Método de entrenamiento de fuerza estática para ratones diabéticos tipo 2

Resumen

Este protocolo proporciona un método simple para hacer equipos de entrenamiento estáticos para ratones. El dispositivo mantiene la contracción isométrica muscular de las extremidades de los ratones para verificar el efecto de intervención del ejercicio tradicional en la diabetes tipo 2 (DM2) y proporciona una nueva terapia de ejercicio para el tratamiento clínico de la DM2.

Resumen

El tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2 (DM2) es una dificultad importante para mejorar la salud del paciente. El ejercicio es una de las principales intervenciones para la DM2. El entrenamiento de fuerza estática es una de las formas clave de los deportes tradicionales en China. La investigación muestra que el entrenamiento de fuerza estática es un método clínico eficaz para la intervención de la DM2, pero no existe un dispositivo experimental adecuado para el entrenamiento estático en ratones. Una de las dificultades para pasar de la investigación clínica a la básica es diseñar dispositivos experimentales adecuados. Con el fin de estudiar más a fondo el mecanismo de la intervención de entrenamiento estático en la DM2, en este trabajo se presenta un método sencillo para hacer un dispositivo de entrenamiento estático para ratones. Este dispositivo tiene las ventajas de una operación simple, material barato y alta viabilidad. Estudios previos realizados bajo este protocolo han demostrado que el entrenamiento estático puede reducir eficazmente los niveles de glucosa en sangre y mejorar la función mitocondrial de las células del músculo esquelético en ratones con DM2. El objetivo de la introducción de este dispositivo es promover la investigación sobre el mecanismo del ejercicio tradicional en la intervención de la DM2 y sentar las bases para la intervención cuantitativa del ejercicio.

Introducción

La diabetes mellitus tipo 2 (DM2) es una enfermedad crónica caracterizada por resistencia a la insulina y disfunción de las células β que representa una amenaza significativa^{para la salud} mundial. El ejercicio es una intervención crucial en el tratamiento de la diabetes tipo 2. Numerosos estudios han demostrado que los métodos de ejercicio tradicionales chinos, como el Tai Chi y el Ba Duan Jin, mejoran significativamente los niveles de glucosa en sangre y la calidad de vida de las personas con DM2 2,3,4,5. Para ejecutar estos movimientos, el entrenador debe mantener una posición estable del cuerpo y las articulaciones durante un período de tiempo. La posición estática se mantiene mediante la realización de contracciones musculares estáticas, lo que comúnmente se conoce como fuerza estática⁶.

Sin embargo, no se ha aclarado el mecanismo de intervención del entrenamiento de fuerza estática en la DM2. Para responder a esta pregunta, los experimentos con animales son esenciales. Durante los ejercicios isométricos, los músculos se activan, mantienen una longitud constante y alcanzan la tensión máxima de forma segura^. En experimentos con entrenamiento de fuerza estática, se requiere que el animal de prueba realice contracciones musculares isométricas y mantenga este estado de contracción muscular. Cómo implementar el entrenamiento de fuerza estática en ratones, ratas y otros animales de laboratorio se ha convertido en un gran problema en la investigación. En primer lugar, los animales luchan por obedecer órdenes y contraer sus músculos según sea necesario. En segundo lugar, es difícil para el animal mantener una posición estable bajo resistencia, y no se puede lograr el propósito de la contracción muscular isométrica. Al dejar que los animales entrenen según sea necesario, es importante abordar las preocupaciones relacionadas con el bienestar animal, como aliviar el estrés y la ansiedad, minimizar el dolor y mejorar las condiciones generales. Este protocolo pertenece a un modelo de entrenamiento estático para ratas ^8,9, y aquí presentamos un dispositivo sencillo para el entrenamiento estático de ratones. Cuando se levantan las patas traseras de los ratones, sus músculos abdominales se contraen debido al reflejo de enderezamiento, las patas delanteras agarran la barra transversal por delante y luego las extremidades delanteras y traseras se contraen contra la gravedad. Los ratones no pueden moverse después de agarrar la barra corta, lo que hace que sus músculos estén en un estado de contracción isométrica.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Medicina China de Nanjing (permiso n.º 202209A033). Se seleccionaron ratones machos C57BL/6J sanos con grado SPF, 8 semanas de edad y peso corporal de 20 ± 4 g. Los ratones se alojaron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h a una temperatura de 20-22 °C, y se mantuvo una humedad relativa del 45%-50%. Los animales comen y beben libremente.

1. Establecimiento de un modelo de ratón de DM2

1. Primero alimente a los ratones durante 1 semana con una dieta regular y deje que los ratones se adapten al nuevo entorno del centro de animales. Después de 1 semana, proporcionar una dieta alta en grasas (composición de la dieta: 20,0% manteca de cerdo, 10,0% sacarosa, 2,5% colesterol, 1,0% colágeno, 66,5% dieta convencional) durante un período de 4 semanas.
2. A partir del 1er^{día de} la^5ª semana, inyectar intraperitonealmente a los ratones una solución de estreptozotocina a una dosis de 35 mg/kg cada día durante 3 días consecutivos. Prepare 1 mL de la solución de estreptozotocina con 10 mg de estreptozotocina en polvo, con 0,1 M/L de tampón de citrato de sodio como disolvente.
   NOTA: La inyección debe completarse dentro de los 30 minutos posteriores a la preparación de la solución, y la solución debe mantenerse alejada de la luz durante su uso.
3. Medir aleatoriamente la glucosa en sangre el día 5 y el día 7 después de la administración de la primera inyección de solución de estreptozotocina. Los animales con dos niveles aleatorios de azúcar en sangre superiores a 16,7 mM/L se consideran modelos exitosos de DMT2.
4. Comience la intervención de entrenamiento el día 8 después de la primera inyección de solución de estreptozotocina.

2. Agrupamiento y tratamiento en ratones

1. Divida los ratones T2DM en un grupo modelo, un grupo de entrenamiento y un grupo de metformina utilizando el método de tabla de números aleatorios, con 6 ratones en cada grupo.
2. No realizar ninguna intervención para el grupo de modelos.
3. Muele las tabletas de metformina hasta convertirlas en polvo y disuélvelas en agua pura. Administre metformina al grupo de metformina por sonda nasogástrica a una dosis de 200 mg/kg, una vez al día, durante 3 semanas.
4. Deje que el grupo de entrenamiento haga 30 minutos de entrenamiento de fuerza estática, una vez al día, 5 días a la semana, durante 3 semanas. La capacitación se lleva a cabo de lunes a viernes por la tarde.
5. Asigne aleatoriamente 6 ratones no T2DM como grupo de control. Estos ratones no se someten a modelado ni intervención.

3. Fabricación del dispositivo de entrenamiento de fuerza estática

1. Prepara un tablero acrílico transparente de 5 mm de espesor con unas dimensiones de 20 cm x 20 cm. Utilice una pizarra transparente para observar el entrenamiento de los ratones.
2. Consigue palos de madera con un diámetro de 3 mm y un rollo de cinta adhesiva con un ancho de 1 cm. Utilice un cortador de papel para cortar dos palos de 4 cm de largo y cuatro palos de 1 cm de largo.
3. Fije dos palos, cada uno con una longitud de 1 cm, a los extremos de un palo con una longitud de 4 cm con cinta adhesiva (Figura 1A). Los palos cortos deben fijarse en el mismo lado que el palo largo.
4. Coloque el tablero transparente sobre una superficie plana y fije dos juegos de palitos cortos de 1 cm a la placa con una pistola de pegamento caliente. Asegúrese de que los palos de madera de 4 cm no entren en contacto con el tablero. Deje un espacio de 2 cm entre el palo largo y la tabla para mantener a los ratones en su lugar (Figura 1B). Deje que los dos palos largos estén alineados y paralelos, con una distancia de 6 cm entre ellos (Figura 1C).

Figura 1: Ensamble y asegure los palos al tablero transparente. (A) Pegue el palo de 1 cm a ambos extremos del palo de 4 cm. (B) Use adhesivo termofusible para conectar el palo de 1 cm de largo y el tablero transparente, y la longitud del espacio es de 2 cm. (C) Dos palos de 4 cm espaciados a 6 cm de distancia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Entrenamiento de fuerza estática en ratones

1. Corta dos trozos de hilo de lana de 15 cm de largo. Use un nudo corredizo para atar un trozo de hilo de lana en cada uno de los tobillos superiores del ratón (Figura 2A).
   NOTA: La cuerda elástica no puede fijar la postura de los ratones, y la cuerda de cáñamo desgastará los tobillos de los ratones, por lo que aquí se elige un hilo de lana inelástico pero suave.
2. Coloque el tablero horizontalmente sobre la mesa con los palos hacia arriba. Presione el mouse con cuidado entre dos palos largos, colocando la cabeza y la cola para alinearse con los espacios debajo de los palos.
3. Pasa el hilo a través del espacio al final de la hebra. Luego, ajusta el hilo hasta que los tobillos del ratón encajen perfectamente contra el borde del palo.
4. Asegure el hilo de lana con cinta adhesiva (Figura 2B). El extremo del hilo de lana debe estar asegurado, de lo contrario, el ratón trepará por la lana caída. Tira de la lana lo más fuerte posible o el ratón se liberará fácilmente.
5. Invierta el tablero transparente. Consigue 2 cajas de la misma altura (15-20 cm de alto) en cada extremo del tablero transparente. Coloca la tabla horizontalmente a una altura determinada. La caja se encuentra en cada extremo de la cabeza y la cola del ratón. Si es demasiado alto, el experimentador no podrá manejarlo fácilmente; Si es demasiado bajo, el ratón puede tocar el tablero.
6. Una vez que se voltea el tablero, el mouse cuelga boca abajo. Debido al reflejo de enderezamiento, los ratones curvan su abdomen y extienden sus extremidades delanteras para agarrar sus extremidades traseras o palos. En esta etapa, coloque un palo de 20 cm frente al mouse y guíelo con cuidado para agarrar el palo con sus extremidades delanteras. Repita el proceso hasta que el mouse se vuelva competente para agarrar el dispositivo móvil.
7. Use el palo para mover la extremidad delantera del ratón a otro palo de 4 cm en el tablero transparente. Ajuste constantemente el ángulo del palo para permitir que los ratones agarren activamente el palo estacionario de 4 cm en el tablero (Figura 2C).
8. Repita el paso anterior mientras el mouse suelta la pata delantera hasta que el mouse se agote. Después de 30 minutos, la mayoría de las ratas no pudieron levantar la parte superior del cuerpo y agarrar el palo con las extremidades delanteras.
   NOTA: Antes de implementar la intervención, es necesaria una semana de entrenamiento de habituación en ratones. La duración inicial del entrenamiento es de 10 minutos por día, que luego debe aumentarse en 5 minutos cada día hasta alcanzar un total de 30 minutos por día.
9. Después de 30 minutos de entrenamiento, suelte inmediatamente el ratón y desenrede la lana para evitar que los pies se enrojezcan e hinchen causados por el vendaje prolongado.
   1. Si aparecen lesiones cutáneas en el tobillo de los ratones después del entrenamiento, deje de entrenar a los ratones y busque atención profesional veterinaria hasta que el tobillo esté sano.
   2. Algunos ratones pueden ocasionalmente lograr liberarse a través de una lucha intensa durante el entrenamiento. Los ratones luchan cuando sus patas traseras no están firmemente fijadas. Para evitar lesiones debido a la lucha, observe a los ratones durante todo el entrenamiento. Cuando se descubra que las extremidades traseras no están firmemente fijadas o los ratones comienzan a luchar, afloje los ratones y vuelva a fijarlos.
      NOTA: Experimentos anteriores han demostrado que colgar ratones boca abajo durante 30 minutos al día, 5 días a la semana, no causa desgaste en los tobillos, siempre que se liberen a su^{debido tiempo.} Los ratones pueden aprender y acostumbrarse al entrenamiento en 1-3 sesiones.

Figura 2: Método de fijación en ratón. (A) Ate la parte superior del tobillo con un nudo corredizo. (B) El extremo de la cuerda se pasa a través del espacio y se tira con fuerza, luego se asegura con cinta adhesiva. (C) Entrenamiento de fuerza estática en ratones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

Siguiendo el protocolo anterior, las extremidades traseras del ratón se fijan y las extremidades delanteras agarran de forma autónoma la barra frontal. El estrecho rango de movimiento mantiene el mouse en una posición relativamente fija. Se puede confirmar que los músculos de los ratones se contraen tocando los músculos del abdomen y las patas. Esto es consistente con la necesidad del estado de contracción muscular isométrica en el entrenamiento de fuerza estática. El entrenamiento de ratones según el protocolo,...

Discusión

El entrenamiento de fuerza estática puede reducir la acumulación de grasa, ayudar a perder peso y aumentar el metabolismo^. Además, mejora la expresión de PGC-1α y la biogénesis mitocondrial en las células del músculo esquelético, lo que conduce a un mejor metabolismo de la glucosa en ratones con diabetes mellitus tipo 2 y una consecuente reducción de los niveles de glucosa en sangre¹¹. Para confirmar el impacto y el mecanismo del entrenamiento estático en la DM2,...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic boards			Transparent acrylic boards with 5mm thickness. The size should be larger than 20cm×20cm
Boxes			Two boxes of the same height (15~20cm)
ELISA KIT		H203-1-2	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute
Hot melt glue gun			Avoid touching the gun head to cause burns
Knives			No special requirement
Metformin tablets		1396309	Sigma
scissors			No special requirement
Sticks			Several wooden sticks with a diameter of 3mm
Streptozotocin		S0130	Sigma
Tape			No special requirement
Transmission Electron Microscope (TEM)		HT7700	HITACHI