Метод статической силовой тренировки для мышей с диабетом 2 типа

Резюме

Этот протокол обеспечивает простой метод изготовления статического тренировочного оборудования для мышей. Устройство поддерживает изометрическое сокращение мышц конечностей мышей, чтобы проверить влияние традиционных физических упражнений на сахарный диабет 2 типа (СД2) и обеспечивает новую терапию физическими упражнениями для клинического лечения СД2.

Аннотация

Лечение сахарного диабета 2 типа (СД2) является одной из основных трудностей в улучшении здоровья пациента. Физические упражнения являются одним из основных вмешательств при СД2. Статические силовые тренировки являются одной из ключевых форм традиционных видов спорта в Китае. Исследования показывают, что статическая силовая тренировка является эффективным клиническим методом вмешательства при СД2, но экспериментального устройства, подходящего для статической тренировки на мышах, не существует. Одной из трудностей при переходе от клинических к фундаментальным исследованиям является разработка соответствующих экспериментальных устройств. С целью дальнейшего изучения механизма статического обучающего вмешательства при СД2 в данной работе представлен простой метод создания статического обучающего устройства для мышей. Это устройство обладает такими преимуществами, как простота в эксплуатации, дешевый материал и высокая практичность. Предыдущие исследования, проведенные в рамках этого протокола, показали, что статические тренировки могут эффективно снижать уровень глюкозы в крови и улучшать митохондриальную функцию клеток скелетных мышц у мышей с СД2. Цель внедрения этого устройства состоит в том, чтобы способствовать исследованию механизма традиционных физических упражнений при СД2 и заложить основу для количественного вмешательства физических упражнений.

Введение

Сахарный диабет 2 типа (СД2) — хроническое заболевание, характеризующееся инсулинорезистентностью и дисфункцией β-клеток, которое представляет собой значительную угрозу для глобального здравоохранения¹. Физические упражнения являются важным вмешательством в лечение диабета 2 типа. Многочисленные исследования показали, что традиционные китайские методы физических упражнений, такие как тайцзицюань и ба дуань цзинь, значительно улучшают уровень глюкозы в крови и качество жизни у людей с СД2 2,3,4,5. Чтобы выполнить эти движения, тренер должен поддерживать устойчивое положение тела и суставов в течение определенного периода времени. Статическое положение поддерживается за счет выполнения статических сокращений мышц, которые обычно называют статической силой⁶.

Однако механизм вмешательства в статическую силовую тренировку при СД2 не был выяснен. Чтобы ответить на этот вопрос, необходимы эксперименты на животных. Во время изометрических упражнений мышцы активизируются, поддерживают постоянную длину и безопасно достигают максимального напряжения⁷. В экспериментах со статической силовой тренировкой от испытуемого животного требуется выполнение изометрических мышечных сокращений и поддержание этого состояния мышечного сокращения. Как проводить статические силовые тренировки на мышах, крысах и других лабораторных животных, стало большой проблемой в исследованиях. Во-первых, животные изо всех сил пытаются подчиняться командам и сокращать мышцы по мере необходимости. Во-вторых, животному трудно сохранять устойчивое положение при сопротивлении, а цель изометрического сокращения мышц не может быть достигнута. Позволяя животным тренироваться по мере необходимости, важно решать проблемы, связанные с благополучием животных, такие как снятие стресса и беспокойства, минимизация боли и улучшение общих условий. Этот протокол относится к модели статической тренировки крыс ^8,9, и здесь мы представляем простое устройство для статической тренировки мышей. Когда задние лапы мышей подняты, их мышцы живота сокращаются за счет выпрямляющего рефлекса, передние лапы захватывают перекладину спереди, а затем передние и задние конечности сокращаются против силы тяжести. Мыши не могут двигаться после захвата короткой перекладины, в результате чего их мышцы находятся в состоянии изометрического сокращения.

протокол

Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Нанкинского университета китайской медицины (разрешение No 202209A033). Были отобраны здоровые самцы мышей C57BL/6J с SPF-классом, возрастом 8 недель и массой тела 20 ± 4 г. Мышей содержали в 12-часовом цикле свет/темнота при температуре 20-22 °C, при этом поддерживалась относительная влажность 45-50%. Животные едят и пьют свободно.

1. Создание мышиной модели СД2

1. Сначала кормите мышей в течение 1 недели на обычном рационе и дайте им адаптироваться к новой среде животного центра. Через 1 неделю обеспечить диету с высоким содержанием жиров (состав рациона: 20,0% сала, 10,0% сахарозы, 2,5% холестерина, 1,0% холат, 66,5% обычной диеты) сроком на 4 недели.
2. С^1-го числа^5-й недели мышам внутрибрюшинно вводят раствор стрептозотоцина в дозе 35 мг/кг каждый день в течение 3 дней подряд. Приготовьте 1 мл раствора стрептозотоцина с 10 мг порошка стрептозотоцина, с 0,1 М/л буфера цитрата натрия в качестве растворителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция должна быть завершена в течение 30 минут после приготовления раствора, а во время использования раствор следует хранить вдали от света.
3. Случайным образом проверяют уровень глюкозы в крови на 5 и 7 день после первого введения раствора стрептозотоцина. Животные с двумя случайными уровнями сахара в крови выше 16,7 мМоль/л считаются успешными моделями СД2.
4. Начинайте тренировочное вмешательство на 8-й день после первого введения раствора стрептозотоцина.

2. Группировка и лечение у мышей

1. Разделите мышей с СД2 на модельную группу, тренировочную группу и группу метформина методом таблицы случайных чисел, по 6 мышей в каждой группе.
2. Не выполняйте вмешательство для модельной группы.
3. Таблетки метформина измельчить в порошок и растворить в чистой воде. Дают метформин в группу метформинов через зонд в дозе 200 мг/кг, 1 раз в сутки, в течение 3 недель.
4. Пусть тренировочная группа занимается по 30 минут статической силовой тренировки, один раз в день, 5 дней в неделю, в течение 3 недель. Тренировки проводятся с понедельника по пятницу во второй половине дня.
5. Случайным образом распределите 6 мышей без СД2 в качестве контрольной группы. Эти мыши не подвергаются моделированию и вмешательству.

3. Изготовление устройства для статической силовой тренировки

1. Подготовьте прозрачную акриловую доску толщиной 5 мм с размерами 20 см х 20 см. Используйте прозрачную доску для того, чтобы наблюдать за тренировкой мышей.
2. Приобретите деревянные палочки диаметром 3 мм и рулон скотча шириной 1 см. С помощью ножа для бумаги отрежьте две палочки длиной 4 см и четыре палочки длиной 1 см.
3. Прикрепите две палочки, каждая длиной 1 см, к концам палочки длиной 4 см с помощью ленты (рисунок 1А). Короткие палочки должны быть закреплены с той же стороны, что и длинная.
4. Положите прозрачную доску на ровную поверхность и прикрепите к тарелке два набора коротких палочек по 1 см с помощью пистолета для горячего клея. Следите за тем, чтобы деревянные палочки длиной 4 см не соприкасались с доской. Оставьте зазор в 2 см между длинной палкой и доской, чтобы удерживать мышей на месте (Рисунок 1B). Пусть две длинные палочки будут выровнены и параллельны, с расстоянием между ними 6 см (Рисунок 1C).

Рисунок 1: Соберите и закрепите палочки на прозрачной доске. (A) Прикрепите палочку длиной 1 см к обоим концам палочки диаметром 4 см. (B) Используйте термоклей для соединения палочки длиной 1 см и прозрачной доски, длина зазора составляет 2 см. (C) Две палочки по 4 см расположены на расстоянии 6 см друг от друга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

4. Статическая силовая тренировка у мышей

1. Отрежьте два куска шерстяной пряжи длиной 15 см. С помощью узла завяжите кусок шерстяной пряжи на каждой верхней лодыжке мыши (Рисунок 2А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эластичная веревка не может зафиксировать осанку мышей, а пеньковая веревка будет утомлять лодыжки мышей, поэтому здесь выбирают неэластичную, но мягкую шерстяную пряжу.
2. Поставьте доску горизонтально на стол палочками вверх. Осторожно нажмите на мышь между двумя длинными джойстиками, расположив ее голову и хвост так, чтобы они совпадали с промежутками под джойстиками.
3. Проденьте пряжу через зазор на конце хвоста. Затем отрегулируйте пряжу до тех пор, пока лодыжки мыши плотно не прилегают к краю палочки.
4. Закрепите шерстяную пряжу лентой (Рисунок 2В). Конец шерстяной пряжи должен быть закреплен, иначе мышь будет карабкаться по упавшей шерсти. Натяните шерсть как можно туже, иначе мышь легко вырвется на свободу.
5. Переверните прозрачную доску. Приобретите 2 коробки одинаковой высоты (15-20 см высотой) на обоих концах прозрачной доски. Расположите доску горизонтально на определенной высоте. Коробка расположена на обоих концах головы и хвоста мыши. Если он слишком высок, экспериментатор не сможет с ним легко справиться; Если он слишком низкий, мышь может коснуться столешницы.
6. Как только доска переворачивается, мышь висит вниз головой. Из-за рефлекса выпрямления мыши сгибают живот и вытягивают передние конечности, чтобы ухватиться за задние конечности или палки. На этом этапе расположите 20-сантиметровую палочку перед мышью и осторожно направляйте ее, чтобы захватить палочку передними конечностями. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока мышь не научится хвататься за мобильный джойстик.
7. С помощью джойстика переместите переднюю конечность мыши на другую 4-сантиметровую палочку на прозрачной доске. Постоянно регулируйте угол наклона палочки, чтобы мыши могли активно захватывать неподвижную палочку длиной 4 см на доске (рисунок 2C).
8. Повторите предыдущий шаг, когда мышь отпустит переднюю лапу, пока мышь не выдохнется. Через 30 минут большинство крыс не смогли поднять верхнюю часть тела и ухватиться за палку передними конечностями.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед проведением вмешательства необходимо провести неделю обучения мышам по привыканию. Начальная продолжительность тренировки составляет 10 минут в день, которую затем следует увеличивать на 5 минут каждый день, пока не достигнет в общей сложности 30 минут в день.
9. После 30 минут тренировки немедленно отпустите мышь и распутайте шерсть, чтобы предотвратить появление красных и опухших ног, вызванных длительным связыванием.
   1. Если после тренировки у мышей на лодыжке появились повреждения кожи, прекратите дрессировку мышей и обратитесь за ветеринарной помощью, пока лодыжка не станет здоровой.
   2. Некоторым мышам иногда удается освободиться благодаря интенсивной борьбе во время тренировок. Мыши борются, когда их задние лапы не были прочно зафиксированы. Чтобы избежать травм из-за борьбы, наблюдайте за мышами на протяжении всей тренировки. Когда обнаруживается, что задние конечности не закреплены прочно или мыши начинают бороться, ослабьте мышей и снова зафиксируйте.
      Примечание: Предыдущие эксперименты показали, что подвешивание мышей вниз головой в течение 30 минут в день, 5 дней в неделю, не вызывает износа лодыжек, при условии, что они освобождены вовремя^. Мыши могут научиться и привыкнуть к тренировке за 1-3 сеанса.

Рисунок 2: Метод фиксации у мыши. (А) Завяжите верхнюю часть лодыжки с помощью узла. (B) Конец веревки пропускается через зазор и туго натягивается, а затем фиксируется лентой. (В) Статическая силовая тренировка у мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Результаты

Следуя вышеописанному протоколу, задние конечности мыши фиксируются, а передние автономно захватывают переднюю планку. Узкий диапазон движений удерживает мышь в относительно фиксированном положении. Сокращение мышц мышей можно подтвердить, прикоснувшись к мышцам живота и ног. Это со...

Обсуждение

Статические силовые тренировки могут уменьшить накопление жира, помочь похудеть и ускорить метаболизм⁸. Кроме того, он усиливает экспрессию PGC-1α и митохондриальный биогенез в клетках скелетных мышц, что приводит к улучшению метаболизма глюкозы у мышей с сахарным диабетом ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic boards			Transparent acrylic boards with 5mm thickness. The size should be larger than 20cm×20cm
Boxes			Two boxes of the same height (15~20cm)
ELISA KIT		H203-1-2	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute
Hot melt glue gun			Avoid touching the gun head to cause burns
Knives			No special requirement
Metformin tablets		1396309	Sigma
scissors			No special requirement
Sticks			Several wooden sticks with a diameter of 3mm
Streptozotocin		S0130	Sigma
Tape			No special requirement
Transmission Electron Microscope (TEM)		HT7700	HITACHI