Modelado de ligandos en mapas derivados de la criomicroscopía electrónica

Resumen

Este protocolo presenta las herramientas disponibles para modelar ligandos de moléculas pequeñas en mapas crioEM de macromoléculas.

Resumen

Descifrar las interacciones proteína-ligando en un complejo macromolecular es crucial para comprender el mecanismo molecular, los procesos biológicos subyacentes y el desarrollo de fármacos. En los últimos años, la microscopía electrónica criogénica de muestras (cryoEM) ha surgido como una técnica poderosa para determinar las estructuras de las macromoléculas e investigar el modo de unión del ligando a una resolución casi atómica. La identificación y el modelado de moléculas no proteicas en los mapas de crioEM suele ser un reto debido a la resolución anisotrópica de la molécula de interés y al ruido inherente a los datos. En este artículo, se presenta a los lectores varios programas y métodos que se utilizan actualmente para la identificación de ligandos, la construcción de modelos y el refinamiento de coordenadas atómicas utilizando macromoléculas seleccionadas. Una de las formas más sencillas de identificar la presencia de un ligando, como se ilustra con la enzima enolasa, es restar los dos mapas obtenidos con y sin el ligando. Es probable que la densidad adicional del ligando se destaque en el mapa de diferencias incluso en un umbral más alto. Hay casos, como se muestra en el caso del receptor metabotrópico de glutamato mGlu₅, en los que no se pueden generar mapas de diferencias tan simples. El método recientemente introducido para derivar el mapa de omisión Fo-Fc puede servir como herramienta para validar y demostrar la presencia del ligando. Por último, utilizando como ejemplo la bien estudiada β-galactosidasa, se analiza el efecto de la resolución en el modelado de los ligandos y las moléculas de disolvente en los mapas de crioEM, y se presenta una perspectiva sobre cómo se puede utilizar la crioEM en el descubrimiento de fármacos.

Introducción

Las células cumplen sus funciones llevando a cabo innumerables reacciones químicas de forma simultánea e independiente, cada una de las cuales está meticulosamente regulada para garantizar su supervivencia y adaptabilidad en respuesta a las señales ambientales. Esto se logra mediante el reconocimiento molecular, que permite que las biomoléculas, especialmente las proteínas, formen complejos transitorios o estables con otras macromoléculas, así como con pequeñas moléculas o ligandos¹. Por lo tanto, las interacciones proteína-ligando son fundamentales para todos los procesos de la biología, que incluyen la regulación de la expresión y la activida....

Protocolo

1. Modelado de fosfoenolpiruvato (PEP) en enolasa de Mycobacterium tuberculosis

1. Identificación de la densidad de ligandos en el mapa crioEM del complejo PEP-enolasa
   1. Descargue los semimapas sin enfocar (emd_30988_additional_1.map y emd_30988_additional_2.map) de apo-enolasa a partir de los datos adicionales en EMDB (ver Tabla de Materiales).
   2. Abra ChimeraX (consulte la tabla de materiales). Abra los semimapas de apo-enolasa haciendo clic en Abrir en la barra de herramientas y seleccionando los nombres de los archivos. Escriba vop add #1 #2 en la líne....

Resultados

Ejemplo 1
La enzima enolasa de M. tuberculosis cataliza el penúltimo paso de la glucólisis y convierte el 2-fosfoglicerato en fosfoenolpiruvato (PEP), que es un intermediario esencial para varias vías metabólicas^44,45. Los datos de CryoEM para las muestras de apo-enolasa y enolasa unida a PEP se recolectaron con el mismo tamaño de píxel de 1.07 Å, y el procesamiento de imágenes se realizó con Relion 3.1

Discusión

Las mejoras en el hardware y el software de los microscopios han dado lugar a un aumento en el número de estructuras crioEM en los últimos años. Aunque la resolución más alta alcanzada hasta el momento en crioEM de una sola partícula es de 1,2 Å^57,58,59, la mayoría de las estructuras se están determinando alrededor de una resolución de 3-4 Å. El modelado de ligandos en mapas de resolución media a baja puede ser compl.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCP4-8.0	Consortium of several institutes	https://www.ccp4.ac.uk	Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography
CCP-EM	Consortium of several institutes	https://www.ccpem.ac.uk/download.php	Free for academic users and includes Coot, Relion and many others
Coot	Paul Emsley, LMB, Cambridge	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/	General software for model building but also available with other suites described above
DockinMap (Phenix)	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html	Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps
Electron Microscopy Data Bank	Consortium of several institutes	https://www.ebi.ac.uk/emdb/	Public Repository for Electron Microscopy maps
Falcon	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf	Commercial, camera from Thermo Fisher
Phenix	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/download	Free for academic users and includes Coot
Protein Data Bank	Consortium of several institutes	https://rcsb.org	Public database of macromolecular structures
Pymol	Schrodinger	https://pymol.org/2/	Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.
Relion	MRC-LMB, Cambridge	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html	Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE	Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher
UCSF Chimera	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html	General purpose software for display, analysis and more
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	General purpose software for display, analysis and more