSFで満たされたインキュベーションチャンバーに入れます。インキュベーションチャンバーを32°Cのウォーターバスに30分間入れ、室温(RT)でさらに30分間インキュベートしてから記録します。
      注:麻酔から最初のスライスの取得までの上記の手順は、細胞の生存率を可能な限り維持するために、20〜30分以内に完了する必要があります。各スライスの運動ニューロンは、約6〜7時間生存率を維持できます。

2. SCSによるパッチクランプ記録(図2)

1. 準備
   1. 記録チャンバーに連続的にバブリングしたACSFを約1〜2 mL / minの速度で灌流します。ペリスタルティックポンプのコントロールパネルから流量を個別に調整します。
   2. スライスを記録チャンバーに入れます。ナイロン糸の入ったU字型のプラチナワイヤーを使用して、スライスを所定の位置にしっかりと固定します。
   3. 赤外微分干渉コントラスト顕微鏡(IR-DIC)を使用してスライスを観察します。4倍の対物レンズの下で、背根の長さが約1mmであることを確認します。背根が実質に入る領域を見つけて、中心視野をこの領域に移動します。
   4. パルス発生器をカスタムメイドの電極に接続します(図2A)。
2. SCS の構成
   1. マイクロマニピュレーションシステムを介して背側正中線の近くにSCSのアノードを配置します(図2B)。
   2. マイクロマニピュレーションシステムを介して、SCSの陰極を背根エントリゾーン(DREZ)の近くに配置します(図2B)。
3. 細胞のターゲティングとイメージング
   1. 10倍の対物レンズを備えたIR-DICを使用して、ほとんどの運動ニューロンが位置する運動柱の背外側領域を大まかに見つけます。次に、中心視野をこの領域に移動します。
   2. 60倍の対物レンズに切り替えて、滑らかで明るい表面と目に見えない核を持つ健康なニューロンを見つけます(図2C、F)。
   3. IR強度を少し下げて、蛍光光源をオンにします。光フィルターを広帯域紫外励起フィルター(図2D、G)に切り替えて、適切なFG陽性(FG+)運動ニューロンを選択します(図2E、H)。
   4. 吸引電極を使用して、背根に1倍の運動閾値刺激を加えます。運動ニューロンに誘発活動電位が検出された場合(補足図3)、後根の活動が損なわれていないことが確認されます。そうでない場合は、このスライスを破棄する必要があります。
4. パッチクランプ録音
   1. マイクロピペットに細胞内溶液を充填し、電極ホルダーに挿入します。マイクロマニピュレーションシステムを使用して、ピペットをACSF槽に下げます。ピペット抵抗は5〜8MΩの範囲です。
   2. ピペットに少量の陽圧を加えて、ほこりや細胞の破片を吹き飛ばします。
      1. 電極を下げてセルに近づきます。ピペットがFG+ニューロンの表面に触れると、先端のレベルで膜の小さなくぼみが見えるようになります。陽圧を解放します。
      2. 次に、シリンジを使用してピペットに少量の陰圧を加えます。これにより、少量の吸引力が発生し、細胞膜がガラスピペットに接触します。抵抗値がギガオーム(>1 GΩ)に増加するまで、ソフトウェアインターフェイスの総抵抗に常に注意してください。そして、ギガシールが形成される。
   3. 膜電位を-70mVにクランプし、アンプのソフトウェアインターフェースにある高速静電容量補償ボタンを押します。過渡的に陰圧を静かに加えて細胞膜を破裂させ、アンプのソフトウェアインターフェースにある 低速静電容量補正 ボタンを押します。この時点で、良好なセル全体の構成が得られます。
   4. ソフトウェアインターフェースのICボタンをクリックして電流クランプモードに切り替え、静止膜電位(RMP)を記録します。
   5. SCSを1〜2秒間、振幅1〜10mAで印加し、パルス幅と周波数はそれぞれ210μsと40Hzに固定します。最初のAPが観察されるまで刺激振幅をゆっくりと増加させることにより、モーターの閾値を決定します。
   6. 電流クランプモード^10、11、12でレオベースの周りに5秒の脱分極電流注入を使用して、遅延発火と即時発火の運動ニューロンを区別します。即時発火運動ニューロン:低レオベースは、安定した発火頻度で即時かつ反復的な発火を誘発する可能性があります。発火の遅れた運動ニューロン:レオベースが高いと、発火速度が加速する反復発火の遅延発症を誘発する可能性があります(図3)。
   7. SCS をオフにした場合、自発的な AP の発火を捕捉するための膜電位を記録し続けます。
   8. SCSがオン/オフのときに、興奮性シナプス後電流(EPSC)の電圧クランプ記録を実行します。刺激パラメータは、1xモーター閾値、210μs、2Hzです。

結果

微細な操作中の厳格な低温維持(補足図1、補足図2、および図1)のおかげで、細胞生存率はその後の電気生理学的記録を実行するのに十分良好でした。臨床シナリオを可能な限りシミュレートするために、マイクロマニピュレーションを使用して、SCS陰極と陽極をそれぞれ背側正中線とDREZの近くに配置し(図2)、後角の神経信号を開始し?...

ディスカッション

SCSによって変調された運動情報は、最終的に運動ニューロンに収束されます。したがって、運動ニューロンを研究対象とすることで、研究デザインが簡素化され、SCSの神経調節メカニズムがより直接的に明らかになる可能性があります。多様な刺激特性と細胞応答を同時に記録するには、パッチクランプが単一細胞スケールで電気生理学的特性を研究するのに適した方法です。しかし、細胞?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Ascorbic Acid	Sigma	A4034
CaCl2·2H2O	Sigma	C5080
Choline Chloride	Sigma	C7527
Cover slide tweezers	VETUS	36A-SA	Clip a slice
D-Glucose	Sigma	G8270
EGTA	Sigma	E4378
Fine scissors	RWD Life Science	S12006-10	Cut the diaphragm
Fluorescence Light Source	Olympus	U-HGLGPS
Fluoro-Gold	Fluorochrome	Fluorochrome	Label the motor neuron
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma	G8877
HEPES	Sigma	H3375
infrared CCD camera	Dage-MTI	IR-1000E
KCl	Sigma	P5405
K-gluconate	Sigma	P1847
Low melting point agarose	Sigma	A9414
MgSO4·7H2O	Sigma	M2773
Micromanipulator	Sutter Instrument	MP-200
Micropipette puller	Sutter instrument	P1000
Micro-scissors	Jinzhong	wa1020	Laminectomy
Microscope for anatomy	Olympus	SZX10
Microscope for ecletrophysiology	Olympus	BX51WI
Micro-toothed tweezers	RWD Life Science	F11008-09	Lift the cut vertebral body
NaCl	Sigma	S5886
NaH2PO4	Sigma	S8282
NaHCO3	Sigma	V900182
Na-Phosphocreatine	Sigma	P7936
Objective lens for ecletrophysiology	Olympus	LUMPLFLN60XW	working distance 2 mm
Osmometer	Advanced	FISKE 210
Patch-clamp amplifier	Axon	Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizer	Axon	Digidata 1550B
pH meter	Mettler Toledo	FE28
Slice Anchor	Multichannel system	SHD-27H
Spinal cord stimulatior	PINS	T901
Toothed tweezer	RWD Life Science	F13030-10	Lift the xiphoid
Vibratome	Leica	VT1200S
Wide band ultraviolet excitation filter	Olympus	U-MF2