Laringoscopia murina mínimamente invasiva para obtener imágenes de cerca del movimiento laríngeo durante la respiración y la deglución

Resumen

Este protocolo describe un enfoque de laringoscopia transoral seriada para ratones y ratas que permite obtener imágenes de video de cerca y sin obstrucciones de la laringe durante la respiración y la deglución utilizando un régimen anestésico optimizado y técnicas de manipulación endoscópica finamente ajustadas.

Resumen

La laringe es un órgano esencial en los mamíferos con tres funciones principales: respirar, tragar y vocalizar. Se sabe que una amplia gama de trastornos afectan la función laríngea, lo que provoca dificultad para respirar (disnea), deterioro de la deglución (disfagia) y/o deterioro de la voz (disfonía). La disfagia, en particular, puede provocar neumonía por aspiración y morbilidad asociada, hospitalización recurrente y mortalidad prematura. A pesar de estas graves consecuencias, los tratamientos existentes para la disfunción laríngea se dirigen en gran medida a intervenciones quirúrgicas y conductuales que, por desgracia, no suelen restaurar la función laríngea normal, lo que pone de manifiesto la necesidad urgente de soluciones innovadoras.

Para cerrar esta brecha, hemos estado desarrollando un enfoque endoscópico experimental para investigar la disfunción laríngea en modelos murinos (es decir, ratón y rata). Sin embargo, la endoscopia en roedores es bastante desafiante debido a su pequeño tamaño en relación con la tecnología actual de endoscopios, las diferencias anatómicas en la vía aérea superior y la necesidad de anestesia para acceder de manera óptima a la laringe. Aquí, describimos un nuevo enfoque de laringoscopia transoral que permite obtener imágenes de video en primer plano y sin obstrucciones del movimiento laríngeo en ratones y ratas. Los pasos críticos en el protocolo incluyen el manejo preciso de la anestesia (para evitar una sobredosis que suprima la deglución y/o corra el riesgo de mortalidad relacionada con la dificultad respiratoria) y el control del endoscopio con micromanipulador (para la grabación de video estable del movimiento laríngeo por un solo investigador para su posterior cuantificación).

Es importante destacar que el protocolo se puede realizar a lo largo del tiempo en los mismos animales para estudiar el impacto de diversas condiciones patológicas específicamente en la función laríngea. Una ventaja novedosa de este protocolo es la capacidad de visualizar la protección de las vías respiratorias durante la deglución, lo que no es posible en los humanos debido a la inversión epiglótica sobre la entrada laríngea que obstruye la glotis de la vista. Por lo tanto, los roedores brindan una oportunidad única para investigar específicamente los mecanismos de protección de las vías respiratorias laríngeas normales frente a las patológicas con el propósito final de descubrir tratamientos para restaurar eficazmente la función laríngea normal.

Introducción

La laringe es un órgano cartilaginoso ubicado en la intersección de los tractos respiratorio y digestivo en la garganta, donde funciona como un mecanismo de válvulas para controlar con precisión el flujo y la dirección del aire (es decir, durante la respiración y la vocalización) frente a los alimentos y líquidos (es decir, durante la deglución). Se sabe que una amplia gama de trastornos afectan a la laringe, incluidos los congénitos (por ejemplo, laringomalacia, estenosis subglótica), neoplásicos (por ejemplo, papilomatosis laríngea, carcinoma de células escamosas), neurológicos (por ejemplo, parálisis laríngea idiopática, accidente cerebrovascular, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica) e iatrogénicos (por ejemplo, lesiones inadvertidas durante una cirugía de cabeza o cuello). Independientemente de la etiología, la disfunción laríngea suele dar lugar a una tríada de síntomas de disnea (dificultad para respirar), disfonía (alteración de la voz) y disfagia (alteración de la deglución) que repercuten negativamente en el bienestar económico y social de la persona 1,2,3,4.

Además, la disfagia, particularmente en individuos médicamente frágiles, puede conducir a neumonía por aspiración (debido a que los alimentos o líquidos se escapan a través de una laringe incompletamente cerrada hacia los pulmones) y morbilidad asociada, hospitalización recurrente y mortalidad precoz ^5,6. A pesar de estas graves consecuencias, los tratamientos existentes para la disfunción laríngea se dirigen en gran medida a intervenciones quirúrgicas y conductuales que normalmente no restauran la función laríngea normal 1,2,7,8,9,10, lo que pone de manifiesto la necesidad urgente de soluciones innovadoras. Con este objetivo, hemos estado desarrollando un enfoque endoscópico experimental para investigar la disfunción laríngea en modelos murinos (es decir, ratón y rata).

En medicina humana, el estándar de oro para la evaluación de la disfunción laríngea es la visualización endoscópica, denominada laringoscopia ^11,12. Por lo general, se pasa un endoscopio flexible a través de la nariz para examinar la laringe, particularmente las cuerdas vocales y las estructuras laríngeas supraglóticas y subglóticas adyacentes. También se puede utilizar un endoscopio rígido para visualizar la laringe a través de la cavidad oral. Cualquiera de los dos enfoques permite el examen macroscópico de la anatomía laríngea y puede utilizarse para evaluar la movilidad y la función laríngea durante la respiración, la fonación y una variedad de reflejos protectores de las vías respiratorias, como la tos y el reflejo del aductor laríngeo 13,14,15,16. Sin embargo, durante la deglución, la laringe queda completamente oscurecida por la epiglotis a medida que se invierte para cubrir la entrada laríngea, protegiéndola del camino del bolo alimenticio/líquido que se traga. Como resultado, la visualización directa del movimiento laríngeo durante la deglución no es posible en humanos y, por lo tanto, debe inferirse indirectamente utilizando otros enfoques de diagnóstico (por ejemplo, fluoroscopia, electromiografía, electroglottografía).

Este artículo describe un innovador protocolo de laringoscopia para ratones y ratas que permite obtener imágenes de cerca y sin obstrucciones de la respiración y la protección de las vías respiratorias durante la deglución bajo anestesia ligera. El protocolo es compatible con una variedad de sistemas de endoscopia disponibles en el mercado en combinación con una plataforma personalizada para inmovilizar al roedor anestesiado durante todo el procedimiento. Es importante destacar que son posibles numerosos diseños/configuraciones de plataformas endoscópicas, dependiendo de los recursos disponibles y la agenda de investigación de cada laboratorio. Nuestra intención aquí es proporcionar orientación para que los investigadores la consideren en el contexto de su investigación. Además, nuestro objetivo es demostrar cómo este protocolo de laringoscopia puede conducir a una gran cantidad de datos objetivos que pueden generar nuevos conocimientos sobre nuestra comprensión de la disfunción laríngea y la regeneración.

El efecto combinado de todos los pasos descritos en este protocolo de laringoscopia murina da como resultado un examen mínimamente invasivo de la laringe murina adulta que se puede repetir en los mismos animales para detectar y caracterizar la disfunción laríngea a lo largo del tiempo en respuesta a una lesión iatrogénica, progresión de la enfermedad y/o intervención de tratamiento en relación con la protección de las vías respiratorias. Cabe destacar que este protocolo no evalúa la función laríngea relacionada con la vocalización.

Protocolo

El protocolo de laringoscopia murina sigue un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés) y las pautas de los Institutos Nacionales de Salud (NIH, por sus siglas en inglés). Fue desarrollado para su uso con más de 100 ratones C57BL/6J adultos y más de 50 ratas Sprague Dawley adultas, de sexos aproximadamente iguales y de 6 semanas a 12 meses de edad para ambas especies. Es necesario el desarrollo de protocolos adicionales para la adaptación a roedores más jóvenes/pequeños. Los animales se alojaron en grupos (hasta cuatro ratones o dos ratas por jaula, según el sexo y la camada). Las condiciones estándar del vivero incluían jaulas estáticas con una regulación estricta de la temperatura ambiente (20-26 °C), la humedad (30%-70%) y un ciclo de luz estándar de 12 h. Todos los animales recibieron materiales de enriquecimiento frescos (p. ej., cabaña/pipa, golosinas dentales, polluelos) en los cambios semanales de jaula. Se proporcionó acceso ilimitado a alimentos y agua, excepto durante una restricción de alimentos corta (hasta 4-6 h) antes de la anestesia, como se describe a continuación. El personal veterinario y de investigación monitoreaba a los animales todos los días.

1. Anestesia animal que no suprime la deglución

1. Use equipo de protección personal adecuado (p. ej., guantes, mascarilla) para minimizar la exposición a alérgenos mientras trabaja con roedores.
2. Restrinja la alimentación de cada jaula de roedores hasta 4-6 horas antes de la anestesia para minimizar la retención de comida en la cavidad oral y la faringe, lo que puede interferir con la visualización endoscópica y/o provocar la aspiración de alimentos durante el procedimiento.
   NOTA: La retención de alimentos en la cavidad bucal es un hallazgo normal en roedores sin disfagia si no han sido restringidos por alimentos.
3. Preparar una "estación de calentamiento" para la inducción/recuperación de los animales.
   1. Precaliente una almohadilla térmica que circula con agua a 37 °C sobre una superficie de sobremesa.
   2. Seleccione jaulas de inducción/recuperación del tamaño adecuado para las especies que se están probando. Por ejemplo, las jaulas de cajas de zapatos para ratones con tapas superiores con filtro tienen el tamaño adecuado para la inducción/recuperación de ratones y ratas. Utilice una jaula de inducción/recuperación nueva para cada animal que se esté sometiendo a pruebas; Utilice una sola jaula como jaula de inducción y recuperación para el mismo animal.
   3. Cubra el piso de la jaula de inducción/recuperación con una capa ligera de material absorbente (por ejemplo, virutas de álamo, toalla de papel, almohadilla para cachorros) para calentar y absorber las secreciones corporales durante la inducción y recuperación de la anestesia.
   4. Coloque las jaulas preparadas (con tapas superiores de filtro) completamente sobre la almohadilla térmica durante 30-60 minutos antes de la inducción de la anestesia.
      NOTA: Este microambiente proporciona suficiente calor suplementario para promover un metabolismo estable de la anestesia durante la inducción y la recuperación.
4. Coloque la jaula del animal a mitad de camino sobre la almohadilla térmica precalentada a 37 °C durante aproximadamente 30 minutos antes de la inducción de la anestesia.
   NOTA: Proporcionar calor suplementario antes del procedimiento puede acelerar la inducción de la anestesia y prevenir una sobredosis accidental debido al metabolismo lento o retrasado de la anestesia debido a la hipotermia.
5. Prepare la anestesia con ketamina-xilacina (KX) según la especie y el peso corporal.
   1. Para ratones: Una mezcla de 90 mg/kg de ketamina y 11 mg/kg de xilacina es suficiente para la laringoscopia transoral en ratones adultos de fondo C57BL/6 de ambos sexos. Ajuste las dosis para otras cepas de ratones y edades.
   2. Para ratas: Una mezcla de 60 mg/kg de ketamina y 6 mg/kg de xilacina es suficiente para la laringoscopia transoral en ratas Sprague Dawley adultas de ambos sexos. Ajuste las dosis para otras cepas y edades de ratas.
6. Precaliente los agentes anestésicos llenos de jeringa en la estación de calentamiento a 37 °C para evitar la pérdida de calor en los animales que se produce al inyectar líquidos fríos.
7. Inyecte al roedor la dosis KX calculada utilizando una jeringa (p. ej., 1 mL) y una aguja (p. ej., 26 G1/2) del tamaño adecuado.
   1. Para ratones: Administrar una sola inyección subcutánea (SC).
      NOTA: En nuestra experiencia, las inyecciones de SC en ratones reducen/suprimen la mortalidad relacionada con la anestesia en comparación con las inyecciones intraperitoneales (IP).
   2. Para ratas: Administrar una sola inyección SC o IP. Si se prefiere, sedar ratas con isoflurano (ISO) (3-5%) en una cámara de inducción inmediatamente antes de la inyección de KX.
      NOTA: El movimiento espontáneo del cuerpo puede reanudarse durante un breve período (generalmente <1 minuto) hasta que el KX haga efecto.
8. Administrar glicopirrolato (agente anticolinérgico) inmediatamente después de la inyección de KX para reducir el exceso de secreciones salivales que pueden dificultar la visualización de la laringe durante la endoscopia transoral y/o obstruir mecánicamente la vía aérea superior durante la recuperación de la anestesia.
   NOTA: La dosis y la vía de administración son idénticas para ratones y ratas (0,01-0,02 mg/kg SC), y el efecto es casi inmediato y dura varias horas.
9. Después de la inyección de glicopirrolato, coloque el roedor anestesiado en la jaula de inducción precalentada en la estación de calentamiento y cubra la jaula con un paño quirúrgico para proporcionar un ambiente oscuro que minimice la estimulación visual durante 10 minutos, sin molestias.
   1. Finalice el procedimiento si el roedor permanece ambulatorio 10 minutos después de la dosis inicial de KX.
      NOTA: Los intentos de proporcionar anestesia adicional (ya sea mantenimiento con KX o ketamina) probablemente serán inútiles.
10. Después de 10 minutos, administre una dosis de mantenimiento de ketamina (1/4 de la dosis inicial si los reflejos de las extremidades posteriores están disminuidos o 1/2 de la dosis inicial si los reflejos de las extremidades posteriores son enérgicos; SC para ratones y SC/IP para ratas) para mantener la anestesia.
11. Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos para prevenir la sequedad de la córnea y el trauma asociado durante el procedimiento de laringoscopia.
12. Transfiera el roedor anestesiado a una plataforma endoscópica personalizada para comenzar el procedimiento de laringoscopia.
    NOTA: Diseñamos nuestra plataforma de endoscopia (Figura 1) para que tenga múltiples funcionalidades para su uso con una variedad de enfoques quirúrgicos y electrofisiológicos en roedores que no necesariamente requieren endoscopia. Como tal, está sobreconstruido para uso puramente endoscópico. Cuando sea relevante, destacaremos las características/componentes que son esenciales para este protocolo de laringoscopia.
13. A partir de este momento, verifique los reflejos de las extremidades traseras cada 15-20 minutos durante todo el procedimiento y proporcione dosis adicionales de mantenimiento de ketamina según sea necesario, espaciadas al menos 20 minutos. Como este es un procedimiento relativamente corto (generalmente <45 min bajo anestesia), rara vez se requiere ketamina adicional después de la dosis de mantenimiento inicial.

2. Paso transoral del endoscopio para visualizar la laringe

1. Antes de anestesiar al animal, prepare un endoscopio de tamaño adecuado con capacidad de grabación de video.
   NOTA: Utilizamos habitualmente un otoscopio de cero grados con un diámetro de eje de 1,9 mm y una longitud de eje de 10 cm con una funda metálica personalizada (Figura 2), que es el endoscopio representativo utilizado en todo este protocolo.
   1. Conecte el endoscopio a una fuente de luz y a un sistema de grabación endoscópica para visualizarlo y grabarlo en vídeo en tiempo real a un mínimo de 30 fotogramas por segundo (fps).
   2. Enfoque y balance de blancos de la cámara para obtener una calidad de imagen óptima.
   3. Conecte el endoscopio a un micromanipulador.
      NOTA: Para el seguimiento del movimiento laríngeo, aseguramos el endoscopio a un micromanipulador en la plataforma de endoscopia para permitir un control preciso del endoscopio para una captura de video estable.
2. Asegure al roedor en decúbito dorsal en una plataforma climatizada. Estabilice e inmovilice la cabeza asegurándola con barras para los oídos.
   1. Asegúrese de que la cabeza del roedor pueda girar libremente hacia arriba o hacia abajo (pero no de lado a lado) en las barras de los oídos sin salirse. Este grado de libertad facilita la inserción transoral y el avance del endoscopio para llegar a la laringe.
3. Si se desea un registro electrofisiológico sincrónico de la respiración, la deglución y la coordinación de la deglución-respiración durante la endoscopia, se proceda a la aplicación de sensores adecuados para este fin (Figura 3).
   1. Fije un sensor respiratorio al abdomen en la línea media, inmediatamente caudal a la apófisis xifoidea, utilizando cinta quirúrgica.
   2. Afeitar y limpiar/desinfectar la piel con una toallita con alcohol antes de insertar los electrodos de la aguja para prevenir infecciones.
   3. Use una aguja de 22 G para perforar una pequeña abertura a través de la piel antes de insertar el electrodo de aguja para evitar daños en la aguja de electromiografía (EMG).
   4. Inserte un electrodo de aguja EMG concéntrico estéril (p. ej., 25 mm x 0,3 mm/30 G) a través de la piel submentoniana en la línea media hasta la base de la lengua (p. ej., músculo geniogloso o geniohioideo, dependiendo de la profundidad de inserción de la aguja).
   5. Inserte un electrodo de tierra (por ejemplo, acero inoxidable de 27 G) por vía subcutánea en la cadera (a ambos lados).
   6. Conecte el sensor respiratorio y los electrodos de aguja EMG a un sistema de registro de electrofisiología (por ejemplo, bioamplificador y sistema de adquisición de datos con captura de video síncrona) y verifique las señales de electrofisiología limpias en ambos canales antes de continuar.
   7. Envuelva los sitios de conexión de los electrodos con papel de aluminio para protegerlos contra el ruido eléctrico y mejorar la relación señal-ruido en los registros electrofisiológicos correspondientes.
   8. Ajuste la ubicación del sensor respiratorio y la profundidad del electrodo de la aguja EMG según sea necesario para obtener señales electrofisiológicas limpias en ambos canales. Para seguir este protocolo, utilice una frecuencia de muestreo de 1k para la respiración y una frecuencia de muestreo de 20k y un filtro de paso de banda (por ejemplo, 150-3.000 Hz) para EMG.
4. Cubra el torso del roedor (y el sensor respiratorio) con una manta transparente para facilitar la termorregulación y permitir la visualización del movimiento abdominal durante la respiración. Deje las extremidades traseras y la parte inferior del abdomen expuestas libremente para acceder a ellas durante los controles de reflejos y la redosis de mantenimiento de ketamina. Asegúrese de que la manta no restrinja el movimiento abdominal durante la respiración.
5. Continuar con la endoscopia transoral (Figura 4).
   1. Abra la boca del roedor insertando un aplicador cónico con punta de algodón detrás de los incisivos centrales, perpendicular a la mandíbula. Gire el hisopo de algodón en la superficie dorsal de la lengua para que sobresalga ligeramente de la boca.
6. Con un ligero agarre con el dedo, tire suavemente de la lengua ligeramente fuera de la boca hacia un lado de los incisivos centrales mientras inserta la punta del endoscopio en la cavidad oral (Figura 4A, B).
   1. Encienda la fuente de luz después de insertar la punta del endoscopio en la boca para evitar dañar potencialmente los ojos del roedor.
   2. Inserte el endoscopio lateral a los incisivos en el mismo lado que la lengua retraída. Los incisivos centrales impiden que el endoscopio se inserte en la línea media, por lo que es necesario este abordaje de inserción lateral.
7. Poner en marcha los sistemas de registro de endoscopia (y electrofisiología). Registre continuamente a lo largo de todo el procedimiento para garantizar datos suficientes para el análisis post hoc o registre en momentos seleccionados, según las necesidades del estudio.
8. Avance con cuidado el endoscopio para visualizar la orofaringe, teniendo cuidado de no raspar el paladar duro ni aplicar una presión excesiva sobre la lengua que pueda causar lesiones.
   1. Elimine cualquier partícula de comida visible y/o el exceso de secreciones salivales con un hisopo del tamaño adecuado (por ejemplo, un microcepillo de 1,5 mm) para minimizar el riesgo de aspiración a medida que avanza el procedimiento.
   2. Continúe avanzando/ajustando la posición del endoscopio hasta que la hipofaringe esté centrada dentro del campo de visión del monitor y se identifiquen las estructuras anatómicas clave (Figura 4C). En este punto, todas las estructuras deben aparecer anatómicamente alineadas/simétricas dentro del campo de visión de la cámara; De lo contrario, vuelva a colocar el endoscopio según sea necesario.
   3. Esté atento al movimiento evocado de la mandíbula/lengua durante el avance del endoscopio. Si está ausente, proceda sin volver a dosificar la ketamina. Si está presente, administre una segunda dosis de mantenimiento de ketamina (1/4 a 1/2 de la dosis inicial de ketamina) y espere aproximadamente 5 minutos para que haga efecto antes de continuar. Vuelva a administrar la dosis solo si han pasado al menos 20 minutos desde la inyección anterior para evitar la sedación excesiva y la abolición de la deglución.
   4. Examine la lengua del roedor cada 5 minutos durante todo el procedimiento para ver si hay decoloración oscurecida, que es indicativa de isquemia. Para evitar esto, vuelva a colocar el endoscopio según sea necesario.
9. Aplique una ligera presión sobre el velo con una microsonda (por ejemplo, una espátula de metal) insertada junto al endoscopio para desacoplar el paladar blando y la epiglotis para visualizar la laringe a distancia (Figura 4D). Evite utilizar la punta del endoscopio para desacoplarla, ya que la presión aplicada puede causar daños en los tejidos blandos o doblar/dañar permanentemente el eje del endoscopio.
   NOTA: A diferencia de los humanos, la laringe murina no es directamente visible desde una perspectiva transoral. En cambio, la epiglotis queda atrapada mecánicamente debajo de una membrana mucosa que recubre el velo, lo que da lugar a la formación de un espacio hipofaríngeo sin salida. La aplicación de una ligera presión sobre el velo libera la epiglotis de la membrana velar para dar una vista parcial de la laringe.
10. Observe si hay golondrinas evocadas durante el desacoplamiento del velo y la epiglotis.
    1. Identifique las degluciones como desplazamientos bruscos y breves de la lengua posterior hacia el paladar duro. Este movimiento generalmente ocurre en sincronía con un breve movimiento/depresión mandibular, lo que proporciona un sustituto para la identificación de la deglución cuando la lengua posterior no es fácilmente visible en el campo de visión del endoscopio.
    2. También identifique las degluciones a través de la actividad de ruptura de EMG de la lengua junto con breves episodios de apnea en el registro electrofisiológico, ambos ocurriendo en sincronía con los eventos de cierre glótico en el video endoscópico.
       1. En el caso de deglución rápida y repetitiva indicativa de anestesia insuficiente (es decir, demasiado ligera), vuelva a dosificar y espere ~ 5-10 minutos antes de continuar. Espere al menos 20 minutos después de la inyección de mantenimiento de ketamina anterior para evitar la sobresedación y la abolición de la deglución.
       2. Considere que la profundidad anestésica es óptima cuando solo se evocan unas pocas degluciones durante el desacoplamiento velar-epiglótico.
       3. Si se suprime la deglución, la anestesia es demasiado profunda para evaluar la protección de las vías respiratorias laríngeas. En este caso, espere de 5 a 10 minutos para el metabolismo de la ketamina antes de continuar con la visualización de cerca de la laringe.

3. Grabación de video en primer plano, sin obstrucciones, del movimiento laríngeo durante la respiración y la deglución evocada

NOTA: El registro electrofisiológico sincrónico de la respiración, la deglución y la coordinación de la deglución y la respiración también es una opción.

1. Avance lentamente el endoscopio entre el velo y la epiglotis mientras mantiene la laringe en el centro del campo de visión (Figura 5A-C).
   NOTA: La punta del endoscopio pasará fácilmente a través de la abertura velar-epiglótica sin fuerza. De lo contrario, aborte el procedimiento para evitar posibles daños al animal. Es posible visualizar la laringe a distancia, con la punta del endoscopio en la hipofaringe. Sin embargo, este enfoque generalmente requiere la retracción manual de la epiglotis, el velo y/o la lengua para mejorar la visualización de la laringe. Sin embargo, partes de la laringe suelen permanecer ocultas a la vista, y los dispositivos de retracción pueden restringir el movimiento laríngeo, lo que puede confundirse con una disfunción.
2. Continúe avanzando el endoscopio para obtener una vista cercana sin obstrucciones de todas las dimensiones ventral-dorsal y lateral de la laringe en un solo campo de visión (Figura 5C).
   NOTA: La comisura ventral puede estar obstruida por la epiglotis, particularmente en ratones más jóvenes/pequeños. En estos casos, intentar manipular de manera más agresiva la punta del endoscopio para visualizar la comisura ventral puede restringir el movimiento laríngeo, lo que puede confundirse con una disfunción. También puede bloquear el flujo de aire laríngeo, lo que resulta en asfixia.
3. Observe el movimiento oscilatorio de la laringe a medida que el roedor inhala (ensanchamiento glotal) y exhala (estrechamiento glotal) durante cada ciclo respiratorio.
   NOTA: La velocidad y la magnitud del movimiento laríngeo/glotal pueden variar con la profundidad del anestésico; Sin embargo, un espacio glotal (es decir, el espacio de aire entre los aritenoides izquierdo/derecho y las cuerdas vocales) generalmente permanece visible durante todo el ciclo respiratorio en roedores sanos.
   1. Si se observa un estrechamiento glótico marcado, ajuste la posición del endoscopio para garantizar un flujo de aire sin obstrucciones a través de las vías respiratorias superiores. Por ejemplo, evite aplicar presión sobre el velo, lo que puede causar la obstrucción de los tejidos blandos de las vías respiratorias nasales. También evite insertar la punta del endoscopio en el espacio glotal, ya que puede bloquear el flujo de aire laríngeo y provocar asfixia. Si en casos raros, la respiración cesa, realice varias compresiones torácicas del esternón medio (con un dedo) o ventilación con presión positiva (usando una "bolsa de reanimación" en miniatura) después de retirar el endoscopio.
4. Grabación de vídeo del movimiento respiratorio laríngeo durante 30-60 s con fines de evaluación post hoc.
5. Con la laringe aún a la vista de cerca, ajuste ligeramente la punta del endoscopio dentro de la entrada laríngea para aplicar estimulación mecánica a la mucosa que recubre el velo y/o la epiglotis, y evocar la deglución en roedores anestesiados de manera óptima.
   1. Utilice ajustes de micronivel de la punta del endoscopio (es decir, ~ 1 mm en cualquier dirección) para evitar lesiones en la mucosa y/o obstrucción de las vías respiratorias.
   2. Esté atento a las degluciones evocadas, que pueden identificarse fácilmente como eventos de cierre glótico abrupto que ocurren en sincronía con depresión visible de la mandíbula, actividad de estallido de EMG de la lengua y apnea breve (<1/2 s) que es visible en el rastro respiratorio.
      NOTA: Pueden ocurrir eventos de cierre glótico sin movimiento simultáneo de la mandíbula; Sin embargo, el cierre glótico suele ser incompleto en estos casos. Sospechamos que pueden tratarse de otros reflejos protectores de las vías respiratorias (p. ej., reflejo del aductor laríngeo) que surgen a medida que el efecto de la anestesia comienza a desaparecer; sin embargo, son ocurrencias raras o inconsistentes que requieren una investigación más profunda.
   3. Repita hasta que se evoquen de 5 a 10 golondrinas y se grabe un video por animal. Si se suprime la deglución, retire el endoscopio y espere de 5 a 10 minutos a que se produzca el metabolismo de la ketamina antes de continuar.
6. Retraiga con cuidado, pero no retire, el endoscopio en la orofaringe y centre la hipofaringe en el campo de visión para visualizar la epiglotis y el velo.
7. Vuelva a acoplar el velo y la epiglotis para reanudar la respiración nasal mediante el uso de un microhisopo para aplicar una ligera presión contra la base de la lengua para evocar la deglución y el reatrapamiento de la epiglotis debajo de la membrana velar. Si el reacoplamiento no ocurre en unos pocos intentos, proceda con la recuperación de la anestesia sin reacoplamiento para evitar el riesgo de lesión laríngea.
8. Detenga el registro de la endoscopia (y la electrofisiología).
9. Use un hisopo de algodón empapado en solución salina para humedecer la lengua y los incisivos centrales y devolver la lengua a su posición anatómica dentro de la cavidad oral.
10. Separe las barras de los oídos y retire la sonda de temperatura, el sensor respiratorio y los electrodos EMG del roedor para continuar con la recuperación de la anestesia.

4. Recuperación de la anestesia

1. Coloque al animal en una jaula de recuperación precalentada (es decir, igual que la jaula de inducción) en la "estación de calentamiento" para recuperarse de la anestesia.
2. Vuelva a aplicar el lubricante para ojos para evitar que se seque.
3. Administrar solución salina tibia SC para la hidratación de líquidos: hasta 5 mL para ratas y hasta 0,5 mL para ratones.
4. Administrar atipamezol SC para revertir la xilacina y aumentar el impulso respiratorio: 1-2 mg/kg para ratas y ratones.
   1. Comience con 2 mg/kg de atipamezol, seguido inmediatamente por la estimulación manual a lo largo de la espalda y el estómago del roedor para acelerar la recuperación.
      NOTA: Con este enfoque, el movimiento espontáneo de la cabeza generalmente comienza dentro de 1-3 minutos. Sin embargo, el retorno al estado ambulatorio suele tardar un promedio de 2 h (entre 1 h y 5 h) después de la laringoscopia bajo anestesia KX, debido a las diferencias individuales.
   2. Proporcionar atipamezol adicional en dosis de 1 mg/kg (al menos 15 minutos después de la primera inyección) si el movimiento espontáneo del cuerpo está disminuyendo en lugar de aumentar dentro de los primeros 15-30 minutos de la recuperación de la anestesia, a pesar de proporcionar estimulación manual frecuente.
   3. Proceda con la administración de doxapram (5 mg/kg IP para ratas y ratones) si la actividad espontánea continúa disminuyendo. Vuelva a dosificar con este agente de "rescate de emergencia" a intervalos de 10 a 15 minutos (hasta cinco dosis) hasta que surja un movimiento espontáneo. Si los roedores permanecen moribundos, eutanasia a los animales utilizando métodos de eutanasia aprobados (por ejemplo, una sobredosis de ketamina seguida de un método secundario como la decapitación).
5. Vigile de cerca a los roedores en recuperación a intervalos de 15 a 20 minutos para detectar cambios adversos en el estado respiratorio, la movilidad y la termorregulación y proporcionar intervención según sea necesario (p. ej., estimulación manual, oxígeno suplementario, manta térmica, inyecciones de atipamezol o doxapram). Proporcionar un monitoreo más frecuente de los roedores que requieren intervención.
   1. Proporcione oxígeno suplementario (p. ej., 1-2 L/min en una cámara de inducción calentada, sin ISO) durante intervalos de 10 minutos, según sea necesario para roedores con tiempos prolongados de recuperación de la anestesia KX. Alternativamente, aplique estimulación frecuente a lo largo de las superficies dorsal y ventral del animal para normalizar los niveles de SpO₂ (>94%).
   2. Coloque a los compañeros de jaula en recuperación en la misma jaula de recuperación (hasta dos roedores por jaula) para promover una mayor actividad espontánea y una recuperación más rápida.
6. Regrese los roedores a su jaula doméstica calentada cuando puedan moverse espontáneamente alrededor de la jaula de recuperación.
   1. Regrese la botella estándar de comida y agua a la jaula de la casa. No proporcione adaptaciones especiales para el acceso a alimentos/agua mientras el efecto de la anestesia aún está desapareciendo para minimizar el riesgo de asfixia/aspiración.
   2. Observe la actividad de la jaula en casa y retire cualquier obstáculo que impida la deambulación (por ejemplo, cabaña, tubería de PVC).
   3. Coloque la jaula de casa medio encendida y mitad alejada de la estación de calentamiento durante las próximas 12-16 h (es decir, toda la noche).
      NOTA: La interrupción temprana del calor suplementario puede provocar la mortalidad debido a la hipotermia.
7. Realice controles de salud estándar a la mañana siguiente. Regrese a los animales con la reanudación de la actividad normal/inicial, las funciones corporales (p. ej., termorreguladores, comer, beber, orinar, defecar) y el peso estable (es decir, mantener o aumentar) a las condiciones estándar del vivero con un monitoreo de salud diario de rutina. En el raro caso de que los roedores hayan disminuido la actividad, las funciones corporales o el peso corporal, continúe con el calor suplementario durante otro día.
   NOTA: Para las ratas, es común que la tinción de porfirina aparezca repentinamente alrededor de ambos ojos ~ 3-6 h en el período de recuperación de la anestesia. La tinción suele resolverse en 24 horas.

5. Cuantificación objetiva del movimiento laríngeo durante la respiración frente a la deglución

1. Utilice un software de edición de vídeo con una función de análisis fotograma a fotograma para ver los vídeos de endoscopia.
   1. Identifique al menos un episodio representativo de 10 a 20 s de respiración espontánea por animal.
   2. Identifique de 3 a 5 eventos representativos de deglución por animal.
   3. Asegúrese de que los episodios/eventos de respiración y deglución seleccionados cumplan con los siguientes criterios de análisis: la laringe centrada en el campo de visión de la cámara con todas las estructuras/bordes laríngeos visibles (es decir, no oscurecidos por el vévulo, la epiglotis o el exceso de secreciones salivales), suficiente iluminación (es decir, capaz de ver todas las estructuras/bordes laríngeos) y sin artefacto de movimiento de la cámara (es decir, el endoscopio no se mueve).
2. Analizar los episodios/eventos de respiración y deglución identificados utilizando enfoques subjetivos y/u objetivos.
   1. Para el análisis subjetivo: Utilice una escala Likert para puntuar subjetivamente el movimiento laríngeo durante la visualización en tiempo real y fotograma a fotograma utilizando un software de edición de vídeo. Para seguir este protocolo, utilice una escala de Likert ampliada que vaya de -2 a +2, donde los valores negativos indican el movimiento laríngeo en la dirección opuesta a la esperada. Estimación de la protección de la vía aérea laríngea durante la deglución, donde 0 = ninguna reducción en el tamaño del espacio glotal (es decir, sin protección de la vía aérea laríngea), 1 = cierta reducción del espacio glotal (es decir, protección incompleta de la vía aérea) y 2 = aducción completa de los aritenoides, con solo un pequeño espacio glotal ventral entre las cuerdas vocales (es decir, protección completa de la vía aérea), con valores negativos que indican movimiento laríngeo paradójico.
      NOTA: Una escala de Likert que va de 0 a 2 se usa comúnmente en estudios con roedores, donde 0 = sin movimiento, 1 = algo de movimiento y 2 = movimiento normal 17,18,19,20,21,22. Sin embargo, esta escala no tiene en cuenta el movimiento laríngeo paradójico que a menudo ocurre después de una lesión recurrente del nervio laríngeo (RLN)¹⁰.
   2. Para el análisis objetivo: Identifique cuatro fotogramas clave de vídeo: 1) el fotograma de reposo que precede directamente al inicio de la aducción laríngea (es decir, el fotograma antes de que las cuerdas vocales se aducyan), 2) el fotograma en el que las cuerdas vocales han completado la aducción, 3) el fotograma inmediatamente anterior a la abducción de las cuerdas vocales (esto puede superponerse con el #2), y 4) el fotograma en el que las cuerdas vocales han abducido completamente y vuelven a una posición de reposo para reanudar la respiración. Utilice la marca de tiempo de estos cuatro fotogramas clave para calcular la duración de la aducción de las cuerdas vocales (fotograma 1 a fotograma 2), el cierre glótico (fotograma 2 al fotograma 3), la abducción de las cuerdas vocales (fotograma 3 a fotograma 4) y la duración total de la deglución (fotograma 1 a fotograma 4). Alternativamente, utilice otro software comercial existente²³ para medir el ángulo glotal (es decir, entre los aritenoides dorsalmente o las cuerdas vocales ventralmente) durante la abducción máxima y la aducción máxima utilizando imágenes fijas 17,18,24. Hacer que al menos dos revisores capacitados realicen este proceso de forma independiente y ciega, identificar discrepancias entre los revisores y llegar a un consenso conjunto para cada discrepancia.
      NOTA: Anteriormente realizamos este análisis manual fotograma a fotograma de los eventos de tiempo de cierre glótico (es decir, durante los reflejos protectores de las vías respiratorias) utilizando software comercial de edición de video en roedores y humanos¹⁴. Sin embargo, este enfoque es ineficiente y solo proporciona una cuantificación limitada de la dinámica del movimiento laríngeo. Actualmente utilizamos software de seguimiento laríngeo propio para realizar una cuantificación objetiva más extensa del movimiento laríngeo durante la respiración y los reflejos protectores de las vías respiratorias 22,25,26,27,28,29,30. El software cuenta con capacidad de seguimiento automatizado fotograma a fotograma para la cuantificación objetiva del movimiento, la distancia (amplitud) y el tiempo (frecuencia) del movimiento laríngeo del lado izquierdo frente al derecho. Utilizamos estos parámetros para derivar una variedad de mediciones basadas en el movimiento para detectar/cuantificar la disfunción laríngea (p. ej., ángulo glotal máximo/mínimo/rango, simetría del movimiento laríngeo y sincronía) durante la respiración, la deglución y otros reflejos protectores de las vías respiratorias (p. ej., reflejo del aductor laríngeo). Este software aún está en proceso de perfeccionamiento y aún no está disponible comercialmente/públicamente.

Resultados

El uso exitoso de este protocolo de laringoscopia murina da como resultado la visualización de cerca de la laringe durante la respiración espontánea y la deglución evocada en condiciones saludables y de enfermedad, como se muestra en la Figura 6. Además, este protocolo puede repetirse varias veces en los mismos roedores para permitir la investigación de la función/disfunción laríngea a lo largo del tiempo. Como se muestra en la ...

Discusión

Hemos desarrollado con éxito un protocolo de laringoscopia murino específico replicable que permite la visualización de cerca del movimiento laríngeo durante la respiración y la deglución. Es importante destacar que el protocolo se puede realizar a lo largo del tiempo en los mismos animales para estudiar el impacto de diversas condiciones patológicas específicamente en la función laríngea. Este protocolo se desarrolló durante la última década y ha sufrido modificaciones sust...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atipamezole	Zoetis	Antisedan; 5 mg/mL	Parsippany-Troy Hills, NJ
Bioamplifier	Warner Instrument Corp.	DP-304	Hamden, CT
Concentric EMG needle electrode	Chalgren Enterprises, Inc.	231-025-24TP; 25 mm x 0.3 mm/30 G	Gilroy, CA
Cotton tipped applicator (tapered)	Puritan Medical Products	REF 25-826 5W	Guilford, ME
Data Acquisition System	ADInstruments	PowerLab 8/30	Colorado Springs, CO
DC Temperature Control System - for endoscopy platform	FHC, Inc.	40-90-8D	Bowdoin, ME
Electrophysiology recording software	ADInstruments	LabChart 8 with video capture module	Colorado Springs, CO
Endoscope monitor	Karl Storz Endoscopy-America	Storz Tele Pack X monitor	El Segundo, CA
Glycopyrrolate	Piramal Critical Care	NDC 66794-204-02; 0.2 mg/mL	Bethlehem, PA
Ground electrode	Consolidated Neuro Supply, Inc.	27 gauge stainless steel, #S43-438	Loveland, OH
Isoflurane induction chamber	Braintree Scientific, Inc.	Gas Anesthetizing Box - Red	Braintree, MA
Ketamine hydrochloride	Covetrus North America	NDC 11695-0703-1, 100 mg/mL	Dublin, OH
Metal spatula to decouple epiglottis and velum	Fine Science Tools	Item No. 10091-12;	Foster City, CA
Micro-brush to remove food/secretions from oral cavity	Safeco Dental Supply	REF 285-0023, 1.5 mm	Buffalo Grove, IL
Mouse-size heating pad for endoscopy platform	FHC, Inc.	40-90-2-07 – 5 x 12.5 cm Heating Pad	Bowdoin, ME
Ophthalmic ointment (sterile)	Allergan, Inc.	Refresh Lacri-lube	Irvine, CA
Otoscope	Karl Storz	REF 1232AA	El Segundo, CA
Pneumogram Sensor	BIOPAC Systems, Inc.	RX110	Goleta, CA
Pulse oximetry - Vetcorder Pro Veterinary Monitor	Sentier HC, LLC	Part No. 710-1750	Waukesha, WI
Rat-size heating pad for endoscopy platform	FHC, Inc.	40-90-2 – 12.5X25cm Heating Pad	Bowdoin, ME
Sterile needles for drug injections	Becton, Dickinson and Company	REF 305110, 26 G x 3/8 inch, PrecisionGlide	Franklin Lakes, NJ
Sterile syringes for drug injections	Becton, Dickinson and Company	REF 309628; 1 mL, Luer-Lok tip	Franklin Lakes, NJ
Surgical drape to cover induction cage for dark environment	Covidien LP	Argyle Surgical Drape Material, Single Ply	Minneapolis, MN
Surgical tape to secure pneumograph sensor to abdomen	3M Health Care	#1527-0, 1/2 inch	St. Paul, MN
Transparent blanket for thermoregulation	The Glad Products Company	Press’n Seal Cling Film	Oakland, CA
Video editing software	Pinnacle Systems, Inc.	Pinnacle Studio, v24	Mountain View, CA
Water circulating heating pad - for anesthesia induction/recovery station	Adroit Medical Systems	HTP-1500 Heat Therapy Pump	Loudon, TN
Xylazine	Vet One	NDC 13985-701-10; Anased, 100 mg/mL	Boise, ID