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Résumé

Ce protocole présente les outils disponibles pour la modélisation de ligands de petites molécules dans les cartes cryoEM des macromolécules.

Résumé

Déchiffrer les interactions protéine-ligand dans un complexe macromoléculaire est crucial pour comprendre le mécanisme moléculaire, les processus biologiques sous-jacents et le développement de médicaments. Ces dernières années, la microscopie électronique cryogénique d’échantillon (cryoEM) est apparue comme une technique puissante pour déterminer les structures des macromolécules et pour étudier le mode de liaison des ligands à une résolution proche de l’atome. L’identification et la modélisation de molécules non protéiques dans les cartes cryoEM sont souvent difficiles en raison de la résolution anisotrope de la molécule d’intérêt et du bruit inhérent aux données. Dans cet article, les lecteurs sont initiés à divers logiciels et méthodes actuellement utilisés pour l’identification des ligands, la construction de modèles et l’affinement des coordonnées atomiques à l’aide de macromolécules sélectionnées. L’une des façons les plus simples d’identifier la présence d’un ligand, comme illustré avec l’enzyme énolase, est de soustraire les deux cartes obtenues avec et sans le ligand. La densité supplémentaire du ligand est susceptible de se démarquer dans la carte des différences, même à un seuil plus élevé. Il y a des cas, comme le montre le cas du récepteur métabotropique du glutamate mGlu5, où de telles cartes de différences simples ne peuvent pas être générées. La méthode récemment introduite pour dériver la carte d’omission Fo-Fc peut servir d’outil pour valider et démontrer la présence du ligand. Enfin, en utilisant l’exemple bien étudié de la β-galactosidase, l’effet de la résolution sur la modélisation des ligands et des molécules de solvant dans les cartes cryoEM est analysé, et une perspective sur la façon dont la cryoEM peut être utilisée dans la découverte de médicaments est présentée.

Introduction

Les cellules accomplissent leurs fonctions en effectuant d’innombrables réactions chimiques simultanément et indépendamment, chacune méticuleusement régulée pour assurer leur survie et leur adaptabilité en réponse aux signaux environnementaux. Ceci est réalisé par la reconnaissance moléculaire, qui permet aux biomolécules, en particulier aux protéines, de former des complexes transitoires ou stables avec d’autres macromolécules ainsi qu’avec de petites molécules ou des ligands1. Ainsi, les interactions protéine-ligand sont fondamentales pour tous les processus de la biologie, qui comprennent la régulation de l’expression et de l’activité des protéines, la reconnaissance des substrats et des cofacteurs par les enzymes, ainsi que la façon dont les cellules perçoivent et relaient les signaux 1,2. Une meilleure compréhension des propriétés cinétiques, thermodynamiques et structurelles du complexe protéine-ligand révèle la base moléculaire de l’interaction des ligands et facilite également la conception rationnelle de médicaments en optimisant l’interaction et la spécificité des médicaments. Une approche économique et plus rapide pour étudier l’interaction protéine-ligand consiste à utiliser l’amarrage moléculaire, qui est une méthode computationnelle qui crible virtuellement une gamme variée de petites molécules et prédit le mode de liaison et l’affinité de ces ligands pour cibler les protéines3. Cependant, les preuves expérimentales provenant de structures à haute résolution déterminées par diffraction des rayons X (DRX), résonance magnétique nucléaire (RMN) ou cryomicroscopie électronique (cryoEM) fournissent la preuve essentielle de ces prédictions et aident au développement d’activateurs ou d’inhibiteurs plus récents et plus efficaces pour une cible donnée. Cet article utilise l’abréviation « cryoEM » comme on l’appelle communément. Cependant, il y a un débat en cours sur le choix de la bonne nomenclature, et récemment, le terme cryogénique-échantillon Electron Microscopie (cryoEM) a été proposé pour indiquer que l’échantillon est à température cryogénique et imagé avec des électrons4. De même, les cartes dérivées de la cryoEM ont été appelées potentiel électron, potentiel électrostatique ou potentiel de Coulomb, et pour simplifier, nous utilisons ici les cartes cryoEM 5,6,7,8,9,10.

Bien que la XRD ait été la technique de référence dans la détermination de la structure à haute résolution des complexes protéine-ligand, la cryoEM post-révolutionde résolution 11 a pris de l’ampleur, comme l’indique l’augmentation des cartes de potentiel de Coulomb ou des cartes cryoEM déposées dans la base de données de microscopie électronique (EMDB)12,13 au cours des dernières années14. En raison des progrès réalisés dans les méthodes de préparation des échantillons, d’imagerie et de traitement des données, le nombre de dépôts de la banque de données sur les protéines (PDB)14 utilisant la cryoEM est passé de 0,7 % à 17 % entre 2010 et 2020, avec environ 50 % des structures signalées en 2020 déterminées à une résolution de 3,5 Å ou mieux15,16. La cryoEM a été rapidement adoptée par la communauté de la biologie structurale, y compris l’industrie pharmaceutique, car elle permet l’étude de macromolécules biologiques flexibles et non cristallines, en particulier les protéines membranaires et les complexes multiprotéiques, à une résolution quasi atomique, surmontant le processus de cristallisation et obtenant des cristaux bien diffractant nécessaires à la détermination de la structure à haute résolution par DRX.

La modélisation précise du ligand dans la carte cryoEM est primordiale, car elle sert de modèle du complexe protéine-ligand au niveau moléculaire. Il existe plusieurs outils automatisés de construction de ligands utilisés en cristallographie aux rayons X qui dépendent de la forme et de la topologie de la densité du ligand afin d’ajuster ou de construire le ligand dans la densité électronique 17,18,19,20. Néanmoins, si la résolution est inférieure à 3 Å, ces approches ont tendance à produire des résultats moins souhaitables car les caractéristiques topologiques dont elles dépendent pour la reconnaissance et la construction deviennent moins définies. Dans de nombreux cas, ces méthodes se sont avérées inefficaces pour modéliser avec précision les ligands dans des cartes cryoEM, car ces cartes ont été déterminées dans la gamme de résolution faible à moyenne, généralement entre 3,5 Å-5 Å17.

La première étape de la détermination de la structure 3D d’un complexe protéine-ligand par cryoEM consiste soit à co-purifier le ligand avec la protéine (lorsque le ligand a une affinité de liaison élevée avec la protéine), soit à incuber la solution protéique avec le ligand pendant une durée spécifique avant la préparation de la grille. Ensuite, un petit volume d’échantillon est placé sur une grille TEM perforée nettoyée au plasma, suivie d’une congélation instantanée dans de l’éthane liquide et enfin d’une imagerie avec un cryo-TEM. La moyenne des images de projection 2D de centaines de milliers à des millions de particules individuelles est calculée pour reconstruire une carte de potentiel de Coulomb en 3D (3D) de la macromolécule. L’identification et la modélisation des ligands et des molécules de solvant dans ces cartes posent des défis importants dans de nombreux cas en raison de la résolution anisotrope sur l’ensemble de la carte (c’est-à-dire que la résolution n’est pas uniforme sur l’ensemble de la macromolécule), de la flexibilité dans la région où le ligand est lié et du bruit dans les données. De nombreux outils de modélisation, d’affinement et de visualisation qui ont été développés pour la DRX sont maintenant adaptés pour être utilisés dans la cryoEM aux mêmes fins 18,19,20,21. Dans cet article, nous présentons un aperçu des différentes méthodes et logiciels actuellement utilisés pour identifier les ligands, construire des modèles et affiner les coordonnées dérivées de la cryoEM. Un protocole étape par étape a été fourni pour illustrer les processus impliqués dans la modélisation de ligands à l’aide de complexes protéine-ligand spécifiques avec une résolution et une complexité variables.

La première étape de la modélisation des ligands dans les cartes cryoEM comprend l’identification de la densité du ligand (non-protéine) dans la carte. Si la liaison du ligand n’induit aucun changement de conformation dans la protéine, le calcul d’une simple carte de différence entre le complexe protéine-ligand et l’apo-protéine met essentiellement en évidence les régions de densité supplémentaire, suggérant la présence du ligand. De telles différences peuvent être observées immédiatement, car il suffit de deux cartes, et même des cartes intermédiaires pendant le processus de raffinement 3D peuvent être utilisées pour vérifier si le ligand est présent. De plus, si la résolution est suffisamment élevée (<3,0 Å), la carte des différences peut également fournir des informations sur l’emplacement des molécules d’eau ainsi que des ions interagissant avec le ligand et les résidus protéiques.

En l’absence de la carte apo-protéine, il est maintenant possible d’utiliser Servalcat22, qui est disponible en tant qu’outil autonome et a également été intégré dans la suite logicielle CCP-EM 23,24 dans le cadre du raffinement de Refmac et dans CCP4 8.0 version25,26. Servalcat permet le calcul d’une carte de différence pondérée FSC (Fo-Fc) en utilisant les demi-cartes non nettes et le modèle d’apoprotéine comme entrée. La carte omise Fo-Fc représente la disparité entre la carte expérimentale (Fo) et la carte dérivée du modèle (Fc). En l’absence d’un ligand dans le modèle, une densité positive dans une carte Fo-Fc qui chevauche la carte EM expérimentale suggère généralement la présence du ligand. L’hypothèse ici est que la chaîne protéique est bien ajustée sur la carte, et que la densité positive restante indique l’emplacement du ligand. Cependant, il est important d’examiner méticuleusement si la densité positive provient d’inexactitudes de modélisation, telles que le mauvais rotamère d’une chaîne latérale de protéines.

La deuxième étape consiste à obtenir ou à créer un fichier de coordonnées cartésiennes du ligand avec une géométrie bien définie à partir des informations chimiques disponibles. Les ligands standard (par exemple, ATP et NADP+) qui sont déjà disponibles dans la bibliothèque de monomères CCP4 peuvent être utilisés pour le raffinement en récupérant les fichiers de coordonnées et de géométrie via leur code d’accession de monomère. Cependant, pour les ligands inconnus ou non standard, divers outils sont disponibles pour créer les fichiers de géométrie. Parmi les exemples, citons l’eLBOW27 - (constructeur de ligands électroniques et atelier d’optimisation) dans Phenix28, Lidia - un outil intégré dans Coot29, JLigand/ACEDRG30,31, CCP-EM23,24, Ligprep32-un module de Glide au sein de la suite Schrödinger. Le fichier de coordonnées du ligand est ensuite ajusté dans la densité, guidé à la fois par la carte expérimentale cryoEM et la carte de différence dans Coot. Vient ensuite le raffinement dans l’espace réel dans Phenix28 ou le raffinement réciproque dans Refmac33. Un poste de travail Linux ou un ordinateur portable équipé d’une bonne carte graphique et des logiciels mentionnés ci-dessus est nécessaire. La plupart de ces programmes sont inclus dans diverses suites. CCP-EM24 et Phenix28 sont disponibles gratuitement pour les utilisateurs universitaires et incluent une variété d’outils qui sont utilisés dans cet article, notamment Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, etc. De même, Chimera37 et ChimeraX38 fournissent des licences gratuites aux utilisateurs universitaires.

Protocole

1. Modélisation du phosphoénolpyruvate (PEP) dans l’énolase de Mycobacterium tuberculosis

  1. Identification de la densité des ligands dans la carte cryoEM du complexe PEP-énolase
    1. Téléchargez les demi-cartes non affûtées (emd_30988_additional_1.map et emd_30988_additional_2.map) de l’apo-énolase à partir des données supplémentaires dans EMDB (voir Tableau des matériaux).
    2. Ouvrez ChimeraX (voir la Table des matériaux). Ouvrez les demi-cartes d’apo-enolase en cliquant sur Ouvrir dans la barre d’outils et en sélectionnant les noms de fichiers. Tapez vop add #1 #2 dans la ligne de commande pour combiner les deux demi-cartes afin d’obtenir la carte non aiguisée apo-énolase.
      REMARQUE : #1 et #2 désignent les deux demi-cartes de l’enzyme apo-énolase, comme mentionné à l’étape 1.1.1.
    3. Renommez la carte combinée (ID de carte ChimeraX : #3) en tapant rename #3 Apo-enolase-unsharpened-map. Colorez la carte en gris à partir du panneau du modèle. L’application indique que l’énolase est octamérique dans la solution avec une symétrie D4.
    4. Répétez les étapes 1.1.1-1.1.3 en utilisant les demi-cartes suivantes emd_30989_additional_1.map (ID de la carte : 4) et emd_30989_additional_2.map (ID de la carte : 5) pour obtenir la carte PEP-enolase-unsharpened-map (ID de la carte : #6).
    5. Afin de calculer une carte de différence, ajustez d’abord les deux cartes (cartes non nettes PEP-énolase et apo-énolase des étapes 1.1.3 et 1.1.4) l’une sur l’autre en cliquant sur Ajuster (carte dans la carte) dans le panneau Carte (barre d’outils) de ChimeraX.
      REMARQUE : La normalisation n’est pas effectuée entre les deux cartes. Dans certains cas, une normalisation peut être nécessaire pour amener les cartes à la même échelle.
    6. Soustrayez la carte PEP-énolase de la carte apo-énolase en tapant vop subtract #6 #3 dans la ligne de commande.
      REMARQUE : #6 = Carte non affûtée PEP-énolase, #3 = Carte non affûtée Apo-énolase.
    7. Coloriez la carte soustraite (ID de la carte :7) en vert, indiquant une densité positive (selon la convention en cristallographie aux rayons X)39.
    8. Téléchargez les coordonnées de l’énolase octamérique de M. tuberculosis (PDB : 7e4x) à partir de la Banque de données protéiques (PDB), cliquez sur ouvrir dans la barre d’outils et sélectionnez le nom du fichier.
    9. Renommez le modèle 7e4x.pdb en tapant rename #8 Apo_enolase.pdb dans la ligne de commande. #8 désigne le Apo_enolase.pdb dans ChimeraX.
    10. Sélectionnez le modèle dans le panneau du modèle. Cliquez sur le bouton droit de la souris dans la barre d’outils. Cliquez sur Déplacer la molécule pour positionner le modèle à proximité de la carte PEP-énolase (#6) et aligner le modèle par rapport à la carte. Insérez ce modèle dans la carte PEP-enolase-unsharpened-en tapant fit #8 dans #6 dans la ligne de commande. Ici, la carte est numérotée 6 et le modèle est numéroté 8.
      REMARQUE : Dans certains cas, l’ajustement local dans ChimeraX peut ne pas être suffisant pour aligner le modèle. Dans ces cas, une étape supplémentaire d’ajustement global (DockinMap, voir Table des matériaux) peut être réalisée dans Phenix.
    11. Enregistrez le modèle ajusté en tapant save Apo-enolase.pdb #8 dans la ligne de commande.
  2. Modélisation et affinement de la PEP dans la carte cryoEM aiguisée du facteur B du complexe PEP-énolase
    1. Ouvrez « coot » (voir Table des matériaux) depuis le terminal en tapant ./Coot &.
    2. Affichez « Apo-enolase.pdb » en cliquant sur Fichier > Ouvrir les coordonnées Apo-enolase.pdb. Le fichier de coordonnées est affiché par des liaisons (couleur par atome).
    3. Téléchargez la carte affûtée Enolase liée au PEP, c’est-à-dire emd_30989.map depuis EMDB. Affichez la même chose en cliquant sur Fichier > Ouvrir la carte > emd_30989.map . Réglez le seuil sur 7,00 σ en faisant défiler le bouton central de la souris.
    4. Recherchez des objets blob non modélisés en cliquant sur Valider > Objets blob non modélisés > Rechercher des objets blob.
    5. Localisez la densité de ligand non modélisée près des résidus du site actif, Ser 42, Lys-386 et Arg-364 du modèle énolase.
    6. Obtenez le fichier du modèle de monomère PEP à partir de la bibliothèque de monomères Coot en cliquant sur Fichier > Obtenir le monomère et en entrant PEP comme code à 3 lettres.
    7. Déplacez la molécule PEP jusqu’à la densité à l’aide de l’option Rotation/Translation - Zone/Chaîne/Molécule dans le menu latéral. Utilisez le raffinement de l’espace réel dans Coot pour ajuster la molécule PEP dans la densité en cliquant sur Zone d’amélioration de l’espace réel dans le menu latéral. Fusionnez le ligand ajusté avec le fichier Apo-enolase.pdb en utilisant l’option de fusion de la molécule dans l’onglet d’édition . Enregistrez le modèle sous le nom PEP-Enolase.pdb.
      REMARQUE : On peut également utiliser ligand> l’option Jiggle-Fit Ligand pour s’adapter également au ligand.
    8. Pour ajouter des ligands au reste des monomères dans le fichier de coordonnées, cliquez sur Calculer > outils NCS > ligands NCS. Une fenêtre distincte nommée Trouver les ligands liés au NCS apparaîtra. Pour l’option Protéine avec NCS, sélectionnez le fichier de coordonnées Apo-enolase.pdb et l’ID de chaîne A comme Chaîne maîtresse NCS.
      1. Pour la molécule contenant le ligand, sélectionnez Apo-enolase.pdb comme fichier de coordonnées et l’ID de chaîne, J et le numéro de résidu 1 à 1. Cliquez sur Trouver des postes candidats. Une fenêtre nommée Ligands ajustés apparaîtra avec une liste de postes candidats. Évaluez l’ajustement en cliquant sur les ligands candidats individuels et analysez l’ajustement visuellement.
        NOTE : Dans Servalcat/Refmac, seul un modèle monomère peut être fourni, et la symétrie utilisée dans la reconstruction peut être donnée pour obtenir un modèle étendu.
    9. Une densité supplémentaire pour les molécules de solvant a également été observée près du ligand. Les structures cristallines à haute résolution de l’énolase provenant de divers homologues suggèrent la présence de deux ions Mg2+ 40,41, ce qui stabilise probablement la charge négative de l’intermédiaire de la réaction. Modélisez deux ions Mg2+ dans la densité du site actif en cliquant sur placer l’atome au pointeur et en sélectionnant MG dans la liste du type d’atome du pointeur.
      REMARQUE : La géométrie et la distance de liaison peuvent être utilisées comme guide pour sélectionner l’ion métallique. Dans le cas du Mg2+ lié aux atomes d’oxygène dans les résidus protéiques, la distance de liaison varie entre 2,1 Å -2,4 Å, avec une géométrie octaédrique. Cependant, dans le cas de cartes à faible résolution, la sphère de coordination est souvent incomplète, et la distance peut également varier en raison des limitations de la résolution.
    10. Répétez l’étape 1.2.8 afin d’ajouter les ions Mg2+ dans les monomères liés à la symétrie.
    11. Enregistrez le modèle en cliquant sur Fichier > Enregistrer les coordonnées > Sélectionner le nom de fichier > et en tapant Enolase+PEP+Mg.pdb.
    12. Ouvrez l’interface graphique de Phenix (voir la table des matériaux). Exécutez un véritable travail d’affinement de l’espace avec Enolase+PEP+Mg.pdb et le emd_30989.map comme modèle d’entrée et comme carte, respectivement, à l’aide des paramètres par défaut. Cette étape est effectuée de manière itérative avec Coot pour obtenir un bon ajustement et une bonne géométrie du modèle de carte.
      REMARQUE : La carte de différence non accentuée est utilisée pour démontrer la présence d’un ligand, par exemple dans une figure. À des fins de modélisation, la carte affinée du facteur B a été utilisée et est recommandée. La carte affinée du facteur B peut également être utilisée pour calculer la carte de différence à des fins de démonstration, par opposition à la carte non nette. Cependant, si la résolution est plus faible dans la région où le ligand est lié, le facteur B unique utilisé pour affiner l’ensemble de la carte peut ne pas révéler clairement la densité du ligand.
  3. Visualisation et génération de figures du ligand modélisé
    1. Ouvrez le modèle raffiné Enolase+PEP+Mg à partir de la dernière tâche de raffinement de Phenix dans PyMOL42 (voir la table des matériaux) en cliquant sur Fichier > Ouvrir et en sélectionnant le nom du fichier.
    2. Chargez le fichier emd-30989.map (carte accentuée liée à PEP) en cliquant sur Fichier > Ouvrir et en sélectionnant le nom du fichier.
    3. Renommez la carte en fonction de la fonction PEP en cliquant sur les actions > renommer en fonction de l’objet emd_30989 et en tapant PEP-sharpened.
      REMARQUE : Dans la plupart des cas, par exemple enolase, les cartes lorsqu’elles sont ouvertes dans pymol sont normalisées car l’option normaliser la carte est cochée par défaut dans pymol. Comme les cartes cryoEM sont centrées sur une boîte plus grande, la normalisation inclura tout ce qui se trouve dans la boîte. Ainsi, la normalisation peut être désactivée avant l’ouverture dans pymol.
    4. Sélectionnez les ligands en cliquant sur afficher > séquence.
    5. Tapez isomesh mesh_ligands, PEP-sharpened, 6.0, sele, carve=3.0 dans la ligne de commande et appuyez sur Entrée.
    6. Coloriez le mesh_ligand en bleu en cliquant sur la dernière case, C, à côté de l’objet mesh_ligand.
    7. Affichez les résidus du site actif, Ser-42, Asp-241, Glu-283, Asp-310, Arg-364 et Lys-386 interagissant avec le PEP et le Mg2+ dans la représentation en bâtonnet et en sphère, respectivement, et l’enzyme énolase dans la représentation de dessin animé.
    8. Lancez les rayons en tapant ray 3600, 3600 pour générer des images de qualité publication et enregistrez-les en tant que fichier png en cliquant sur Fichier > enregistrer et en choisissant PEP.png comme nom de fichier.

2. Modélisation des ligands dans le récepteur métabotropique du glutamate mGlu5

  1. Identification et modélisation de la densité des ligands dans la carte cryoEM de mGlu lié à l’agoniste et à l’antagoniste5
    1. Téléchargez les deux demi-cartes ainsi que leurs fichiers de coordonnées correspondants pour chacun des complexes mGlu5 liés à l’agoniste (EMD-31536, 7fd8.pdb) et à l’antagoniste (EMD-31537,7fd9.pdb).
    2. Ouvrez ChimeraX
      1. Ouvrez le fichier de coordonnées 7fd8.pdb en cliquant sur Ouvrir et en sélectionnant 7fd8.pdb.
      2. Tapez delete ligand dans la ligne de commande et appuyez sur Entrée.
      3. De même, utilisez la commande delete/B pour supprimer la chaîne B.
        REMARQUE : Les ligands et les chaînes peuvent être supprimés à l’aide du menu déroulant en haut à l’aide de select et actions > atomes/liaisons > supprimer.
      4. Enregistrez la pdb non ligandée en tapant ce qui suit dans la ligne de commande : save 7fd8_noligand_chainA.pdb #1. #1 désigne l’ID du modèle.
      5. Répétez les étapes 2.1.2.1-2.1.2.4 pour 7fd9.pdb.
    3. Ouvrez CCP-EM. Créez un nouveau projet nommé mGlu5 et spécifiez le répertoire et le nom d’utilisateur du projet.
      1. Ouvrez Relion à partir des options du panneau de gauche.
        1. Allez dans l’onglet Création de masques .
        2. Fournissez l’une des demi-cartes pour EMD-31536 en entrée.
          REMARQUE : Relion accepte les cartes avec .mrc comme suffixe, et les cartes EMD ont le suffixe .map. Les fichiers de carte peuvent être ouverts dans ChimeraX pour examen et enregistrés au format .mrc.
        3. Dans l’onglet masque , indiquez la taille de pixel 0,89 Å et le seuil de binarisation initial 0,007.
        4. Exécutez le travail avec l’alias 31536 (ou tout autre nom facile à suivre).
        5. De même, créez un masque pour la demi-carte EMD - 31537.
      2. Ouvrez le programme Refmac Servalcat à partir des options du panneau de gauche de CCPEM.
        1. Indiquez le nom mGlu5_agonist.
        2. Importez le fichier .pdb 7fd8_noligand_chainA comme décrit dans la section 2.1.2.4 du modèle. Indiquez l’emplacement des deux demi-cartes et du masque correspondant créé dans Relion.
        3. Spécifiez la résolution de 3,8 Å.
        4. Allez dans les paramètres de raffinement > Symétrie stricte et mentionnez C2 comme symétrie du groupe de points Relion.
        5. Démarrez le programme en appuyant sur le bouton de démarrage en haut.
    4. Une fois le travail terminé, ouvrez le résultat dans Coot (option disponible en haut dans la section des résultats). Cela affichera un diffmap.mtz dans Coot par défaut, où les couleurs rouge et vert indiquent respectivement les densités négatives et positives.
      1. Allez dans le gestionnaire d’affichage > propriétés de la carte de différence étiquetée DELFWT PHDELWT et modifiez le niveau de contour à 4.0 (valeur absolue).
        REMARQUE : Le choix du seuil dépend de la carte et de la résolution.
      2. Masquez la carte étiquetée FWT PHWT et la molécule étiquetée refined.pdb.
      3. Déplacez la carte à l’aide de la souris pour visualiser la densité positive (colorée en vert) et amenez la plus grosse goutte au centre.
      4. Allez dans Fichier > Obtenir le monomère, tapez QUS et appuyez sur Entrée.
      5. Allez à Calculer > modélisation > molécule Rigid Body Fit et double-cliquez sur le monomère QUS pour ajuster la molécule afin qu’elle s’adapte à la densité Fo-FC.
      6. Utilisez l’option de fusion de la molécule dans l’onglet Modifier pour ajouter la molécule QUS au fichier de coordonnées, refined.pdb.
      7. Répétez les étapes 2.1.4.3-2.1.4.6 pour ajuster le ligand avec le code monomère NAG et CHS dans la plus petite goutte dans le domaine extracellulaire et au sommet du domaine transmembranaire, respectivement.
      8. Enregistrez les coordonnées sous le nom refined_ligands.pdb.
        REMARQUE : La résolution du domaine transmembranaire (TM) est plus faible, et donc, elle n’est pas abordée ici.
  2. Raffinement de la structure ligandée mGlu5
    1. Ouvrez CCPEM et clonez la tâche d’affinement précédente (étape 2.1.3.2) et exécutez-la avec le fichier refined_ligands.pdb et la carte affinée (emd. 31536.mrc) en entrée, en utilisant les paramètres par défaut et la symétrie C2.
      REMARQUE : Si le programme ne reconnaît pas le ligand, les fichiers CIF doivent être fournis. Ces fichiers CIF peuvent être téléchargés à partir de la base de données pluggable ou générés à l’aide de divers programmes (voir l’étape 3.1.1 pour plus de détails).
  3. Visualisation et génération de figures dans PyMOL
    1. Ouvrez le modèle refined_expanded.pdb à partir de la dernière tâche d’affinement Refmac dans PyMOL.
    2. Allez dans Fichier > Ouvrir et naviguez jusqu’au répertoire des tâches Refmac pour charger le fichier diffmap_normalised_fofc.mrc (carte des différences par rapport à la tâche Servalcat à l’étape 2.1.3.2).
      REMARQUE : Si les fichiers d’extension .mrc ne sont pas visibles lors de la navigation, changez le type de fichier en Tous les fichiers et parcourez.
    3. Sélectionnez les ligands à l’aide de l’affichage > séquence.
    4. Allez dans le bouton Actions et renommez la sélection en ligands.
    5. Tapez ce qui suit dans la ligne de commande et appuyez sur Entrée : isomesh mesh_ligands, diffmap_normalised_fofc, 6.0, ligands, carve=2.5.
      REMARQUE : La largeur du maillage peut être ajustée. Ici, une largeur de maille de 0,2 est utilisée, et elle est définie à l’aide de la commande suivante : set mesh_width=0.2.
    6. Faites un clic droit sur l’un des monomères et allez enchaîner > couleur pour spécifier la couleur de chaque monomère. Colorez le ligand et le maillage à l’aide de la dernière case étiquetée c dans les objets ligand et mesh_ligands. Le dimère du récepteur mGlu5 est représenté dans une représentation de dessin animé, et les monomères sont colorés en sarcelle et en blé. Les ligands sont représentés en bâton et le maillage qui contourne les ligands est de couleur verte.
    7. Utilisez les actions > l’option orienter/centrer/zoom contre les objets et ajustez manuellement pour visualiser le maillage et clairement. Sélectionnez les résidus à proximité qui pourraient interagir avec le ligand, par exemple, Tyr64, Trp100 pour QUS, et si nécessaire, affichez leur chaîne latérale ou leur chaîne principale ou les deux sous forme de représentation bâton.
    8. Ray trace pour générer des images haute résolution et les enregistrer sous forme de fichier png.
      REMARQUE : Les étapes ci-dessus sont répétées pour la carte liée à l’antagoniste EMD-31537 et le fichier de coordonnées correspondant PDB-7fd9.

3. Modélisation de l’inhibiteur, de la désoxygalacto-nojirimycine (DGN) et des molécules de solvant dans une carte affinée à haute résolution de la β-galactosidase

  1. Identification du ligand, DGN, à l’aide des demi-cartes de cryoEM
    1. Préparation d’un dictionnaire de ligands inconnus pour la modélisation [Deoxygalacto-nojirimycin(DGN)]
      REMARQUE : Le fichier du dictionnaire Deoxygalacto-nojirimycin est inclus dans la bibliothèque de monomères CCP4 en tant que DGJ (ID de ligand à 3 lettres). Néanmoins, il est considéré ici comme un ligand nouveau et inconnu pour illustrer le processus de génération de fichiers de dictionnaire pour des ligands inconnus, DGN est utilisé comme code à 3 lettres.
      1. Ouvrez le résumé du composé désoxygalacto-nojirimycine (DGN) sur la page Web de PubChem et copiez la chaîne de sourires pour le composé désoxygalacto-nojirimycine.
      2. Ouvrez Phenix > ligands > eLBOW.
      3. Spécifiez la chaîne smiles en entrée.
      4. Spécifiez la méthode d’optimisation de la construction de ligands appropriée. Ici, une optimisation simple est utilisée.
      5. Collez la chaîne de sourires chimiques dans la section de définition du ligand.
      6. Fournissez un titre de poste, un préfixe de fichier de sortie et un ID de ligand de manière appropriée, puis appuyez sur exécuter.
        REMARQUE : La sortie du travail contient un fichier de coordonnées, DGN.pdb, et un fichier de dictionnaire, le fichier DGN.cif. Jligand29 peut également être utilisé pour créer le fichier cif.
    2. Téléchargez le fichier de coordonnées de la β-galactosidase (6tsh.pdb) à partir de la PDB et supprimez les coordonnées des chaînes protéiques (B, C, D), du ligand, du DGN et d’autres molécules de solvant à l’aide d’un éditeur de texte ou de l’option de suppression de chaîne/zone dans Coot. Enregistrez le fichier de coordonnées sous le nom apo-betaGal_chainA.pdb.
      REMARQUE : ChimeraX ou Pymol peuvent également être utilisés pour éliminer la molécule de ligand/solvant.
    3. Téléchargez les demi-cartes (emd_10563_half_map_1.map et emd_10563_half_map_2.map) à partir des données supplémentaires de l’entrée EMD-10563 de l’EMDB.
    4. Ouvrez CCPEM et utilisez Relion pour créer le masque de la carte à un seuil de 0,01 (comme décrit aux étapes 2.1.3.1.1-2.1.3.1.4).
    5. Exécutez Servalcat (dans la suite CCPEM comme décrit à l’étape 2) avec les demi-cartes obtenues à l’étape 3.1.3 et l’apo-model à l’étape 3.1.2 et la symétrie D2.
      REMARQUE : Le modèle doit être aligné sur l’une des demi-cartes ou des cartes complètes pour localiser la densité de ligand. Cela peut être fait en ajustant le modèle dans la carte à l’aide de ChimeraX, puis en enregistrant les coordonnées par rapport à la demi-carte. Dans cet exemple, les demi-cartes et la carte principale dans EMDB ont des tailles de boîte/grilles différentes, et le modèle doit être placé dans la demi-carte.
    6. Ouvrez Coot.
      1. Ouvrez le fichier DGN.cif pour le dictionnaire de ligands généré à l’étape 3.1.1 avec Phenix eLBOW. Pour ce faire, il suffit d’aller dans Fichier > Importer le dictionnaire CIF et de parcourir le répertoire des tâches eLBOW.
      2. Ouvrez les fichiers de coordonnées de protéine et de ligand, apo-betaGal_chainA.pdb à partir de l’étape 3.1.2 et DGN.pdb à partir de l’étape 3.1.6 respectivement.
      3. Ouvrez automatiquement le fichier diffmap.mtz à partir de la tâche Servalcat (étape 3.1.5) et visualisez la carte étiquetée DELFWT PHDELWT dans Coot. Contournez la carte à un seuil de ~ 4 valeur absolue.
        REMARQUE : Il est important de vérifier les statistiques de la carte en tapant l’en-tête map.mrc ou en utilisant les outils de Chimera. Toutes les informations nécessaires sur la taille des pixels, la taille de la boîte, la densité minimale, moyenne et maximale et l’écart efficace par rapport à la densité moyenne peuvent être obtenues. Il est crucial de vérifier la taille des pixels et la taille de la boîte des cartes cryoEM. La carte 3D représente le volume de la carte protéine-ligand dans une grille de voxels 3D. Dans chaque voxel, la valeur du potentiel électronique ou la probabilité de trouver l’électron à cet endroit est stockée. Lorsqu’un certain seuil est choisi, les voxels, qui ont une densité inférieure à la valeur spécifiée, sont mis à zéro. Cela permet de minimiser le bruit expérimental sur la carte et de mieux visualiser les caractéristiques de la carte43. Ainsi, la carte doit être profilée à un seuil où les caractéristiques de la carte sont facilement visibles et où le bruit sur la carte est minimal.
      4. Allez dans Ligand > trouver des ligands. Dans la nouvelle fenêtre qui apparaît, sélectionnez ligand, la carte des différences et le modèle apo-betaGal_chainA.pdb. Laissez les autres options à leurs paramètres par défaut et cliquez sur Trouver des ligands pour lancer la recherche.
      5. Une liste des meilleurs résultats indiquant la densité potentielle des ligands est affichée avec une copie placée dans chacune des densités. Vérifiez manuellement tous les coups où le ligand a été placé. Gardez les résultats les plus probables et supprimez les ambigus.
        REMARQUE : La différence de densité de la carte à un seuil élevé suggère clairement la présence du ligand dans le site actif.
  2. Modélisation du ligand DGN et des molécules de solvant
    1. Effectuez un raffinement réel de l’espace dans Coot pour ajuster le ligand (DGN.pdb) dans la carte de densité différentielle, puis fusionnez les coordonnées du ligand avec le fichier apo-betaGal_chainA.pdb et enregistrez-le sous le nom betaGal_chainA+ligand.pdb.
      REMARQUE : Les ligands qui ont été placés dans des régions d’autres chaînes peuvent être supprimés et ne sont pas fusionnés lors de l’enregistrement du fichier de coordonnées fusionné. Les ligands d’autres chaînes peuvent être générés par des ligands NCS comme le montre l’exemple 1, étape 1.2.8, ou dans Refmac/Servalcat en utilisant l’expansion de symétrie.
    2. Exécutez un autre job Servalcat comme ci-dessus (étape 3.1.5) avec betaGal_chainA+ligand.pdb comme modèle d’entrée et les demi-cartes (à partir de l’étape 3.1.3) avec une symétrie D2.
    3. La différence de densité (d’après le travail Servalcat à l’étape 3.2.2) entourant le ligand modélisé suggère la présence des molécules de solvant se coordonnant avec la molécule de ligand. La densité centrale proche du ligand semble être trop grande pour les molécules d’eau.
    4. Sur la base de données biochimiques et structurales antérieures indiquant la présence de Mg2+ à cette position, l’ion Mg2+ est modélisé ici en cliquant sur l’option placer l’atome et en spécifiant l’atome comme MG.
    5. Modélisez les molécules d’eau dans la différence de densité dans le site actif qui indiquent la présence d’une molécule de solvant en cliquant sur l’atome placé au pointeur et en sélectionnant l’eau.
      REMARQUE : Coot a également la possibilité de prélever automatiquement les molécules d’eau. Ici, comme l’accent est mis uniquement sur le site actif, les molécules d’eau sont ajoutées manuellement.
    6. Fusionnez les coordonnées de Mg2+ et de water avec le fichier betaGal+ligand.pdb et enregistrez-le sous le nom betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb.
    7. Avec le fichier betaGal+ligand+solvent_chainA.pdb, effectuez le raffinement Refmac dans Servalcat avec une symétrie D2.
      REMARQUE : La carte de différence de sortie de ce travail peut servir de moyen de valider si le ligand a été modélisé avec précision, car la carte de différence doit montrer une densité résiduelle positive ou négative minimale.
  3. Visualisation et génération de figures avec PyMOL
    REMARQUE : Les étapes décrites ci-dessous fournissent quelques exemples de fabrication de figures à l’aide de modèles et de cartes qui peuvent être utilisés pour illustrer la présence de ligands et de solvants.
    1. Ouvrez le fichier refined_expanded.pdb de la dernière tâche Servalcat (étape 3.2.6) avec le ligand et le solvant modélisés.
    2. Sélectionnez différentes chaînes séparément pour les colorer en magenta, jaune, vert et sarcelle, comme décrit dans l’exemple 2.
    3. Allez dans Afficher > séquence, effectuez des sélections distinctes pour les molécules d’eau, le magnésium et le DGN, et renommez les objets en eau, MG et DGN, respectivement.
    4. Affichez les molécules de MG et d’eau sous forme de sphères en sélectionnant les objets, en cliquant avec le bouton droit de la souris et en affichant > sphère. De même, affichez le ligand en forme de bâton et coloriez les ligands et les solvants de manière appropriée. Dans ce cas, le ligand a été coloré en jaune par un hétéroatome, l’ion magnésium est coloré en violet et les molécules d’eau sont colorées en rouge.
    5. Sélectionnez DGN, MG et molécules d’eau. Faites un clic droit et sélectionnez les actions > copier pour l’objet et le nommer en tant que ligands.
    6. Ouvrez le fichier diffmap_normalised_fo.mrc à partir de la tâche Servalcat à l’étape 3.2.6 et renommez-le ligand_fo.mrc. Tapez la commande suivante : isomesh mesh_ligands_fo, ligand_fo, 3, ligands, carve=2.
      REMARQUE : L’option de sculpture de 2 Å est appliquée autour des atomes, et en fonction de la résolution et de la qualité des cartes, des valeurs de 3 à 5 peuvent être utilisées. De plus, lors de l’ouverture des cartes cryoEM dans PyMOL, il est conseillé de normalize_ccp4_maps désactiver .
    7. Utilisez les actions > options d’orientation/zoom et ajustez manuellement pour visualiser les ligands et les résidus en interaction à proximité (le cas échéant), comme indiqué à l’étape 2.3.7.
    8. Tracez ces scènes pour enregistrer des images haute résolution à l’aide de la commande ray 3600, 3600.
    9. Enregistrez la scène en tant que fichier .png.
      REMARQUE : Les étapes suivantes sont facultatives et décrivent le processus de visualisation (1) de la différence de densité (Fo-Fc) pour le ligand non modélisé, DGN, (2) de la masse volumique (Fo) du ligand modélisé, DGN ainsi que de la différence de densité (Fo-Fc) pour les solvants non modélisés et enfin pour (3) la masse volumique (Fo) du ligand modélisé, DGN et des molécules de solvant dans le site actif.
    10. Pour démontrer la présence du ligand, du DGN et des molécules de solvant environnantes à l’aide de la carte de différences, ouvrez diffmap_normalised_fofc.mrc à partir de la tâche Servalcat à l’étape 3.1.5. Renommez le fichier de mappage unliganded_fofc.mrc en cliquant sur actions > renommer en regard de l’objet de mappage. Tapez ce qui suit dans la ligne de commande : isomesh mesh_ligands_fofc, unliganded_fofc, ligands, level=6, carve=2.
    11. Pour démontrer la densité du ligand modélisé, DGN, et la densité de solvant non modélisée environnante, ouvrez le fichier diffmap_normalised_fo.mrc ainsi que le fichier diffmap_normalised_fofc.mrc à partir de la tâche servalcat à l’étape 3.2.2. Renommez le diffmap_normalised_fo.mrc en DGN_fo et le diffmap_normalised_fofc.mrc en DGN_unmodelled_solvents_fofc.
    12. Sélectionnez MG et eau dans Affichage > séquence, cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez les actions > copier sur l’objet et nommez-les comme solvants.
    13. Tapez ce qui suit dans la ligne de commande : isomesh mesh_DGN_fo, DGN_fo, DGN, level=3, carve=2 ; isomesh mesh_solvent_fofc, DGN_unmodelled_solvents_fofc, solvants, level=6, carve=2.
      REMARQUE : Le mesh_DGN_fo indiquera la densité du ligand et le mesh_solvent_fofc montrera la densité omise pour le MG et l’eau.
    14. Enfin, pour visualiser les ligands modélisés ainsi que les molécules de solvant environnantes dans le site actif, ouvrez le fichier diffmap_normalised_fo.mrc à partir du job Servalcat à l’étape 3.2.6 et renommez-le en ligand_fo.mrc.
    15. Tapez ce qui suit dans la ligne de commande : isomesh mesh_ligand_fo, ligand_fo, selection=ligands, level=3, carve=2.
      REMARQUE : Ici, nous avons utilisé diffmap_normalised_fo.mrc, mais la carte finale affinée peut être utilisée pour montrer la densité des ligands et des résidus environnants. Il est recommandé de mentionner le type de carte utilisé, les valeurs de netteté du facteur B dans la légende de la figure.
    16. La largeur du maillage et la taille de la sphère peuvent être définies en tapant les commandes suivantes : set mesh_width=0.2 et set sphere_scale=0.25 pour réduire la taille de la sphère.
    17. Colorez le maillage fo en bleu et le maillage fofc en vert.
    18. Utilisez les actions > options d’orientation/zoom et ajustez manuellement pour visualiser les ligands et les résidus en interaction à proximité (le cas échéant), comme indiqué à l’étape 2.3.7.
    19. Tracez ces scènes pour enregistrer des images haute résolution à l’aide de la commande ray 3600, 3600.
    20. Enregistrez les scènes individuelles sous forme de fichiers .png.

4. Effet de la résolution sur la modélisation des ligands dans la β-galactosidase

  1. Ouvrez Terminal et allez dans le répertoire contenant les deux demi-cartes.
  2. Ouvrez les deux demi-cartes (étape 3.1.3) au format .map dans ChimeraX, visualisez-les et enregistrez-les sous emd10563_half1_1_unfil.mrc et emd10563_half2_1_unfil.mrc.
  3. Le masque créé à l’étape 3.1.4 peut être utilisé comme entrée.
  4. Exécutez une tâche de post-traitement dans Relion à l’aide des demi-cartes et des masques des étapes 4.2 et 4.3, avec les paramètres par défaut.
  5. Répétez l’étape 4.4, maintenant avec un Skip FSC-weighing activé et en spécifiant un filtre passe-bas ad-hoc de 3 Å.
  6. Répétez l’étape 4.4 avec un filtre passe-bas ad-hoc de 3,5 Å.
  7. Ouvrez les cartes (postprocess.mrc) des étapes 4.4 à 4.6, filtrez à différentes résolutions et le fichier de coordonnées du modèle, 6tsh.pdb (aligné sur les demi-cartes de ChimeraX) de l’étape 3.1.2 dans PyMOL. Renommez les différentes cartes 3.0, 3.5 et 2.3 en fonction de leurs résolutions.
    REMARQUE : On peut confirmer le filtrage passe-bas des cartes en les visualisant dans ChimeraX ou Coot.
  8. Visualisez l’effet de la résolution sur la densité des molécules de ligand et de solvant en créant un maillage de 2 Å autour des molécules de ligand et de solvant à un seuil de 6σ comme décrit à l’étape 3.3.6 avec des cartes filtrées à différentes résolutions.

Résultats

Exemple 1
L’enzyme énolase de M. tuberculosis catalyse l’avant-dernière étape de la glycolyse et convertit le 2-phosphoglycérate en phosphoénolpyruvate (PEP), qui est un intermédiaire essentiel pour plusieurs voies métaboliques44,45. Les données CryoEM pour les échantillons d’apo-énolase et d’énolase liée à la PEP ont été collectées à la même taille de pixel de 1,07 Å, et le traitement d’image a été effe...

Discussion

Les améliorations apportées au matériel et aux logiciels des microscopes ont entraîné une augmentation du nombre de structures cryoEM au cours des dernières années. Bien que la résolution la plus élevée atteinte à l’heure actuelle dans la cryoEM à particule unique soit de 1,2 Å 57,58,59, la majorité des structures sont déterminées autour de la résolution de 3-4 Å. La modélisation de ligands dans des cartes ?...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

SJ est récipiendaire d’une bourse de doctorat de DAE-TIFR, et le financement est reconnu. KRV reconnaît la subvention DBT B-Life DBT/PR12422/MED/31/287/2014 et le soutien du Département de l’énergie atomique du gouvernement de l’Inde, dans le cadre de l’identification du projet n°. RTI4006.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
CCP4-8.0Consortium of several instituteshttps://www.ccp4.ac.ukFree for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography
CCP-EMConsortium of several instituteshttps://www.ccpem.ac.uk/download.phpFree for academic users and includes Coot, Relion and many others
Coot Paul Emsley, LMB, Cambridgehttps://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/General software for model building but also available with other suites described above
DockinMap (Phenix)Consortium of several instituteshttps://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.htmlSoftware inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps
Electron Microscopy Data Bank Consortium of several instituteshttps://www.ebi.ac.uk/emdb/Public Repository for Electron Microscopy maps
FalconThermo Fisher Scientific https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdfCommercial, camera from Thermo Fisher 
Phenix Consortium of several instituteshttps://phenix-online.org/downloadFree for academic users and includes Coot
Protein Data BankConsortium of several instituteshttps://rcsb.orgPublic database of macromolecular structures
PymolSchrodingerhttps://pymol.org/2/Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.
RelionMRC-LMB, Cambridgehttps://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.htmlSoftware for cryoEM image processing, also available with CCP-EM
Titan KriosThermo Fisher Scientific https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&
gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA
AkZesWC4FYQSwIQRk
ZApkj08MfYG040DtiiuL8
RihoCebEQAvD_BwE		Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher
UCSF ChimeraUCSF, USAhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.htmlGeneral purpose software for display, analysis and more
UCSF Chimera XUCSF, USAhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/General purpose software for display, analysis and more

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