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Method Article
Qui, mostriamo il protocollo di imaging per l'osservazione delle interazioni biomolecolari con il rilevamento della risonanza fototermica (PORT), dove abbiamo ottimizzato i parametri di imaging, identificato i limiti del sistema e studiato potenziali miglioramenti nell'imaging dell'assemblaggio del motivo del DNA a tre punte.
La microscopia a forza atomica ad alta velocità (HS-AFM) è una popolare tecnica di imaging molecolare per la visualizzazione di processi biologici a singola molecola in tempo reale grazie alla sua capacità di visualizzare in condizioni fisiologiche in ambienti liquidi. La modalità di maschiatura fototermica fuori risonanza (PORT) utilizza un laser di azionamento per far oscillare il cantilever in modo controllato. Questo azionamento diretto a sbalzo è efficace nella gamma dei MHz. In combinazione con l'utilizzo del ciclo di feedback sulla curva di forza nel dominio del tempo piuttosto che sull'ampiezza di risonanza, PORT consente l'imaging ad alta velocità fino a dieci fotogrammi al secondo con controllo diretto sulle forze punta-campione. È stato dimostrato che PORT consente l'imaging di delicate dinamiche di assemblaggio e il monitoraggio preciso dei modelli formati da biomolecole. Finora, la tecnica è stata utilizzata per una varietà di studi dinamici in vitro , inclusi i modelli di assemblaggio del motivo a stella a 3 punte del DNA mostrati in questo lavoro. Attraverso una serie di esperimenti, questo protocollo identifica sistematicamente le impostazioni ottimali dei parametri di imaging e i limiti ultimi del sistema di imaging HS-PORT AFM e il modo in cui influenzano i processi di assemblaggio biomolecolare. Inoltre, studia i potenziali effetti termici indesiderati indotti dal laser di azionamento sul campione e sul liquido circostante, in particolare quando la scansione è limitata a piccole aree. Questi risultati forniscono preziose informazioni che guideranno l'avanzamento dell'applicazione della modalità PORT nello studio di sistemi biologici complessi.
La microscopia a forza atomica ad alta velocità (HS-AFM) è una tecnica di imaging in rapida crescita 1,2,3,4. Funziona a velocità che consentono ai ricercatori di visualizzare le interazioni biomolecolari in tempo reale 5,6,7,8,9. La maschiatura fototermica fuori risonanza (PORT) è una modalità di imaging fuori risonanza simile alla maschiatura della forza di picco10,11, alla modalità forza pulsata 12,13 o alla modalità di salto14. Tuttavia, invece di far oscillare verticalmente lo scanner, PORT fa oscillare verticalmente solo il cantilever attraverso un laser di eccitazione focalizzato sul cantilever (di solito vicino al punto di serraggio). Il cantilever si deforma a causa dell'effetto bimorfo: un laser di eccitazione modulato in potenza riscalda periodicamente il cantilever rivestito, che si piega a causa dei diversi coefficienti di dilatazione termica del cantilever e dei materiali di rivestimento15. Il riscaldamento a sbalzo e del campione può essere ridotto al minimo utilizzando un laser di azionamento che viene periodicamente spento e riacceso durante ogni ciclo di oscillazione, piuttosto che utilizzare un azionamento sinusoidale completo5.
Il DNA è stato utilizzato per formare motivi biologicamente rilevanti, strutturalmente interessanti e biochimicamente utili per un certo numero di anni 16,17,18,19,20. Inoltre, le strutture del DNA si sono dimostrate ideali per caratterizzare la qualità dell'imaging AFM21 e per valutare l'effetto punta dell'AFM22 ad alta velocità. Le stelle a tre punti del DNA smussato (3PS) sono diventate pratiche come sistema modello programmabile per studiare l'organizzazione supramolecolare di molecole strutturate in modo simile in sistemi biologici altrimenti complessi19. In precedenza, l'autoassemblaggio di reticoli formati da monomeri di DNA trimerici con estremità smussata è stato monitorato tramite HS-AFM23. Alla fine, questi si organizzano in grandi reti con ordine esagonale. Qui, l'autoassemblaggio del DNA delle stelle a 3 punti19 viene ripreso con la tecnica PORT a velocità di scansione sufficientemente elevate da tracciare l'autoassemblaggio e i suoi meccanismi di correzione24, garantendo al contempo un'interruzione minima del processo o il danneggiamento del campione. Come per qualsiasi modalità HS-AFM, esiste un compromesso tra qualità dell'immagine ottenibile, velocità dell'immagine e disturbo indesiderato del campione. Scegliendo il giusto compromesso, si possono comprendere meglio i modelli di auto-organizzazione degli assemblaggi supramolecolari. Questo protocollo, quindi, utilizzerà una configurazione simile con DNA 3PS come sistema modello per ottimizzare i parametri specifici di PORT. Ciò consentirà il funzionamento a velocità di imaging elevate con dimensioni di scansione sufficientemente grandi, riducendo al minimo i danni al campione.
1. Campione e tamponi
NOTA: La piastrella di DNA utilizzata in questo studio è il motivo della stella a 3 punte sviluppato presso il laboratorio di Mao presso la Purdue University19,25. Tutti gli oligonucleotidi utilizzati in questo studio sono stati acquistati da Integrated DNA Technologies, Inc. Raccogli i materiali e i reagenti necessari.
2. Crescita della punta a sbalzo
3. Hardware HS-AFM
4. Ottenere curve di interazione corrette
5. Imaging HS-AFM
6. Elaborazione delle immagini
In questa indagine, il processo di assemblaggio dinamico dei motivi delle stelle a 3 punte del DNA in isole stabili è stato osservato con successo utilizzando le capacità dell'HS-PORT AFM. Questa tecnica ci ha permesso di catturare l'assemblaggio di queste strutture in tempo reale. Nella Figura 2A, B, otteniamo una scansione chiara dell'immagine a velocità di linea di 100 Hz e 200 Hz, rispettivamente, per una velocità PORT di 100 kHz (80...
Quando si esegue l'imaging di campioni biologici delicati, le modalità di imaging di maschiatura fuori risonanza in AFM sono particolarmente utili poiché possono controllare direttamente le forze di interazione punta-campione10. Tra queste, la modalità PORT si distingue per le velocità di oscillazione più elevate che può raggiungere, che consente velocità di scansione più elevate. Poiché PORT aziona direttamente e solo il cantilever con un laser, consente...
Gli autori non hanno nulla da rivelare
Gli autori ringraziano Raphael Zingg per l'aiuto nella programmazione dello script Python per l'elaborazione delle serie di immagini. Il GEF riconosce i finanziamenti derivanti da H2020 - Programma Quadro UE per la Ricerca e l'Innovazione (2014-2020); ERC-2017-CoG; InCell; Numero del progetto 773091. VC riconosce che questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie n. 754354. Questa ricerca è stata sostenuta dal Fondo nazionale svizzero per la ricerca scientifica attraverso una sovvenzione 200021_182562.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
AC10DS | Olympus | BL-AC10FS-A2 | Discontinued |
Biometra Compact XS/S | Biometra GmbH | 846-025-199 | Electrophoresis unit |
Biometra TRIO | Biometra GmbH | 207072X | thermocycler for annealing |
Custom AFM setup | Laboratory for Bio-Nano Instrumentation, Interfaculty Bioengineering Institute, School of Engineering, Ecole Polytechnique Fédérale Lausanne | Obtainable through Laboratory for Bio-Nano Instrumentation | |
EDTA | ITW Reagents | A5097 | In annealing buffer |
Laser Power Meter | Thorlabs | PM100D | Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console |
Lively 3AP Power Supply, MP-310 | Major Science | MP-310 | Electrophoresis Power Supply |
MgAc2 | ABCR GmbH | AB544692 | In annealing buffer |
TBE | Thermo Scientific | 327330010 | Running buffer for electrophoresis |
TRIS | Bio-Rad | 1610719 | In annealing buffer |
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