Laringoscopia murina minimamente invasiva para imagens de perto do movimento laríngeo durante a respiração e a deglutição

Resumo

Este protocolo descreve uma abordagem de laringoscopia transoral em série para camundongos e ratos que permite imagens de vídeo em close-up e desobstruídas da laringe durante a respiração e deglutição usando um regime anestésico otimizado e técnicas de manipulação endoscópica finamente ajustadas.

Resumo

A laringe é um órgão essencial em mamíferos com três funções principais - respiração, deglutição e vocalização. Sabe-se que uma ampla gama de distúrbios prejudica a função laríngea, o que resulta em dificuldade para respirar (dispneia), comprometimento da deglutição (disfagia) e/ou comprometimento da voz (disfonia). A disfagia, em particular, pode levar à pneumonia aspirativa e morbidade associada, hospitalização recorrente e mortalidade precoce. Apesar dessas graves consequências, os tratamentos existentes para a disfunção laríngea são amplamente voltados para intervenções cirúrgicas e comportamentais que, infelizmente, normalmente não restauram a função laríngea normal, destacando a necessidade urgente de soluções inovadoras.

Para preencher essa lacuna, desenvolvemos uma abordagem endoscópica experimental para investigar a disfunção laríngea em modelos murinos (ou seja, camundongos e ratos). No entanto, a endoscopia em roedores é bastante desafiadora devido ao seu pequeno tamanho em relação à tecnologia atual de endoscópios, diferenças anatômicas nas vias aéreas superiores e a necessidade de anestesia para acessar a laringe de maneira ideal. Aqui, descrevemos uma nova abordagem de laringoscopia transoral que permite imagens de vídeo em close e desobstruídas do movimento laríngeo em camundongos e ratos. As etapas críticas do protocolo incluem o gerenciamento preciso da anestesia (para evitar overdose que abole a deglutição e/ou riscos de mortalidade relacionada ao desconforto respiratório) e o controle do endoscópio por micromanipuladores (para gravação de vídeo estável do movimento laríngeo por um único pesquisador para quantificação subsequente).

É importante ressaltar que o protocolo pode ser realizado ao longo do tempo nos mesmos animais para estudar o impacto de várias condições patológicas especificamente na função laríngea. Uma nova vantagem deste protocolo é a capacidade de visualizar a proteção das vias aéreas durante a deglutição, o que não é possível em humanos devido à inversão epiglótica sobre a entrada laríngea que obstrui a visão da glote. Os roedores, portanto, fornecem uma oportunidade única para investigar especificamente os mecanismos de proteção normal versus patológica das vias aéreas laríngeas com o objetivo final de descobrir tratamentos para restaurar efetivamente a função laríngea normal.

Introdução

A laringe é um órgão cartilaginoso localizado na interseção dos tratos respiratório e digestivo na garganta, onde funciona como um mecanismo de válvula para controlar com precisão o fluxo e a direção do ar (ou seja, durante a respiração e vocalização) versus alimentos e líquidos (ou seja, durante a deglutição). Sabe-se que uma ampla gama de distúrbios afeta a laringe, incluindo congênita (por exemplo, laringomalácia, estenose subglótica), neoplásica (por exemplo, papilomatose laríngea, carcinoma de células escamosas), neurológica (por exemplo, paralisia laríngea idiopática, acidente vascular cerebral (AVC), doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica) e iatrogênica (por exemplo, lesão inadvertida durante cirurgia de cabeça ou pescoço). Independentemente da etiologia, a disfunção laríngea geralmente resulta em uma tríade de sintomas de dispneia (dificuldade para respirar), disfonia (deficiência de voz) e disfagia (deficiência de deglutição) que impactam negativamente o bem-estar econômico e social de uma pessoa 1,2,3,4.

Além disso, a disfagia, particularmente em indivíduos clinicamente frágeis, pode levar à pneumonia aspirativa (devido ao escape de alimentos ou líquidos através de uma laringe incompletamente fechada para os pulmões) e morbidade associada, hospitalização recorrente e mortalidade precoce ^5,6. Apesar dessas graves consequências, os tratamentos existentes para a disfunção laríngea são amplamente voltados para intervenções cirúrgicas e comportamentais que normalmente não restauram a função laríngea normal 1,2,7,8,9,10, destacando a necessidade urgente de soluções inovadoras. Para esse objetivo, temos desenvolvido uma abordagem endoscópica experimental para investigar a disfunção laríngea em modelos murinos (ou seja, camundongos e ratos).

Na medicina humana, o padrão-ouro para a avaliação da disfunção laríngea é a visualização endoscópica, denominada laringoscopia11,12. Normalmente, um endoscópio flexível é passado pelo nariz para examinar a laringe, particularmente as pregas vocais e as estruturas laríngeas supraglóticas e subglóticas adjacentes. Um endoscópio rígido também pode ser usado para visualizar a laringe através da cavidade oral. Qualquer uma das abordagens permite o exame macroscópico da anatomia laríngea e pode ser usada para avaliar a mobilidade e função laríngea durante a respiração, fonação e uma variedade de reflexos protetores das vias aéreas, como tosse e reflexo adutor laríngeo 13,14,15,16. Durante a deglutição, no entanto, a laringe é completamente obscurecida pela epiglote à medida que se inverte para cobrir a entrada laríngea, protegendo-a do trajeto do bolo alimentar/líquido que está sendo engolido. Como resultado, a visualização direta do movimento laríngeo durante a deglutição não é possível em humanos e, portanto, deve ser inferida indiretamente usando outras abordagens diagnósticas (por exemplo, fluoroscopia, eletromiografia, eletroglotografia).

Este artigo descreve um protocolo inovador de laringoscopia para camundongos e ratos que permite imagens de perto e desobstruídas da respiração e proteção das vias aéreas durante a deglutição sob anestesia leve. O protocolo é compatível com uma variedade de sistemas de endoscopia disponíveis comercialmente em combinação com uma plataforma personalizada para imobilizar o roedor anestesiado durante todo o procedimento. É importante ressaltar que vários projetos/configurações de plataformas de endoscopia são realmente possíveis, dependendo dos recursos disponíveis e da agenda de pesquisa de cada laboratório. Nossa intenção aqui é fornecer orientação para os pesquisadores considerarem no contexto de suas pesquisas. Além disso, pretendemos demonstrar como esse protocolo de laringoscopia pode levar a uma riqueza de dados objetivos que podem gerar novos insights sobre nossa compreensão da disfunção e regeneração laríngea.

O efeito combinado de todas as etapas descritas neste protocolo de laringoscopia murina resulta em um exame minimamente invasivo da laringe murina adulta que pode ser repetido nos mesmos animais para detectar e caracterizar a disfunção laríngea ao longo do tempo em resposta à lesão iatrogênica, progressão da doença e/ou intervenção de tratamento em relação à proteção das vias aéreas. É importante observar que este protocolo não avalia a função laríngea relacionada à vocalização.

Protocolo

O protocolo de laringoscopia murina segue um protocolo aprovado do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) e as Diretrizes do National Institutes of Health (NIH). Foi desenvolvido para uso com mais de 100 camundongos C57BL / 6J adultos e mais de 50 ratos Sprague Dawley adultos, aproximadamente sexos iguais e 6 semanas a 12 meses de idade para ambas as espécies. O desenvolvimento de protocolos adicionais é necessário para adaptação a roedores mais jovens/menores. Os animais foram alojados em grupo (até quatro camundongos ou dois ratos por gaiola, com base no sexo e na ninhada). As condições padrão do biotério incluíram gaiola estática com regulação estrita da temperatura ambiente (20-26 °C), umidade (30%-70%) e ciclo de luz padrão de 12 h. Todos os animais receberam materiais de enriquecimento frescos (por exemplo, cabana / cachimbo, guloseimas dentárias, ninho) nas trocas semanais de gaiola. O acesso ilimitado a alimentos e água foi fornecido, exceto durante uma restrição alimentar curta (até 4-6 h) antes da anestesia, conforme descrito abaixo. A equipe veterinária e de pesquisa monitorava os animais todos os dias.

1. Anestesia animal que não abole a deglutição

1. Use equipamento de proteção individual adequado (por exemplo, luvas, máscara) para minimizar a exposição a alérgenos ao trabalhar com roedores.
2. Restrinja cada gaiola de roedor até 4-6 h antes da anestesia para minimizar a retenção de alimentos na cavidade oral e faringe, o que pode interferir na visualização endoscópica e/ou resultar em aspiração de alimentos durante o procedimento.
   NOTA: A retenção de alimentos na cavidade oral é um achado normal em roedores sem disfagia se não tiverem restrição alimentar.
3. Prepare uma "estação de aquecimento" para a indução/recuperação dos animais.
   1. Pré-aqueça uma almofada de aquecimento com circulação de água a 37 °C em uma superfície de bancada.
   2. Selecionar gaiolas de indução/recuperação de tamanho adequado para as espécies que estão sendo testadas. Por exemplo, gaiolas de caixa de sapatos de camundongo com tampas de filtro são dimensionadas adequadamente para a indução / recuperação de camundongos e ratos. Utilizar uma gaiola de indução/recuperação nova para cada animal a ensaiar; Use uma única gaiola como gaiola de indução e recuperação para o mesmo animal.
   3. Forre o piso da gaiola de indução/recuperação com uma leve camada de material absorvente (por exemplo, aparas de álamo, toalha de papel, almofada para filhotes) para aquecer e absorver as secreções corporais durante a indução e recuperação da anestesia.
   4. Coloque as gaiolas preparadas (com tampas superiores do filtro) totalmente na almofada de aquecimento por 30-60 min antes da indução da anestesia.
      NOTA: Este microambiente fornece calor suplementar suficiente para promover o metabolismo estável da anestesia durante a indução e recuperação.
4. Coloque a gaiola doméstica do animal até a metade da almofada de aquecimento pré-aquecida a 37 °C por aproximadamente 30 minutos antes da indução da anestesia.
   NOTA: Fornecer calor suplementar antes do procedimento pode acelerar a indução da anestesia e evitar overdose acidental devido ao metabolismo anestésico lento / retardado da hipotermia.
5. Prepare a anestesia com cetamina-xilazina (KX) com base na espécie e no peso corporal.
   1. Para camundongos: Uma mistura de 90 mg / kg de cetamina e 11 mg / kg de xilazina é suficiente para laringoscopia transoral em camundongos adultos C57BL / 6 de ambos os sexos. Ajuste as doses para outras linhagens e idades de camundongos.
   2. Para ratos: Uma mistura de 60 mg/kg de cetamina e 6 mg/kg de xilazina é suficiente para a laringoscopia transoral em ratos adultos da raça Sprague Dawley de ambos os sexos. Ajuste as doses para outras linhagens e idades de ratos.
6. Pré-aqueça os agentes anestésicos cheios de seringa na estação de aquecimento a 37 °C para evitar a perda de calor nos animais que ocorre ao injetar fluidos frios.
7. Injete no roedor a dose calculada de KX utilizando uma seringa de tamanho adequado (por exemplo, 1 ml) e uma agulha (por exemplo, 26 G1/2).
   1. Para camundongos: Administre uma única injeção subcutânea (SC).
      NOTA: Em nossa experiência, as injeções de SC em camundongos reduzem / abolem a mortalidade relacionada à anestesia em comparação com as injeções intraperitoneais (IP).
   2. Para ratos: Administre uma única injeção SC ou IP. Se preferir, sedar ratos com isoflurano (ISO) (3-5%) em uma câmara de indução imediatamente antes da injeção de KX.
      NOTA: O movimento espontâneo do corpo pode ser retomado por um breve período (normalmente <1 min) até que o KX faça efeito.
8. Administre glicopirrolato (agente anticolinérgico) imediatamente após a injeção de KX para reduzir o excesso de secreções salivares que podem dificultar a visualização da laringe durante a endoscopia transoral e/ou obstruir mecanicamente as vias aéreas superiores durante a recuperação da anestesia.
   NOTA: A dosagem e a via de entrega são idênticas para camundongos e ratos (0,01-0,02 mg / kg SC), e o efeito é quase imediato e dura várias horas.
9. Após a injeção de glicopirrolato, coloque o roedor anestesiado na gaiola de indução pré-aquecida na estação de aquecimento e cubra a gaiola com um campo cirúrgico para fornecer um ambiente escuro que minimize a estimulação visual por 10 minutos, sem perturbações.
   1. Terminar o procedimento se o roedor permanecer deambulatório 10 minutos após a dose inicial de KX.
      NOTA: As tentativas de fornecer anestesia adicional (manutenção de KX ou cetamina) provavelmente serão inúteis.
10. Após 10 min, administre uma dose de manutenção de cetamina (1/4 da dose inicial se os reflexos dos membros posteriores estiverem diminuídos ou 1/2 da dose inicial se os reflexos dos membros posteriores estiverem vivos; SC para camundongos e SC/IP para ratos) para manter a anestesia.
11. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento da córnea e o trauma associado durante o procedimento de laringoscopia.
12. Transfira o roedor anestesiado para uma plataforma de endoscopia personalizada para iniciar o procedimento de laringoscopia.
    NOTA: Projetamos nossa plataforma de endoscopia (Figura 1) para ter várias funcionalidades para uso com uma variedade de abordagens cirúrgicas e eletrofisiológicas de roedores que não requerem necessariamente endoscopia. Como tal, é construído para uso puramente endoscópico. Quando relevante, destacaremos recursos/componentes essenciais para este protocolo de laringoscopia.
13. Deste ponto em diante, verifique os reflexos dos membros posteriores a cada 15-20 minutos durante todo o procedimento e forneça doses adicionais de manutenção com cetamina conforme necessário, espaçadas pelo menos 20 minutos. Como este é um procedimento relativamente curto (normalmente <45 min sob anestesia), raramente é necessária cetamina adicional após a dose inicial de manutenção.

2. Passagem transoral do endoscópio para visualização da laringe

1. Antes de anestesiar o animal, prepare um endoscópio de tamanho apropriado com capacidade de gravação de vídeo.
   NOTA: Usamos rotineiramente um otoscópio de zero grau com um diâmetro de haste de 1,9 mm e comprimento de haste de 10 cm com uma bainha de metal personalizada (Figura 2), que é o endoscópio representativo utilizado em todo este protocolo.
   1. Conecte o endoscópio a uma fonte de luz e sistema de gravação de endoscopia para visualização em tempo real e gravação de vídeo a um mínimo de 30 quadros por segundo (fps).
   2. Concentre e equilibre o branco da câmera para obter a melhor qualidade de imagem.
   3. Conecte o endoscópio a um micromanipulador.
      NOTA: Para rastreamento de movimento laríngeo, prendemos o endoscópio a um micromanipulador na plataforma de endoscopia para permitir o controle preciso do endoscópio para captura de vídeo estável.
2. Prenda o roedor em decúbito dorsal em uma plataforma aquecida. Estabilize e imobilize a cabeça prendendo-a com barras auriculares.
   1. Certifique-se de que a cabeça do roedor possa girar livremente para cima/para baixo (mas não de um lado para o outro) nas barras auriculares sem escorregar. Esse grau de liberdade facilita a inserção transoral e o avanço do endoscópio para alcançar a laringe.
3. Se o registro eletrofisiológico síncrono da respiração, deglutição e coordenação da deglutição e respiração for desejado durante a endoscopia, prossiga com a aplicação de sensores apropriados para esse fim (Figura 3).
   1. Prenda um sensor respiratório no abdômen na linha média, imediatamente caudal ao processo xifóide, usando fita cirúrgica.
   2. Faça a barba e limpe/desinfete a pele com um lenço umedecido com álcool antes de inserir os eletrodos da agulha para evitar infecções.
   3. Use uma agulha de 22 G para perfurar uma pequena abertura na pele antes de inserir o eletrodo da agulha para evitar danos à agulha de eletromiografia (EMG).
   4. Insira um eletrodo de agulha EMG concêntrico estéril (por exemplo, 25 mm x 0.3 mm/30 G) através da pele submentoniana na linha média na base da língua (por exemplo, genioglosso ou músculo genio-hióideo, dependendo da profundidade de inserção da agulha).
   5. Insira um eletrodo de aterramento (por exemplo, aço inoxidável 27 G) por via subcutânea no quadril (ambos os lados).
   6. Conecte o sensor respiratório e os eletrodos de agulha EMG a um sistema de gravação de eletrofisiologia (por exemplo, bioamplificador e sistema de aquisição de dados com captura de vídeo síncrona) e verifique os sinais de eletrofisiologia limpos em ambos os canais antes de prosseguir.
   7. Envolva os locais de conexão do eletrodo com papel alumínio para proteger contra ruído elétrico e melhorar a relação sinal-ruído nos registros eletrofisiológicos correspondentes.
   8. Ajuste a localização do sensor respiratório e a profundidade do eletrodo da agulha EMG conforme necessário para obter sinais eletrofisiológicos limpos em ambos os canais. Para seguir este protocolo, use uma taxa de amostragem de 1k para respiração e uma taxa de amostragem de 20k e filtro passa-banda (por exemplo, 150-3.000 Hz) para EMG.
4. Cubra o torso do roedor (e o sensor respiratório) com um cobertor transparente para facilitar a termorregulação e permitir a visualização do movimento abdominal durante a respiração. Deixe os membros posteriores e a parte inferior do abdômen livremente expostos para acesso durante as verificações de reflexo e a redosagem de manutenção com cetamina. Certifique-se de que o cobertor não restrinja o movimento abdominal durante a respiração.
5. Prossiga com a endoscopia transoral (Figura 4).
   1. Abra a boca do roedor inserindo um aplicador cônico com ponta de algodão atrás dos incisivos centrais, perpendicular à mandíbula. Gire o cotonete na superfície dorsal da língua para protuberá-lo levemente da boca.
6. Usando um leve aperto de dedo, puxe suavemente a língua ligeiramente para fora da boca para um lado dos incisivos centrais enquanto insere a ponta do endoscópio na cavidade oral (Figura 4A, B).
   1. Ligue a fonte de luz depois de inserir a ponta do endoscópio na boca para evitar danos aos olhos do roedor.
   2. Insira o endoscópio lateralmente aos incisivos do mesmo lado da língua retraída. Os incisivos centrais impedem que o endoscópio seja inserido na linha média, necessitando dessa abordagem de inserção lateral.
7. Inicie os sistemas de registro de endoscopia (e eletrofisiologia). Registre continuamente durante todo o procedimento para garantir dados suficientes para análise post hoc ou grave em momentos selecionados, dependendo das necessidades do estudo.
8. Avance cuidadosamente o endoscópio para visualizar a orofaringe, tomando cuidado para não raspar o palato duro ou aplicar pressão excessiva na língua que pode causar lesões.
   1. Remova quaisquer partículas visíveis de alimentos e/ou secreções salivares em excesso usando um cotonete de tamanho apropriado (por exemplo, uma microescova de 1.5 mm) para minimizar o risco de aspiração à medida que o procedimento avança.
   2. Continue avançando/ajustando a posição do endoscópio até que a hipofaringe esteja centralizada dentro do campo de view no monitor e as principais estruturas anatômicas sejam identificáveis (Figura 4C). Neste ponto, todas as estruturas devem aparecer anatomicamente alinhadas/simétricas dentro do campo de visão da câmera; caso contrário, reposicione o endoscópio conforme necessário.
   3. Observe o movimento evocado da mandíbula/língua durante o avanço do endoscópio. Se ausente, prossiga sem redosagem adicional de cetamina. Se presente, administre uma segunda dose de manutenção de cetamina (1/4 a 1/2 da dose inicial de cetamina) e aguarde aproximadamente 5 minutos para fazer efeito antes de prosseguir. Dose novamente apenas se tiver passado pelo menos 20 minutos desde a injeção anterior para evitar sedação excessiva e abolição da deglutição.
   4. Examine a língua do roedor a cada 5 minutos durante todo o procedimento para descoloração escurecida, o que é indicativo de isquemia. Para evitar isso, reposicione o endoscópio conforme necessário.
9. Aplique uma leve pressão no véu com uma microssonda (por exemplo, uma espátula de metal) inserida ao lado do endoscópio para desacoplar o palato mole e a epiglote para visualizar a laringe à distância (Figura 4D). Evite usar a ponta do endoscópio para desacoplamento, pois a pressão aplicada pode causar danos aos tecidos moles ou dobrar/danificar permanentemente o eixo do endoscópio.
   NOTA: Ao contrário dos humanos, a laringe murina não é diretamente visível de uma perspectiva transoral. Em vez disso, a epiglote é mecanicamente aprisionada sob uma membrana mucosa que cobre o véu, o que resulta na formação de um espaço hipofaríngeo sem saída. A aplicação de uma leve pressão no véu libera a epiglote da membrana velar para dar uma visão parcial da laringe.
10. Observe as deglutições evocadas durante o desacoplamento véu/epiglote.
    1. Identifique as deglutições como deslocamentos posteriores abruptos e breves da língua em direção ao palato duro. Esse movimento geralmente ocorre em sincronia com o movimento mandibular breve/depressão, fornecendo assim um substituto para a identificação da deglutição quando a língua posterior não é facilmente visível no campo de visão do endoscópio.
    2. Identifique também as deglutições por meio da atividade de explosão de EMG da língua em conjunto com breves episódios de apneia no registro eletrofisiológico, ambos ocorrendo em sincronia com eventos de fechamento glótico no vídeo de endoscopia.
       1. No caso de deglutição rápida e repetitiva indicativa de anestesia insuficiente (ou seja, muito leve), retome a dose e aguarde ~ 5-10 min antes de prosseguir. Aguarde pelo menos 20 minutos após a injeção anterior de manutenção com cetamina para evitar sedação excessiva e abolição da deglutição.
       2. Considere a profundidade anestésica ótima quando apenas algumas deglutições são evocadas durante o desacoplamento velar-epiglótico.
       3. Se a deglutição for abolida, a anestesia é muito profunda para avaliar a proteção das vias aéreas laríngeas. Nesse caso, aguarde de 5 a 10 minutos pelo metabolismo da cetamina antes de prosseguir com a visualização de perto da laringe.

3. Gravação de vídeo em close-up e desobstruída do movimento laríngeo durante a respiração e deglutição evocada

NOTA: O registro eletrofisiológico síncrono da respiração, deglutição e coordenação da deglutição e respiração também é uma opção.

1. Avance lentamente o endoscópio entre o véu e a epiglote, mantendo a laringe no centro do campo de visão (Figura 5A-C).
   NOTA: A ponta do endoscópio passará prontamente pela abertura velar-epiglótica sem força. Caso contrário, aborte o procedimento para evitar possíveis danos ao animal. É possível visualizar a laringe à distância, com a ponta do endoscópio na hipofaringe. No entanto, essa abordagem geralmente requer retração manual da epiglote, véu e/ou língua para melhor visualização da laringe. No entanto, partes da laringe geralmente permanecem obscurecidas da vista, e os dispositivos de retração podem restringir o movimento laríngeo, o que pode ser confundido com disfunção.
2. Continue avançando o endoscópio para obter uma visão aproximada desobstruída de todas as dimensões ventral-dorsal e lateral da laringe em um único campo de visão (Figura 5C).
   NOTA: A comissura ventral pode ser obstruída pela epiglote, particularmente em camundongos mais jovens / menores. Nesses casos, a tentativa de manipular de forma mais agressiva a ponta do endoscópio para visualizar a comissura ventral pode restringir o movimento laríngeo, o que pode ser confundido com disfunção. Também pode bloquear o fluxo de ar laríngeo, resultando em asfixia.
3. Observe o movimento oscilatório da laringe enquanto o roedor inspira (alargamento glótico) e expira (estreitamento glótico) durante cada ciclo respiratório.
   NOTA: A taxa e a magnitude do movimento laríngeo/glótico podem variar com a profundidade do anestésico; no entanto, uma lacuna glótica (ou seja, espaço de ar entre as aritenóides esquerda/direita e as pregas vocais) normalmente permanece visível durante todo o ciclo respiratório em roedores saudáveis.
   1. Se for observado estreitamento glótico acentuado, ajuste a posição do endoscópio para garantir um fluxo de ar desobstruído pelas vias aéreas superiores. Por exemplo, evite aplicar pressão no véu, o que pode causar obstrução dos tecidos moles das vias aéreas nasais. Evite também inserir a ponta do endoscópio no espaço glótico, o que pode bloquear o fluxo de ar laríngeo, levando à asfixia. Se, em casos raros, a respiração cessar, faça várias compressões torácicas esternais (usando um dedo) ou ventilação com pressão positiva (usando uma "bolsa de ressuscitação" em miniatura) após a remoção do endoscópio.
4. Gravação de vídeo do movimento respiratório laríngeo por 30-60 s para fins de avaliação post hoc.
5. Com a laringe ainda em close-up, ajuste levemente a ponta do endoscópio dentro da entrada da laringe para aplicar estimulação mecânica na mucosa que recobre o véu e/ou epiglote e evoque a deglutição em roedores anestesiados de maneira ideal.
   1. Use ajustes de nível micro da ponta do endoscópio (ou seja, ~ 1 mm em qualquer direção) para evitar lesões na mucosa e / ou obstrução das vias aéreas.
   2. Fique atento às deglutições evocadas, que podem ser prontamente identificadas como eventos de fechamento glótico abrupto que ocorrem em sincronia com depressão mandibular visível, atividade de explosão EMG da língua e apneia breve (<1/2 s) visível no traço respiratório.
      NOTA: Podem ocorrer eventos de fechamento glótico sem movimento concomitante da mandíbula; no entanto, o fechamento glótico geralmente é incompleto para esses casos. Suspeitamos que possam ser outros reflexos protetores das vias aéreas (por exemplo, reflexo adutor laríngeo) emergindo à medida que a anestesia está começando a se desgastar; no entanto, são ocorrências raras/inconsistentes que requerem investigação adicional.
   3. Repita até que 5-10 deglutições sejam evocadas e o vídeo gravado por animal. Se a deglutição for abolida, remova o endoscópio e aguarde de 5 a 10 minutos para que ocorra o metabolismo da cetamina antes de prosseguir.
6. Retraia cuidadosamente, mas não remova, o endoscópio na orofaringe e centralize a hipofaringe no campo de visão para visualizar a epiglote e o véu.
7. Reacople o véu e a epiglote para retomar a respiração nasal usando um micro-swab para aplicar uma leve pressão contra a base da língua para evocar a deglutição e o reaprisionamento da epiglote abaixo da membrana velar. Se o reacoplamento não ocorrer em algumas tentativas, prossiga com a recuperação da anestesia sem reacoplamento para evitar o risco de lesão laríngea.
8. Pare o registro da endoscopia (e eletrofisiologia).
9. Use um cotonete embebido em solução salina para umedecer a língua e os incisivos centrais e retornar a língua à sua posição anatômica dentro da cavidade oral.
10. Retire as barras auriculares e remova a sonda de temperatura, o sensor respiratório e os eletrodos EMG do roedor para prosseguir com a recuperação da anestesia.

4. Recuperação da anestesia

1. Coloque o animal em uma gaiola de recuperação pré-aquecida (ou seja, igual à gaiola de indução) na "estação de aquecimento" para se recuperar da anestesia.
2. Reaplique o lubrificante para os olhos para evitar o ressecamento.
3. Administre solução salina aquecida SC para hidratação de fluidos: até 5 mL para ratos e até 0,5 mL para camundongos.
4. Administre atipamezol SC para reversão da xilazina e para aumentar o impulso respiratório: 1-2 mg / kg para ratos e camundongos.
   1. Comece com 2 mg / kg de atipamezol, imediatamente seguido de estimulação manual ao longo das costas e do estômago do roedor para acelerar a recuperação.
      NOTA: Usando essa abordagem, o movimento espontâneo da cabeça geralmente começa em 1-3 minutos. No entanto, o retorno ao estado ambulatorial geralmente leva em média 2 h (variando de 1 h a 5 h) após a laringoscopia sob anestesia KX, devido a diferenças individuais.
   2. Forneça atipamezol adicional dosado a 1 mg / kg (pelo menos 15 min após a primeira injeção) se o movimento espontâneo do corpo estiver diminuindo em vez de aumentar nos primeiros 15-30 min da recuperação da anestesia, apesar de fornecer estimulação manual frequente.
   3. Prossiga com a administração de doxapram (5 mg / kg IP para ratos e camundongos) se a atividade espontânea continuar a diminuir. Dose novamente com este agente de "resgate de emergência" em intervalos de 10 a 15 minutos (até cinco doses) até que surja movimento espontâneo. Se os roedores permanecerem moribundos, eutanasiar os animais usando métodos de eutanásia aprovados (por exemplo, uma overdose de cetamina seguida por um método secundário, como decapitação).
5. Monitore de perto os roedores em recuperação em intervalos de 15 a 20 minutos para detectar alterações adversas no estado respiratório, mobilidade e termorregulação e fornecer intervenção conforme necessário (por exemplo, estimulação manual, oxigênio suplementar, manta térmica, atipamezol ou injeções de doxapram). Forneça monitoramento mais frequente para roedores que requerem intervenção.
   1. Forneça oxigênio suplementar (por exemplo, 1-2 L/min em uma câmara de indução aquecida, sem ISO) por intervalos de 10 minutos, conforme necessário para roedores com tempos prolongados de recuperação da anestesia KX. Como alternativa, aplique estimulação frequente ao longo das superfícies dorsal e ventral do animal para normalizar os níveis de SpO₂ (>94%).
   2. Coloque os companheiros de gaiola em recuperação na mesma gaiola de recuperação (até dois roedores por gaiola) para promover maior atividade espontânea e recuperação mais rápida.
6. Devolva os roedores à gaiola doméstica aquecida quando puderem se mover espontaneamente pela gaiola de recuperação.
   1. Devolva a garrafa padrão de comida e água para a gaiola doméstica. Não forneça acomodações especiais para acesso a alimentos/água enquanto a anestesia ainda estiver passando para minimizar o risco de asfixia/aspiração.
   2. Observe a atividade da gaiola doméstica e remova quaisquer obstáculos que impeçam a deambulação (por exemplo, cabana, tubo de PVC).
   3. Posicione a gaiola doméstica meio colocada, metade fora da estação de aquecimento pelas próximas 12-16 h (ou seja, durante a noite).
      NOTA: Interromper o calor suplementar mais cedo pode resultar em mortalidade devido à hipotermia.
7. Execute verificações de integridade padrão na manhã seguinte. Retorne os animais com a retomada da atividade normal/basal, funções corporais (por exemplo, termorregulação, comer, beber, urinar, defecar) e peso estável (ou seja, manter ou ganhar) às condições padrão do viveiro com monitoramento diário de saúde de rotina. Na rara ocorrência de roedores terem diminuição da atividade, funções corporais ou peso corporal, continue o calor suplementar por mais um dia.
   NOTA: Para ratos, é comum que a coloração com porfirina apareça repentinamente ao redor de ambos os olhos ~ 3-6 h após o período de recuperação da anestesia. A coloração geralmente desaparece em 24 horas.

5. Quantificação objetiva do movimento laríngeo durante a respiração versus deglutição

1. Use um software de edição de vídeo com um recurso de análise quadro a quadro para visualizar os vídeos de endoscopia.
   1. Identifique pelo menos um episódio representativo de 10-20 s de respiração espontânea por animal.
   2. Identifique 3-5 eventos representativos de deglutição por animal.
   3. Certifique-se de que os episódios/eventos de respiração e deglutição selecionados atendam aos seguintes critérios de análise: a laringe centralizada no campo de visão da câmera com todas as estruturas/bordas laríngeas visíveis (ou seja, não obscurecidas pelo véu, epiglote ou excesso de secreções salivares), iluminação suficiente (ou seja, capaz de ver todas as estruturas/bordas laríngeas) e sem artefato de movimento da câmera (ou seja, o endoscópio não está se movendo).
2. Analisar os episódios/eventos respiratórios e de deglutição identificados utilizando abordagens subjetivas e/ou objetivas.
   1. Para análise subjetiva: Use uma escala Likert para pontuar subjetivamente o movimento laríngeo durante a visualização em tempo real e quadro a quadro usando um software de edição de vídeo. Para seguir esse protocolo, use uma escala Likert expandida variando de -2 a +2, onde valores negativos indicam movimento laríngeo na direção oposta ao esperado. Estimar a proteção das vias aéreas laríngeas durante a deglutição, onde 0 = nenhuma redução no tamanho do gap glótico (ou seja, nenhuma proteção das vias aéreas laríngeas), 1 = alguma redução do gap glótico (ou seja, proteção incompleta das vias aéreas) e 2 = adução completa das aritenóides, com apenas um pequeno gap glótico ventral entre as pregas vocais (ou seja, proteção completa das vias aéreas), com valores negativos indicando movimento laríngeo paradoxal.
      NOTA: Uma escala Likert variando de 0 a 2 é comumente usada em estudos com roedores, onde 0 = nenhum movimento, 1 = algum movimento e 2 = movimento normal 17,18,19,20,21,22. No entanto, essa escala não leva em consideração o movimento laríngeo paradoxal que geralmente ocorre após a lesão do nervo laríngeo recorrente (NLR)¹⁰.
   2. Para análise objetiva: Identifique quatro quadros de vídeo principais - 1) o quadro de repouso que precede diretamente o início da adução laríngea (ou seja, o quadro antes da adução das pregas vocais), 2) o quadro no qual as pregas vocais completaram a adução, 3) o quadro imediatamente anterior à abdução das pregas vocais (isso pode se sobrepor ao # 2) e 4) o quadro onde as pregas vocais foram abduzidas completamente e retornaram a uma posição de repouso para retomar a respiração. Use o carimbo de data/hora desses quatro quadros-chave para calcular a duração da adução das pregas vocais (quadro 1 ao quadro 2), fechamento glótico (quadro 2 ao quadro 3), abdução das pregas vocais (quadro 3 ao quadro 4) e duração total da deglutição (quadro 1 ao quadro 4). Alternativamente, use outro software comercial existente²³ para medir o ângulo glótico (ou seja, entre as aritenóides dorsalmente ou as pregas vocais ventralmente) durante a abdução máxima e a adução máxima usando imagens estáticas^{17 , 18 , 24} . Peça a pelo menos dois revisores treinados que realizem esse processo de forma independente e cega, identifiquem discrepâncias entre os revisores e cheguem a um consenso conjunto para cada discrepância.
      NOTA: Anteriormente, realizamos esta análise manual quadro a quadro de eventos de tempo de fechamento glótico (ou seja, durante os reflexos protetores das vias aéreas) usando software comercial de edição de vídeo em roedores e humanos¹⁴. No entanto, essa abordagem é ineficiente e fornece apenas quantificação limitada da dinâmica do movimento laríngeo. Atualmente, usamos um software de rastreamento laríngeo construído internamente para realizar uma quantificação objetiva mais extensa do movimento laríngeo durante a respiração e os reflexos protetores das vias aéreas 22,25,26,27,28,29,30. O software apresenta capacidade automatizada de rastreamento quadro a quadro para quantificação objetiva da distância (amplitude) e do tempo (frequência) do movimento laríngeo do lado esquerdo versus direito. Usamos esses parâmetros para derivar uma variedade de medições baseadas em movimento para detectar/quantificar a disfunção laríngea (por exemplo, ângulo glótico máximo/mínimo/amplitude, simetria do movimento laríngeo e sincronia) durante a respiração, deglutição e outros reflexos protetores das vias aéreas (por exemplo, reflexo adutor laríngeo). Este software ainda está em refinamento e ainda não está disponível comercialmente/publicamente.

Resultados

O uso bem-sucedido desse protocolo de laringoscopia murina resulta na visualização aproximada da laringe durante a respiração espontânea e na deglutição evocada em condições saudáveis e de doença, conforme mostrado na Figura 6. Além disso, esse protocolo pode ser repetido várias vezes nos mesmos roedores para permitir a investigação da função/disfunção laríngea ao longo do tempo. Conforme mostrado na Figura 7...

Discussão

Desenvolvemos com sucesso um protocolo de laringoscopia murino específico replicável que permite a visualização de perto do movimento laríngeo durante a respiração e a deglutição. É importante ressaltar que o protocolo pode ser realizado ao longo do tempo nos mesmos animais para estudar o impacto de várias condições patológicas especificamente na função laríngea. Este protocolo foi desenvolvido na última década e passou por modificações substanciais e solução de pr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atipamezole	Zoetis	Antisedan; 5 mg/mL	Parsippany-Troy Hills, NJ
Bioamplifier	Warner Instrument Corp.	DP-304	Hamden, CT
Concentric EMG needle electrode	Chalgren Enterprises, Inc.	231-025-24TP; 25 mm x 0.3 mm/30 G	Gilroy, CA
Cotton tipped applicator (tapered)	Puritan Medical Products	REF 25-826 5W	Guilford, ME
Data Acquisition System	ADInstruments	PowerLab 8/30	Colorado Springs, CO
DC Temperature Control System - for endoscopy platform	FHC, Inc.	40-90-8D	Bowdoin, ME
Electrophysiology recording software	ADInstruments	LabChart 8 with video capture module	Colorado Springs, CO
Endoscope monitor	Karl Storz Endoscopy-America	Storz Tele Pack X monitor	El Segundo, CA
Glycopyrrolate	Piramal Critical Care	NDC 66794-204-02; 0.2 mg/mL	Bethlehem, PA
Ground electrode	Consolidated Neuro Supply, Inc.	27 gauge stainless steel, #S43-438	Loveland, OH
Isoflurane induction chamber	Braintree Scientific, Inc.	Gas Anesthetizing Box - Red	Braintree, MA
Ketamine hydrochloride	Covetrus North America	NDC 11695-0703-1, 100 mg/mL	Dublin, OH
Metal spatula to decouple epiglottis and velum	Fine Science Tools	Item No. 10091-12;	Foster City, CA
Micro-brush to remove food/secretions from oral cavity	Safeco Dental Supply	REF 285-0023, 1.5 mm	Buffalo Grove, IL
Mouse-size heating pad for endoscopy platform	FHC, Inc.	40-90-2-07 – 5 x 12.5 cm Heating Pad	Bowdoin, ME
Ophthalmic ointment (sterile)	Allergan, Inc.	Refresh Lacri-lube	Irvine, CA
Otoscope	Karl Storz	REF 1232AA	El Segundo, CA
Pneumogram Sensor	BIOPAC Systems, Inc.	RX110	Goleta, CA
Pulse oximetry - Vetcorder Pro Veterinary Monitor	Sentier HC, LLC	Part No. 710-1750	Waukesha, WI
Rat-size heating pad for endoscopy platform	FHC, Inc.	40-90-2 – 12.5X25cm Heating Pad	Bowdoin, ME
Sterile needles for drug injections	Becton, Dickinson and Company	REF 305110, 26 G x 3/8 inch, PrecisionGlide	Franklin Lakes, NJ
Sterile syringes for drug injections	Becton, Dickinson and Company	REF 309628; 1 mL, Luer-Lok tip	Franklin Lakes, NJ
Surgical drape to cover induction cage for dark environment	Covidien LP	Argyle Surgical Drape Material, Single Ply	Minneapolis, MN
Surgical tape to secure pneumograph sensor to abdomen	3M Health Care	#1527-0, 1/2 inch	St. Paul, MN
Transparent blanket for thermoregulation	The Glad Products Company	Press’n Seal Cling Film	Oakland, CA
Video editing software	Pinnacle Systems, Inc.	Pinnacle Studio, v24	Mountain View, CA
Water circulating heating pad - for anesthesia induction/recovery station	Adroit Medical Systems	HTP-1500 Heat Therapy Pump	Loudon, TN
Xylazine	Vet One	NDC 13985-701-10; Anased, 100 mg/mL	Boise, ID