Imágenes de microscopía de fuerza atómica de alta velocidad del autoensamblaje del motivo de estrella de tres puntos del ADN mediante roscado fototérmico fuera de resonancia

Resumen

Aquí, mostramos el protocolo de imágenes para observar las interacciones biomoleculares con el golpeteo fototérmico fuera de resonancia (PORT), donde optimizamos los parámetros de imagen, identificamos los límites del sistema e investigamos posibles mejoras en el ensamblaje de motivos de ADN de estrellas de tres puntas.

Resumen

La microscopía de fuerza atómica de alta velocidad (HS-AFM) es una técnica de imagen molecular popular para visualizar procesos biológicos de una sola molécula en tiempo real debido a su capacidad para obtener imágenes en condiciones fisiológicas en entornos líquidos. El modo fototérmico de roscado por resonancia (PORT) utiliza un láser de accionamiento para hacer oscilar el voladizo de forma controlada. Este accionamiento directo en voladizo es eficaz en el rango de MHz. Combinado con el funcionamiento del bucle de retroalimentación en la curva de fuerza en el dominio del tiempo en lugar de la amplitud resonante, PORT permite la obtención de imágenes de alta velocidad a hasta diez fotogramas por segundo con control directo sobre las fuerzas de la muestra de la punta. Se ha demostrado que PORT permite la obtención de imágenes de dinámicas de ensamblaje delicadas y el seguimiento preciso de patrones formados por biomoléculas. Hasta ahora, la técnica se ha utilizado para una variedad de estudios dinámicos in vitro , incluidos los patrones de ensamblaje de motivos de estrellas de 3 puntos de ADN que se muestran en este trabajo. A través de una serie de experimentos, este protocolo identifica sistemáticamente la configuración óptima de los parámetros de imagen y los límites últimos del sistema de imagen HS-PORT AFM y cómo afectan a los procesos de ensamblaje biomolecular. Además, investiga los posibles efectos térmicos no deseados inducidos por el láser de accionamiento en la muestra y el líquido circundante, especialmente cuando el escaneo se limita a áreas pequeñas. Estos hallazgos proporcionan información valiosa que impulsará el avance de la aplicación del modo PORT en el estudio de sistemas biológicos complejos.

Introducción

La microscopía de fuerza atómica de alta velocidad (HS-AFM) es una técnica de imagen de rápido crecimiento 1,2,3,4. Opera a velocidades que permiten a los investigadores visualizar las interacciones biomoleculares en tiempo real 5,6,7,8,9. El golpeteo fototérmico fuera de resonancia (PORT) es un modo de imagen fuera de resonancia similar al golpeteo de fuerza máxima^10,11, el modo de fuerza pulsada^12,13 o el modo de salto¹⁴. Sin embargo, en lugar de hacer oscilar verticalmente el escáner, PORT oscila verticalmente solo el voladizo a través de un láser de excitación enfocado en el voladizo (generalmente cerca del punto de sujeción). El voladizo se deforma debido al efecto bimorfo: un láser de excitación de potencia modulada calienta periódicamente el voladizo revestido, que se dobla debido a los diferentes coeficientes de expansión térmica del voladizo y de los materiales de recubrimiento¹⁵. El calentamiento en voladizo y de muestras se puede minimizar mediante el uso de un láser de accionamiento que se apaga y se vuelve a encender periódicamente durante cada ciclo de oscilación, en lugar de utilizar un accionamiento sinusoidal completo⁵.

El ADN se ha utilizado para formar motivos biológicamente relevantes, estructuralmente interesantes y bioquímicamente útiles durante varios años 16,17,18,19,20. Además, se ha demostrado que las estructuras de ADN son ideales para caracterizar la calidad de imagen AFM²¹ y para evaluar el efecto punta de AFM²² de alta velocidad. Las estrellas de tres puntos de ADN de extremo romo (3PS) se volvieron prácticas como un sistema modelo programable para investigar la organización supramolecular de moléculas de estructura similar en sistemas biológicos complejos¹⁹. Anteriormente, el autoensamblaje de redes formadas por monómeros de ADN trimérico de extremo romo se rastreaba a través de HS-AFM²³. Eventualmente, estos se organizan en grandes redes con orden hexagonal. Aquí, el autoensamblaje de estrellas de 3 puntos de ADN¹⁹ se visualiza con la técnica PORT a velocidades de escaneo lo suficientemente rápidas como para rastrear el autoensamblaje y sus mecanismos de corrección²⁴, al tiempo que se garantiza una interrupción mínima del proceso o daño de la muestra. Al igual que con cualquier modo HS-AFM, existe un equilibrio entre la calidad de imagen alcanzable, la velocidad de imagen y la perturbación no deseada de la muestra. Al elegir el compromiso correcto, se pueden comprender mejor los patrones de autoorganización de los ensamblajes supramoleculares. Por lo tanto, este protocolo utilizará una configuración similar con DNA 3PS como sistema modelo para optimizar los parámetros específicos de PORT. Esto permitirá el funcionamiento a velocidades de imagen rápidas con tamaños de escaneo suficientemente grandes y al mismo tiempo minimizar el daño de la muestra.

Protocolo

1. Muestra y tampones

NOTA: El azulejo de ADN utilizado en este estudio es el motivo de la estrella de 3 puntas desarrollado en el laboratorio de Mao en la Universidad de Purdue^19,25. Todos los oligonucleótidos utilizados en este estudio se compraron a Integrated DNA Technologies, Inc. Reúna los materiales y reactivos necesarios.

1. Mezcle los ADN monocatenarios (ssDNA) en una proporción molar de 1:3:3 (S1 0,6 μM, 1,8 μM para S2 y 1,8 μM para S3) en el tampón de recocido (5 mM TRIS, 1 mM EDTA y 10 mM MgAc₂). La concentración final del motivo de ADN debe ser de 0,6 μM (49 ng/μL, con un peso molecular de 3PS de 82020,3 g/mol).
2. Coloque la solución de ADN en un recipiente resistente al calor y caliéntelo a 80 °C. Enfriar lentamente la solución de ADN de 80 °C a 20 °C durante un período de 4 h. Este proceso de recocido ayuda a los oligonucleótidos de ssDNA a formar el motivo de ADN bicatenario deseado.
3. Para la purificación, cargue la solución de ADN recocido en un gel de agarosa al 3% para eliminar el exceso de ssDNA y cualquier producto secundario no deseado. Haga funcionar el gel al 3% a 60 V durante aproximadamente 2,5 h en un tampón de funcionamiento que contenga 0,5x Tris-Borato-EDTA (TBE) y 10 mM Mg (CH₃COO)₂.
4. Identificar y localizar la banda en el gel que contiene el motivo de ADN. Asegúrese de que la banda haya migrado a una posición específica en función de su tamaño.
5. Extirpe cuidadosamente la banda que contiene el motivo de ADN del gel. Extraiga el motivo de ADN del fragmento de gel extirpado colocándolo en una columna de centrifugación de extracción de gel y centrifugando a 3.000 x g y 4 °C durante 10 min.
6. Reemplace el tampón en el motivo de ADN extraído con el tampón de recocido utilizando un concentrador centrífugo. Centrifugar a 3000 x g a temperatura ambiente (o inferior) hasta que la solución concentrada sea inferior a 100 μL. A continuación, añada 300 μL de tampón de recocido y repita este paso dos veces para asegurarse de que se sustituye el tampón.
7. Diluya el motivo de ADN a 6 nM con fines de imagen. Utilice un espectrofotómetro u otros métodos apropiados para determinar y ajustar con precisión la concentración. El motivo del ADN ya está listo para la obtención de imágenes.
   NOTA: Todos los tampones del protocolo tienen un pH de 8,0. La información de secuencia para las tres bandas respectivas es la siguiente:
   S1: AGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGT
   AGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC
   S2: ACTATGCAACCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGACA
   CGGTAACG
   S3: CGTTACCGTGTGGTTGCATAGT

2. Crecimiento de la punta en voladizo

1. Montaje en voladizo en el soporte de voladizo SEM: Asegúrese de que los voladizos estén limpios y libres de contaminantes. Monte los voladizos en un soporte adecuado compatible con el sistema SEM. El diseño del soporte en voladizo personalizado se puede compartir a pedido.
2. Inyección de gas: Calentar el gas precursor (por ejemplo, fenantreno C₁₄H₁₀ precursor de puntas de carbono amorfo) que se utilizará en el sistema de inyección de gas para hacer crecer la nueva punta. Tan pronto como el vacío esté por debajo ^{de 10-5} mbar, purgue la línea de inyección de gas 10 veces durante 2 s para asegurarse de que no haya aire residual no deseado en la línea de boquillas (eso debe hacerse con la válvula de la recámara de la pistola cerrada).
3. Ajuste de la posición de la punta: Utilice la microscopía electrónica de barrido (SEM) para localizar el extremo del voladizo. Incline el soporte en voladizo a un ángulo (por ejemplo, 11° en este caso) equivalente al que presentará el voladizo cuando se coloque en el soporte en voladizo AFM con respecto a la superficie para que la punta desarrollada quede perpendicular a la superficie mientras toma la imagen. Ajuste la posición y el enfoque del SEM para obtener una vista clara de la punta del voladizo, donde crecerá una nanopunta de carbono afilada.
4. Deposición inducida por haz de electrones focalizado (FEBID):
   1. Establezca los parámetros de deposición en el software seleccionado (en este caso, SmartFIB), como la corriente del haz (I) y el voltaje de aceleración (V), la distancia de trabajo (WD), el aumento, la forma expuesta, el tiempo de dosis/deposición y el tiempo de permanencia. Los siguientes parámetros se utilizaron para cultivar puntas de carbono amorfas, que presentan buenas propiedades mecánicas para la obtención de imágenes de AFM, lo que lleva a longitudes de alrededor de 130 nm y radios en el rango de 2-4 nm:
      Seleccionar punto/punto como forma expuesta
      WD = 5 mm
      I = 78 pA y V = 5 kV
      Tiempo de permanencia = 1 μs
      Dosis = 0,05 nC y tiempo de deposición = 0,64 s
      Aumento = 20000x
   2. Comience el proceso de deposición para hacer crecer la punta irradiando el haz de electrones en un punto sobre la punta en voladizo mientras se inyecta simultáneamente el gas precursor, cerrando el gas cuando se realiza la deposición. En este caso, el software SmartFIB lo realiza automáticamente después de configurar la receta mencionada anteriormente.
5. Análisis posterior al crecimiento: Realice imágenes SEM posteriores al crecimiento para examinar la punta recién desarrollada y garantizar su calidad y características (radio y longitud de la punta). Espere 1-2 minutos después del crecimiento de la punta para asegurarse de que todo el gas precursor se bombee para evitar la redeposición durante la obtención de imágenes SEM. Retire el portamuestras de la cámara SEM.
6. Reciclaje en voladizo: En caso de que el sistema SEM también tenga instalado un haz de iones enfocados combinado (FIB), retire una punta dañada o sucia previamente cultivada fresarla con el sistema FIB utilizando corrientes FIB bajas (por ejemplo, 1 pA, para evitar daños en voladizo). Realice la extracción de la punta fresando en forma de sección transversal, desde el extremo de la punta hasta la base, para evitar el colapso de la punta. Esto permitirá que vuelva a crecer uno nuevo.

3. Hardware HS-AFM

1. La configuración de imágenes está compuesta por el cabezal PORT^{5, 26} (Figura 1A) hecho a medida, el escáner de alta velocidad²⁶ con un disco de muestra con mica en la parte superior, el controlador^{compatible 27}, el amplificador de alto voltaje con el alto ancho de banda requerido para la obtención de imágenes de alta velocidad, la base AFM y la PC con el software requerido para controlar el equipo mencionado^{anteriormente 27}.
   NOTA: En este caso, se trata de componentes de código abierto para los que se pueden obtener planos del Laboratorio de Bioinstrumentación y Nanoinstrumentación en EPFL^{27, 28}. También es posible asistir a talleres sobre cómo construir el cabezal PORT y el controlador²⁹, así como descargar y utilizar el software basado en LabView.
2. Coloque con cuidado un voladizo ultracorto (por ejemplo, AC10DS o equivalente) debajo del clip de resorte en el soporte del voladizo con pinzas. Asegúrese de que la viruta en voladizo esté fija y estable.
3. Agregue 50 μL de líquido con una jeringa a través del puerto de acceso al líquido izquierdo, como se muestra en la Figura 1B. Con el láser de excitación aún apagado, alinee el láser de lectura en el voladizo usando las tres perillas dedicadas en el cabezal AFM que se muestran en la Figura 1A. Para ello, observe la sombra del voladizo en un papel blanco mientras maximiza la suma (método de la sombra). A continuación, centre el punto láser en el fotodiodo utilizando los dos mandos dedicados.
4. Encienda y alinee el láser de accionamiento marcando la casilla Excitation Enable en Excitation VI, para que accione y haga oscilar el voladizo. Muestra la señal de excitación en voladizo y la señal de deflexión en voladizo en un osciloscopio conectado. Si la oscilación de la deflexión es demasiado baja (o inexistente), es posible que el láser de accionamiento esté muy lejos del voladizo. En ese caso, use el método de sombra y apague el láser de deflexión para facilitar la alineación. Maximice la amplitud de oscilación utilizando las perillas de ajuste del láser de accionamiento que se muestran en la Figura 1A.
5. Para ajustar la amplitud de oscilación en voladizo en PORT, ingrese en el control correspondiente del software el voltaje pico a pico enviado al circuito de control del diodo láser (a partir de ahora, entrada de CA pico a pico) en Excitación VI. Para mantener el diodo láser en el régimen de conducción y, por lo tanto, láser, agregue un voltaje de CC al circuito de control del diodo láser (a partir de ahora, entrada de compensación de CC), lo que también se hace desde una caja de configuración en Excitación VI. Ambos también afectarán la potencia del láser, que se puede medir con un medidor de potencia láser y se utiliza para ajustar la amplitud de oscilación en voladizo.
6. Determine la frecuencia máxima de excitación fototérmica que se puede aplicar al voladizo, que debe estar por debajo de la frecuencia de resonancia del voladizo. Determine la frecuencia de resonancia mediante un ajuste térmico o un barrido de frecuencia. Los voladizos utilizados en este estudio (AC10DS), cuya frecuencia de resonancia en líquidos es de alrededor de 400 kHz (1 MHz en aire)³⁰, tienen una región de flexión cuasiestática por debajo de 300 kHz⁵. Por lo tanto, se deben utilizar frecuencias PORT por debajo de ese límite (alrededor de 100-200 kHz).
7. Ajuste los parámetros de imagen y la configuración para la velocidad PORT y la velocidad de escaneo a los valores requeridos en Excitation y Scan Vis respectivamente (los parámetros utilizados en este artículo se indican en las descripciones de las figuras). Una vez configurados los parámetros de configuración e imagen, realice los experimentos de imagen necesarios para observar y realizar un seguimiento de las interacciones moleculares.
   NOTA: Dado que los voladizos AC10DS ya no se venden, es posible que sea necesario utilizar una alternativa como Fastscan D o BioLever³¹ hasta que se disponga de un equivalente.

4. Obtención de curvas de interacción adecuadas

1. Inicialmente, acérquese a la superficie de muestra en modo de contacto haciendo clic en Iniciar en el controlador Z VI configurado en Modo de contacto.
   1. En este modo, la punta AFM entra en contacto directo con la muestra. Una vez alcanzada la superficie, realice una curva de fuerza frente a distancia en la Rampa VI para obtener la calibración de la sensibilidad a la deflexión en voladizo.
   2. Además, estime la constante del resorte en voladizo, ya sea a partir de las especificaciones del proveedor de voladizo (con menos precisión), obtenidas con un interferómetro o mediante una calibración basada en ajuste térmico después de la calibración de la sensibilidad a la deflexión. Una calibración precisa del voladizo es esencial para un control preciso de la fuerza de la punta y la muestra.
2. Después de retraer completamente el piezoeléctrico Z de la superficie donde la punta no puede alcanzar la superficie haciendo clic en Arriba en el controlador Z VI, cambie al modo PORT en el controlador Z VI y encienda el láser de excitación en la casilla de verificación Excitación VI. Para comenzar, configure el modo PORT para que funcione a la frecuencia deseada en la excitación VI, que, en este caso experimental, es de 100 kHz, utilizando un voladizo AC10DS.
3. Registre la oscilación sin voladizo cerca pero sin tocar la superficie. A continuación, encienda la retroalimentación en el controlador Z en contacto con la superficie para registrar y haga clic en Correct para obtener la oscilación del voladizo cuando el voladizo está en contacto intermitente con la superficie, ambos en nanómetros. Reste la curva de oscilación libre de la curva de contacto intermitente para obtener la curva de interacción real, convirtiéndolas a pN utilizando la constante de resorte en voladizo (en este caso, 0,1 N/m).

5. Imágenes HS-AFM

1. Prepare una solución de Mg(CH₃COO)₂ a una concentración de 10 mM. Con una jeringa Hamilton, inyecte 50 μL de la solución preparada de 10 mM Mg(CH₃COO)₂ en el canal fluídico del soporte en voladizo, creando una gota de líquido que envuelve el voladizo.
2. Acérquese gradualmente el voladizo a la superficie haciendo clic en Iniciar en el Z Controller VI. Una vez que se detecta la superficie, active la retroalimentación y encuentre el pico de la curva de interacción en las curvas de fuerza ORT VI. Encuentre el punto de ajuste de fuerza más bajo que permita un seguimiento adecuado (por debajo de 300 pN para evitar el daño de muestras biológicas frágiles).
3. Establezca el Tamaño de escaneo en el Escaneo VI en 800 nm por 800 nm y la Velocidad de línea en 100 Hz. Escanee la superficie haciendo clic en la flecha Marco (abajo) en Escaneo VI para comprobar la calidad de la superficie. Si se detecta alguna contaminación, resuelva el problema limpiando la superficie, el voladizo y/o el soporte en voladizo antes de continuar.
4. Después de escanear, retraiga el voladizo de la superficie haciendo clic en Retirar en el controlador Z VI. Retire la solución tampón del orificio del soporte en voladizo con una jeringa Hamilton para evitar problemas de volumen muerto.
5. Prepare una solución diluida de ADN 3PS de la parte 1 del protocolo. Inyecte 50 μL de la solución diluida de ADN 3PS en el canal dedicado del soporte en voladizo.
6. Inicie el proceso de creación de imágenes repitiendo los pasos 5.2 a 5.3, escaneando un área de 800 nm por 800 nm a una velocidad de línea predeterminada de 100 Hz (256 líneas × 256 píxeles). Después del escaneo inicial, ajuste el tamaño y la velocidad de la imagen en el escaneo VI a los valores especificados para una mayor adquisición de datos.
7. Mantenga el punto de ajuste de la fuerza de entrada de la interacción punta-muestra en la caja de punto de ajuste VI del controlador Z en el nivel más bajo requerido para un seguimiento adecuado (por debajo de 300 pN) durante todo el proceso de obtención de imágenes para minimizar el daño/perturbación de la muestra, a menos que se especifique lo contrario. Repita este proceso para todas las áreas de muestra requeridas.

6. Procesamiento de imágenes

1. Configure el entorno para ejecutar el código de procesamiento por lotes personalizado de Pygwy (Python para Gwyddion), asegurándose de que Python y todas las bibliotecas necesarias. Se puede encontrar más información en el sitio web de Gwyddion:³² están correctamente instalados en el sistema. Esto garantiza que el código se ejecute sin problemas y pueda acceder a las funcionalidades requeridas.
2. Abra el código de procesamiento por lotes personalizado de Pygwy (proporcionado a pedido). Esto proporcionará acceso a las herramientas y funcionalidades necesarias para el procesamiento y análisis de imágenes.
3. Comience el procesamiento de imágenes realizando una corrección de la línea mediana horizontal en las imágenes. Este paso tiene como objetivo eliminar cualquier irregularidad o artefacto presente en las líneas de escaneo, asegurando que los pasos de procesamiento posteriores se basen en datos precisos. Después de eliminar el fondo del plano, aplique la corrección de línea. Utilice la eliminación de cicatrices para mejorar aún más las imágenes al eliminar cualquier marca o imperfección no deseada causada por factores externos. Este paso mejora el aspecto visual general de las imágenes.
4. Mejore la visibilidad y el contraste de las imágenes ajustando el mapa de altura de color. Esto garantiza que las características de interés se visualicen claramente y se destaquen en las imágenes.
5. Seleccione las imágenes procesadas que deben combinarse en un video. Determine la velocidad de fotogramas deseada para el vídeo. En este caso, establézcalo en 7 fotogramas por segundo (fps).
6. Calcula la duración de cada fotograma. Utilice Fiji (ImageJ) para combinar las imágenes procesadas en un vídeo. Asegúrese de que la velocidad de fotogramas y la duración de los fotogramas estén configuradas correctamente.

Resultados

En esta investigación, se observó con éxito el proceso de ensamblaje dinámico de motivos de estrellas de 3 puntas de ADN en islas estables utilizando las capacidades del HS-PORT AFM. Esta técnica nos permitió capturar el ensamblaje de estas estructuras en tiempo real. En la Figura 2A, B, obtenemos un escaneo de imagen clara a velocidades de línea de 100 Hz y 200 Hz, respectivamente, para una velocidad de PORT de 100 kHz (tamaño de es...

Discusión

Al obtener imágenes de muestras biológicas delicadas, los modos de imagen de toma de resonancia fuera de resonancia en AFM son particularmente útiles, ya que pueden controlar directamente las fuerzas de interacción entre la punta y la muestra¹⁰. Entre ellos, el modo PORT destaca por las mayores tasas de oscilación que puede alcanzar, lo que permite mayores velocidades de escaneo. Dado que PORT acciona directamente y únicamente el voladizo con un láser, perm...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AC10DS	Olympus	BL-AC10FS-A2	Discontinued
Biometra Compact XS/S	Biometra GmbH	846-025-199	Electrophoresis  unit
Biometra TRIO	Biometra GmbH	207072X	thermocycler for annealing
Custom AFM setup	Laboratory for Bio-Nano Instrumentation, Interfaculty Bioengineering Institute, School of Engineering, Ecole Polytechnique Fédérale Lausanne		Obtainable through Laboratory for Bio-Nano Instrumentation
EDTA	ITW Reagents	A5097	In annealing buffer
Laser Power Meter	Thorlabs	PM100D	Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console
Lively 3AP Power Supply, MP-310	Major Science	MP-310	Electrophoresis Power Supply
MgAc2	ABCR GmbH	AB544692	In annealing buffer
TBE	Thermo Scientific	327330010	Running buffer for electrophoresis
TRIS	Bio-Rad	1610719	In annealing buffer