Microestampado: un proceso conveniente para la fabricación de microcanales en microfluídica basada en papel de nanocelulosa

Resumen

Este protocolo describe un proceso sencillo que utiliza convenientes micromoldes de plástico para operaciones simples de microestampado para fabricar microcanales en papel de celulosa nanofibrilado, logrando un ancho mínimo de 200 μm.

Resumen

El nanopapel, derivado de la celulosa nanofibrilada, ha generado un interés considerable como material prometedor para aplicaciones microfluídicas. Su atractivo radica en una gama de excelentes cualidades, que incluyen una superficie excepcionalmente lisa, una transparencia óptica excepcional, una matriz de nanofibras uniforme con porosidad a nanoescala y propiedades químicas personalizables. A pesar del rápido crecimiento de la microfluídica basada en nanopapel, las técnicas actuales utilizadas para crear microcanales en nanopapel, como la impresión 3D, el recubrimiento por pulverización o el corte y ensamblaje manual, que son cruciales para las aplicaciones prácticas, todavía poseen ciertas limitaciones, en particular la susceptibilidad a la contaminación. Además, estos métodos se limitan a la producción de canales de tamaño milimétrico. Este estudio presenta un proceso sencillo que utiliza convenientes micromoldes de plástico para operaciones simples de microestampado para fabricar microcanales en nanopapel, logrando un ancho mínimo de 200 μm. El microcanal desarrollado supera los enfoques existentes, logrando una mejora de cuatro veces, y se puede fabricar en 45 minutos. Además, se han optimizado los parámetros de fabricación y se proporciona una cómoda tabla de referencia rápida para los desarrolladores de aplicaciones. Se demostró la prueba de concepto de un mezclador laminar, un generador de gotas y dispositivos analíticos funcionales basados en nanopapel (NanoPAD) diseñados para la detección de rodamina B mediante espectroscopía Raman mejorada en superficie. En particular, los NanoPAD mostraron un rendimiento excepcional con límites de detección mejorados. Estos excelentes resultados se pueden atribuir a las propiedades ópticas superiores del nanopapel y al método de microestampado preciso recientemente desarrollado, que permite la integración y el ajuste fino de los NanoPAD.

Introducción

Recientemente, el papel de celulosa nanofibrilada (NFC) (nanopapel) ha surgido como un material de sustrato muy prometedor para diversas aplicaciones, como la electrónica flexible, los dispositivos energéticos y la biomedicina 1,2,3,4. Derivado de plantas naturales, el nanopapel es rentable, biocompatible y biodegradable, lo que lo convierte en una alternativa atractiva al papel de celulosa tradicional ^5,6. Sus propiedades excepcionales incluyen una superficie ultralisa con una rugosidad superficial inferior a 25 nm y una estructura de matriz de celulosa densa, lo que permite la creación de nanoestructuras altamente estructuradas⁷. Los abundantes grupos hidroxilo del nanopapel contribuyen a su estructura de nanocelulosa compacta y compacta⁸. El nanopapel presenta una excelente transparencia óptica y una neblina óptica mínima, lo que lo hace muy adecuado para sensores ópticos. Además, su hidrofilicidad inherente permite un flujo sin bombas, incluso con su estructura gruesa, proporcionando un movimiento autónomo del fluido ^9,10. La nanocelulosa tiene diversas aplicaciones en sensores biológicos, dispositivos electrónicos conductores, plataformas de cultivo celular, supercondensadores, baterías, entre otros, lo que demuestra su versatilidad y potencial^11,12. En particular, la nanocelulosa es prometedora para los dispositivos microfluídicos analíticos (μPAD) basados en papel, ya que ofrece ventajas únicas sobre el papel de cromatografía convencional.

En la última década, los μPADs han logrado una atención significativa debido a su asequibilidad, biocompatibilidad, funcionamiento sin bomba y facilidad de producción^13,14. Estos dispositivos se han convertido en herramientas diagnósticas eficaces en el punto de atención, especialmente en entornos de recursos limitados^15,16,17. Un avance significativo en este campo fue el desarrollo de la impresión en cera, iniciada por George Whitesides¹⁸ y el grupo Bingcheng Lin¹⁹, que permitió la creación de μPADs funcionales mediante la incorporación de microcanales en papel de cromatografía. Posteriormente, los μPADs evolucionaron rápidamente, y varias técnicas de biodetección, incluyendo los métodos electroquímicos 20, quimioluminiscencia²¹ y ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)22,23,24, se implementaron con éxito para la detección de diversos biomarcadores como las proteínas 25,26, los ADNs 27,28, los ARNs ^29,30 y los exosomas³¹. A pesar de estos logros, los μPAD aún enfrentan desafíos, incluidas las velocidades de flujo lentas y la evaporación del solvente.

Se han propuesto varios métodos para la creación de microcanales en nanopapel^32,33,34. Un enfoque implica la impresión 3D de ingredientes sacrificados en el material, pero requiere un recubrimiento hidrofóbico que limite el funcionamiento sin bomba³³. Otra técnica consiste en apilar manualmente capas de canal entre hojas de nanopapel utilizando pegamento, que requiere mucha mano de obra³². Alternativamente, el recubrimiento por pulverización de fibras de nanocelulosa en moldes premodelados puede crear microcanales, pero implica una preparación de moldes costosa y que requiere mucho tiempo³⁴. En particular, estos métodos se limitan a microcanales a escala milimétrica, lo que compromete las ventajas de los dispositivos microfluídicos en cuanto al consumo de volumen de reactivos y la integración. El desarrollo de un proceso simple de modelado de microcanales de nanopapel con resolución a escala micrométrica sigue siendo un desafío.

Este estudio presenta un método único de modelado de microcanales de nanopapel basado en el microrelieve práctico. El enfoque ofrece varias ventajas sobre los métodos existentes, ya que no requiere equipos costosos o especializados, es simple, rentable y altamente preciso. Un molde de microcanal convexo se fabrica cortando con láser una película de politetrafluoroetileno (PTFE), conocida por su inercia química y propiedades antiadherentes. Este molde se utiliza para estampar microcanales en una membrana de gel de nanopapel. Se aplica una segunda capa de gel de nanopapel en la parte superior para crear canales huecos cerrados. Utilizando esta técnica de modelado, se desarrollan dispositivos microfluídicos fundamentales en nanopapel, incluido un mezclador laminar y un generador de gotas. Además, se demuestra la fabricación de NanoPAD de microscopía Raman mejorada de superficie (SERS). La creación in situ de un sustrato SERS basado en nanopartículas de plata se logra mediante la introducción de dos reactivos químicos (AgNO₃ y NaBH₄) en los canales, lo que da como resultado un rendimiento notable con bajos límites de detección (LOD).

Protocolo

1. Proceso de micrograbado para patrones de microcanales en nanopapel

1. Preparación del molde
   NOTA: Consulte Yuan et ^al.12 para obtener detalles sobre la preparación del molde.
   1. Prepare una película de PTFE como se indica en la Tabla de Materiales.
   2. Corte con láser la película de PTFE preparada para hacer un molde de microcanal convexo (Figura 1A-I).
      NOTA: Las dimensiones del molde de PTFE determinan las dimensiones del microcanal (Figura 2E, F) en una relación de función lineal de primer orden.
2. Preparación de nanopapeles
   1. Dispersar 4,0 g de gel NFC oxidado con (2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-il)oxilo (TEMPO) (ver Tabla de Materiales) en agua destilada (concentración final de 0,1% en peso).
   2. Revuelva la suspensión fuertemente a 120,8 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente hasta que no se vea ningún flóculo de celulosa.
   3. Filtre al vacío la suspensión transparente para obtener un gel de nanopapel (Figura 1A-II).
      NOTA: En este ejemplo, el diámetro del gel de nanopapel obtenido es de 4 cm. Los NanoPAD se pueden adaptar para diversas aplicaciones mediante la selección de dispositivos de filtración por succión con diferentes radios, lo que permite el diseño de NanoPAD a diferentes escalas.
3. Estampado de gel de nanopapel
   1. Coloque el molde de PTFE en la superficie del gel de nanopapel.
   2. Estampe el gel de nanopapel (Figura 1A-III) utilizando el molde de PTFE junto a la prensa caliente durante 10 minutos cada vez bajo presión y temperatura optimizadas (Figura 2A-D).
      NOTA: Una presión de estampado más alta (250 kPa a 1000 kPa) mejora la precisión de fabricación, pero no debe exceder los 1000 kPa para evitar daños a la estructura de celulosa. Las temperaturas de estampado más altas (25-100 °C) mejoran la precisión de los microcanales al promover la deshidratación y la descarburación, pero las temperaturas no deben exceder los 75 °C para evitar las arrugas del gel y la reducción de la transmitancia de la luz⁷. En este ejemplo, los parámetros de estampación optimizados fueron de 750 kPa y 75 °C.
4. Desmoldeo
   1. Retire una capa adicional de gel de nanopapel de filtro de la membrana del filtro (Figura 1A-IV).
5. Vinculación
   1. Coloque la capa despegada encima de la capa en relieve de nanopaper gel, apilando las dos capas para crear una estructura de microcanal hueca (Figura 1A-V).
      NOTA: El enlace de hidrógeno más fuerte en el nanopapel "similar a un gel" en comparación con la suspensión de fibra y el nanopapel seco mejora el entrelazamiento y la adhesión de las fibras de nanocelulosa. En consecuencia, dos capas de nanopapel "similar a un gel" pueden unirse firmemente a través de la autodifusión sin fuerza externa.
6. Secado
   1. Coloque las dos capas de gel de nanopapel en un horno de secado a 75 °C durante aproximadamente 30 minutos (Figura 1A-VI).

2. Construcción de dispositivos microfluídicos fundamentales

1. Construcción de mezclador laminar
   1. Prepare los NanoPADs con canales rectos y curvos (Figura 3A) siguiendo el paso 1.
      NOTA: En este ejemplo, las dimensiones de los canales son de 1 mm de ancho y 50 μm de profundidad.
   2. Agregue gotas rojas y azules en las zonas de entrada simultáneamente, permitiendo el flujo a través del canal hueco automáticamente.
      NOTA: El flujo independiente exitoso de las soluciones roja y azul en un canal recto y su mezcla al final del canal curvo se puede atribuir al bajo número de Reynolds de las capas en los dispositivos microfluídicos y al flujo radial inducido por el esfuerzo cortante³⁵.
2. Construcción de un generador de gotas
   1. Prepare los NanoPAD de dos entradas con un canal de unión en T (Figura 3D) de acuerdo con el paso 1.
   2. Introducir agua y hexadecano (aceite), dos líquidos inmiscibles, en las zonas de dos entradas del canal de unión en T para generar gotas (Figura 3E).
      NOTA: En este ejemplo, las dimensiones del canal de unión en T son 1 mm de ancho, 25 mm de largo y 50 μm de profundidad.
   3. Fije la velocidad de Q 1 en 6 μL/min y la velocidad de Q₂ en n × Q 1 (n =_1-6). Use dos bombas de jeringa y ajústelas a la velocidad anterior para inyectar agua y aceite. Este comportamiento se rige por la ecuación de escala simple (que se proporciona a continuación).
      NOTA: En este ejemplo, se vertió aceite y agua coloreada en el canal³⁶.
      
      Donde α = 1, β = 1, L es la longitud, W es el ancho de la gota y Q₁ y Q₂ son los caudales de agua y hexadecano, respectivamente^37,38.

3. Crecimiento de AgNP in situ

1. Preparación de NanoPADs
   1. Prepare NanoPAD de dos entradas con una zona de detección convergente (Figura 4A) de acuerdo con el paso 1.
2. Proceso sucesivo de adsorción y reacción de la capa iónica
   1. Prepare una solución de AgNO₃ de 20 mM y una solución de NaBH₄ de 20 mM (ver Tabla de Materiales).
   2. Deje caer 5 μL de la solución de AgNO₃ de 20 mM en la zona de entrada izquierda del canal de flujo.
   3. Deje que la solución de AgNO₃ permanezca en la zona de reacción durante 30 s.
      NOTA: Repita los pasos 3.2.2. y 3.2.3. cinco veces para asegurar la distribución uniforme de AgNPs sin aglomeración, lo que podría explicar la mayor intensidad de banda.
   4. Deje caer 5 μL de agua destilada en la zona de entrada izquierda del canal de flujo para enjuagar.
      NOTA: Repita el paso 3.2.4. tres veces para garantizar la eliminación del exceso de iones Ag no adsorbidos mediante el lavado.
   5. Agregue 5 μL de la solución de NaBH₄ de 20 mM a la zona de entrada derecha del canal de flujo.
      NOTA: Repita el paso 3.2.5. hasta que los AgNPs se generen uniformemente en la zona de reacción. Las reacciones químicas implicadas en el paso 3 se representan mediante la siguiente fórmula³⁹:
      
      
      En este ejemplo, se formaron matrices de AgNP densas, uniformes y bien estructuradas en los NanoPADs (Figura 4B). El diámetro promedio de los AgNPs fue de 55 nm (Figura 4C).

4. Medición del SERS

1. Preparación del sistema de espectroscopía Raman
   1. Encienda el láser e inicie el software que lo acompaña para el espectrómetro Raman (consulte la Tabla de materiales).
   2. Emplee un objetivo de 50x para enfocar y recopilar señales Raman y un láser de 532 nm para la excitación.
   3. Ajuste la resolución espectral a 2 ^cm-1 para una medición precisa. Ajuste el rango de medición del espectro Raman de 400 cm-1 a 600 ^cm-1.
   4. Calibra el espectrómetro Raman con una oblea de silicio¹².
      NOTA: Realice el paso 4.1. para el paso 4.2.
2. Medición de rodamina B (RhB)
   1. Disuelva 4,7 mg de RhB (ver Tabla de materiales) en 10 mL de etanol para preparar una solución de RhB de 1 mM.
   2. Prepare una serie de soluciones de RhB con concentraciones que oscilan entre 10 μM y 0,1 pM diluyendo la solución de RhB de 1 mM en el etanol.
   3. Añadir 5 μL de la solución de RhB en la zona de entrada del canal NanoPADs y dejar secar.
      NOTA: Repita el paso 4.2.3. para soluciones de RhB de diferentes concentraciones indicadas en el paso 4.2.2.
   4. Ajuste el tiempo de excitación a 10 s, la rejilla a 2 cm⁻¹ y el número de ciclos a 1. Establezca el rango de medición del espectro Raman de 500 cm-1 a 1800 ^cm-1.
   5. Ajuste el tornillo de enfoque grueso y el tornillo de enfoque fino individualmente para lograr un enfoque adecuado, luego haga clic en detener para guardar la posición.
   6. Haga clic en iniciar para comenzar la medición.
   7. Repita las mediciones siete veces y guarde los datos recopilados.
   8. Apague el láser.
3. Análisis de datos
   1. Importe los datos guardados en el software de análisis de datos (véase Tabla de materiales).
   2. Calcule el espectro medio a partir de los datos guardados.
   3. Seleccione la opción de borrador de línea para trazar espectros Raman.
   4. Utilice la herramienta Analizador de picos para establecer la línea de base de los espectros.
   5. Aplique el proceso de señal - Función de suavizado para suavizar los espectros y obtener resultados finales.

Resultados

Se ha ideado un método único para crear patrones de microcanales en nanopapel utilizando los prácticos micromoldes de plástico a través de la conveniente técnica de microestampado. En particular, este método logra patrones de microcanales a una escala tan pequeña como 200 μm, lo que representa una mejora de cuatro veces en comparación con los métodos existentes^32,33,34. Después de ajustar los parámetros de patrones,...

Discusión

El objetivo principal de este estudio es desarrollar un método simple para fabricar microcanales en nanopapel. Se ideó una técnica de estampado eficiente utilizando PTFE como molde para abordar este desafío¹². Al optimizar la temperatura y la presión de estampado, se llevaron a cabo una serie de experimentos para establecer un proceso de fabricación confiable para los NanoPAD. Además, se demostró el uso de una tabla de referencia rápida para ajustar las aplicaciones de los NanoPADs en dif...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AgNO3	Hushi (Shanghai, China)	7761-88-8	>99%
Ethanol	Hushi (Shanghai, China)	64-17-5	>99%
Hexadecane	Macklin (Shanghai, China)	544-76-3	>99%
LabSpec software	Horiba (Japan)	LabSpec5
Melamine	Macklin (Shanghai, China)	108-78-1	>99%
NaBH4	Aladdin (Shanghai, China)	16940-66-2	>99%
Origin lab software	OriginLab (USA)
Polyethylene terephthalate (PET)	Myers Industries (Akron, USA)
Polytetrafluoroethylene films	Shenzhen Huashenglong plastic material Co., Ltd. (Shenzhen, China)		Teflon film
PVDF filter membrane	EMD Millipore Corporation (USA)	VVLP04700	pore size: 0.1 μm
Raman spectrometer	Horiba (Japan)	Xplo RA
Rhodamine B	Macklin (Shanghai, China)	81-88-9	>95%
Scanning electron microscopy (SEM)	FEI(USA)	Scios 2 HiVac
Silicon wafer	Horiba (Japan)		diameter: 5 mm
TEMPO-oxidized NFC slurry	Tianjin University of Science and Technology		1.0 wt% solid, carboxylate level 2.0 mmol/g solid, average nanofiber diameter: 10 nm