Modellierung von Liganden in Karten aus der Elektronenkryomikroskopie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt die Werkzeuge vor, die für die Modellierung von niedermolekularen Liganden in KryoEM-Karten von Makromolekülen zur Verfügung stehen.

Zusammenfassung

Die Entschlüsselung der Protein-Liganden-Wechselwirkungen in einem makromolekularen Komplex ist entscheidend für das Verständnis des molekularen Mechanismus, der zugrunde liegenden biologischen Prozesse und der Arzneimittelentwicklung. In den letzten Jahren hat sich die kryogene Probenelektronenmikroskopie (KryoEM) zu einer leistungsfähigen Technik entwickelt, um die Strukturen von Makromolekülen zu bestimmen und die Art der Ligandenbindung mit nahezu atomarer Auflösung zu untersuchen. Die Identifizierung und Modellierung von Nicht-Protein-Molekülen in KryoEM-Karten ist aufgrund der anisotropen Auflösung über das interessierende Molekül und des inhärenten Rauschens in den Daten oft eine Herausforderung. In diesem Artikel werden die Leser mit verschiedenen Softwares und Methoden vertraut gemacht, die derzeit zur Identifizierung von Liganden, zur Modellerstellung und zur Verfeinerung atomarer Koordinaten unter Verwendung ausgewählter Makromoleküle verwendet werden. Eine der einfachsten Möglichkeiten, das Vorhandensein eines Liganden zu identifizieren, wie am Enzym Enolase dargestellt, besteht darin, die beiden Karten zu subtrahieren, die mit und ohne Liganden erhalten wurden. Die zusätzliche Dichte des Liganden wird wahrscheinlich auch bei einem höheren Schwellenwert in der Differenzkarte hervorstechen. Es gibt Fälle, wie im Fall des metabotrope Glutamatrezeptors mGlu₅ gezeigt, in denen solche einfachen Differenzkarten nicht erstellt werden können. Die kürzlich vorgestellte Methode zur Ableitung der Fo-Fc-Omit-Map kann als Werkzeug zur Validierung und Demonstration des Vorhandenseins des Liganden dienen. Schließlich wird am Beispiel der gut untersuchten β-Galactosidase der Effekt der Auflösung auf die Modellierung der Liganden und Lösungsmittelmoleküle in KryoEM-Karten analysiert und ein Ausblick darauf gegeben, wie KryoEM in der Wirkstoffforschung eingesetzt werden kann.

Einleitung

Zellen erfüllen ihre Funktionen, indem sie unzählige chemische Reaktionen gleichzeitig und unabhängig voneinander durchführen, die jeweils akribisch reguliert werden, um ihr Überleben und ihre Anpassungsfähigkeit als Reaktion auf Umwelteinflüsse zu gewährleisten. Dies wird durch die molekulare Erkennung erreicht, die es Biomolekülen, insbesondere Proteinen, ermöglicht, mit anderen Makromolekülen sowie kleinen Molekülen oder Liganden transiente oder stabile Komplexe zu bilden¹. Daher sind Protein-Liganden-Wechselwirkungen grundlegend für alle Prozesse in der Biologie, einschließlich der Regulation der Proteinexpression und -aktivität, der Erkenn....

Protokoll

1. Modellierung von Phosphoenolpyruvat (PEP) in Enolase aus Mycobacterium tuberculosis

1. Identifizierung der Ligandendichte in der KryoEM-Karte des PEP-Enolase-Komplexes
   1. Laden Sie die ungeschärften Halbkarten (emd_30988_additional_1.map und emd_30988_additional_2.map) von Apo-Enolase aus den zusätzlichen Daten in EMDB herunter (siehe Materialtabelle).
   2. Öffnen Sie ChimeraX (siehe Materialtabelle). Öffnen Sie die Halbkarten von apo-enolase, indem Sie in der Symbolleiste auf Öffnen klicken und die Dateinamen auswählen. Geben Sie vop add #1 #2 in die Befe....

Diskussion

Die Verbesserungen in der Mikroskop-Hard- und -Software haben in den letzten Jahren zu einer Zunahme der Anzahl von KryoEM-Strukturen geführt. Obwohl die derzeit höchste Auflösung, die in der Einzelpartikel-KryoEM erreicht wird, bei 1,2 Å 57,58,59 liegt, wird der Großteil der Strukturen mit einer Auflösung von etwa 3-4 Å bestimmt. Die Modellierung von Liganden in Karten mit mittlerer bis niedriger Auflösung kann schwieri.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCP4-8.0	Consortium of several institutes	https://www.ccp4.ac.uk	Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography
CCP-EM	Consortium of several institutes	https://www.ccpem.ac.uk/download.php	Free for academic users and includes Coot, Relion and many others
Coot	Paul Emsley, LMB, Cambridge	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/	General software for model building but also available with other suites described above
DockinMap (Phenix)	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html	Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps
Electron Microscopy Data Bank	Consortium of several institutes	https://www.ebi.ac.uk/emdb/	Public Repository for Electron Microscopy maps
Falcon	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf	Commercial, camera from Thermo Fisher
Phenix	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/download	Free for academic users and includes Coot
Protein Data Bank	Consortium of several institutes	https://rcsb.org	Public database of macromolecular structures
Pymol	Schrodinger	https://pymol.org/2/	Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.
Relion	MRC-LMB, Cambridge	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html	Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE	Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher
UCSF Chimera	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html	General purpose software for display, analysis and more
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	General purpose software for display, analysis and more