Modélisation de ligands dans des cartes dérivées de la cryomicroscopie électronique

Résumé

Ce protocole présente les outils disponibles pour la modélisation de ligands de petites molécules dans les cartes cryoEM des macromolécules.

Résumé

Déchiffrer les interactions protéine-ligand dans un complexe macromoléculaire est crucial pour comprendre le mécanisme moléculaire, les processus biologiques sous-jacents et le développement de médicaments. Ces dernières années, la microscopie électronique cryogénique d’échantillon (cryoEM) est apparue comme une technique puissante pour déterminer les structures des macromolécules et pour étudier le mode de liaison des ligands à une résolution proche de l’atome. L’identification et la modélisation de molécules non protéiques dans les cartes cryoEM sont souvent difficiles en raison de la résolution anisotrope de la molécule d’intérêt et du bruit inhérent aux données. Dans cet article, les lecteurs sont initiés à divers logiciels et méthodes actuellement utilisés pour l’identification des ligands, la construction de modèles et l’affinement des coordonnées atomiques à l’aide de macromolécules sélectionnées. L’une des façons les plus simples d’identifier la présence d’un ligand, comme illustré avec l’enzyme énolase, est de soustraire les deux cartes obtenues avec et sans le ligand. La densité supplémentaire du ligand est susceptible de se démarquer dans la carte des différences, même à un seuil plus élevé. Il y a des cas, comme le montre le cas du récepteur métabotropique du glutamate mGlu₅, où de telles cartes de différences simples ne peuvent pas être générées. La méthode récemment introduite pour dériver la carte d’omission Fo-Fc peut servir d’outil pour valider et démontrer la présence du ligand. Enfin, en utilisant l’exemple bien étudié de la β-galactosidase, l’effet de la résolution sur la modélisation des ligands et des molécules de solvant dans les cartes cryoEM est analysé, et une perspective sur la façon dont la cryoEM peut être utilisée dans la découverte de médicaments est présentée.

Introduction

Les cellules accomplissent leurs fonctions en effectuant d’innombrables réactions chimiques simultanément et indépendamment, chacune méticuleusement régulée pour assurer leur survie et leur adaptabilité en réponse aux signaux environnementaux. Ceci est réalisé par la reconnaissance moléculaire, qui permet aux biomolécules, en particulier aux protéines, de former des complexes transitoires ou stables avec d’autres macromolécules ainsi qu’avec de petites molécules ou des ligands¹. Ainsi, les interactions protéine-ligand sont fondamentales pour tous les processus de la biologie, qui comprennent la régulation de l’expression et de l’activité des pr....

Protocole

1. Modélisation du phosphoénolpyruvate (PEP) dans l’énolase de Mycobacterium tuberculosis

1. Identification de la densité des ligands dans la carte cryoEM du complexe PEP-énolase
   1. Téléchargez les demi-cartes non affûtées (emd_30988_additional_1.map et emd_30988_additional_2.map) de l’apo-énolase à partir des données supplémentaires dans EMDB (voir Tableau des matériaux).
   2. Ouvrez ChimeraX (voir la Table des matériaux). Ouvrez les demi-cartes d’apo-enolase en cliquant sur Ouvrir dans la barre d’outils et en sélectionnant les noms de fichiers. Tapez vop add #1 #2

Discussion

Les améliorations apportées au matériel et aux logiciels des microscopes ont entraîné une augmentation du nombre de structures cryoEM au cours des dernières années. Bien que la résolution la plus élevée atteinte à l’heure actuelle dans la cryoEM à particule unique soit de 1,2 Å 57,58,59, la majorité des structures sont déterminées autour de la résolution de 3-4 Å. La modélisation de ligands dans des cartes ?.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCP4-8.0	Consortium of several institutes	https://www.ccp4.ac.uk	Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography
CCP-EM	Consortium of several institutes	https://www.ccpem.ac.uk/download.php	Free for academic users and includes Coot, Relion and many others
Coot	Paul Emsley, LMB, Cambridge	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/	General software for model building but also available with other suites described above
DockinMap (Phenix)	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html	Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps
Electron Microscopy Data Bank	Consortium of several institutes	https://www.ebi.ac.uk/emdb/	Public Repository for Electron Microscopy maps
Falcon	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf	Commercial, camera from Thermo Fisher
Phenix	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/download	Free for academic users and includes Coot
Protein Data Bank	Consortium of several institutes	https://rcsb.org	Public database of macromolecular structures
Pymol	Schrodinger	https://pymol.org/2/	Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.
Relion	MRC-LMB, Cambridge	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html	Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE	Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher
UCSF Chimera	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html	General purpose software for display, analysis and more
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	General purpose software for display, analysis and more