Imaging al microscopio a forza atomica ad alta velocità del DNA con motivo a stella a tre punte Autoassemblaggio mediante maschiatura fototermica a bassa risonanza

Riepilogo

Qui, mostriamo il protocollo di imaging per l'osservazione delle interazioni biomolecolari con il rilevamento della risonanza fototermica (PORT), dove abbiamo ottimizzato i parametri di imaging, identificato i limiti del sistema e studiato potenziali miglioramenti nell'imaging dell'assemblaggio del motivo del DNA a tre punte.

Abstract

La microscopia a forza atomica ad alta velocità (HS-AFM) è una popolare tecnica di imaging molecolare per la visualizzazione di processi biologici a singola molecola in tempo reale grazie alla sua capacità di visualizzare in condizioni fisiologiche in ambienti liquidi. La modalità di maschiatura fototermica fuori risonanza (PORT) utilizza un laser di azionamento per far oscillare il cantilever in modo controllato. Questo azionamento diretto a sbalzo è efficace nella gamma dei MHz. In combinazione con l'utilizzo del ciclo di feedback sulla curva di forza nel dominio del tempo piuttosto che sull'ampiezza di risonanza, PORT consente l'imaging ad alta velocità fino a dieci fotogrammi al secondo con controllo diretto sulle forze punta-campione. È stato dimostrato che PORT consente l'imaging di delicate dinamiche di assemblaggio e il monitoraggio preciso dei modelli formati da biomolecole. Finora, la tecnica è stata utilizzata per una varietà di studi dinamici in vitro , inclusi i modelli di assemblaggio del motivo a stella a 3 punte del DNA mostrati in questo lavoro. Attraverso una serie di esperimenti, questo protocollo identifica sistematicamente le impostazioni ottimali dei parametri di imaging e i limiti ultimi del sistema di imaging HS-PORT AFM e il modo in cui influenzano i processi di assemblaggio biomolecolare. Inoltre, studia i potenziali effetti termici indesiderati indotti dal laser di azionamento sul campione e sul liquido circostante, in particolare quando la scansione è limitata a piccole aree. Questi risultati forniscono preziose informazioni che guideranno l'avanzamento dell'applicazione della modalità PORT nello studio di sistemi biologici complessi.

Introduzione

La microscopia a forza atomica ad alta velocità (HS-AFM) è una tecnica di imaging in rapida crescita 1,2,3,4. Funziona a velocità che consentono ai ricercatori di visualizzare le interazioni biomolecolari in tempo reale 5,6,7,8,9. La maschiatura fototermica fuori risonanza (PORT) è una modalità di imaging fuori risonanza simile alla maschiatura della forza di picco^10,11, alla modalità forza pulsata ^12,13 o alla modalità di salto¹⁴. Tuttavia, invece di far oscillare verticalmente lo scanner, PORT fa oscillare verticalmente solo il cantilever attraverso un laser di eccitazione focalizzato sul cantilever (di solito vicino al punto di serraggio). Il cantilever si deforma a causa dell'effetto bimorfo: un laser di eccitazione modulato in potenza riscalda periodicamente il cantilever rivestito, che si piega a causa dei diversi coefficienti di dilatazione termica del cantilever e dei materiali di rivestimento¹⁵. Il riscaldamento a sbalzo e del campione può essere ridotto al minimo utilizzando un laser di azionamento che viene periodicamente spento e riacceso durante ogni ciclo di oscillazione, piuttosto che utilizzare un azionamento sinusoidale completo⁵.

Il DNA è stato utilizzato per formare motivi biologicamente rilevanti, strutturalmente interessanti e biochimicamente utili per un certo numero di anni 16,17,18,19,20. Inoltre, le strutture del DNA si sono dimostrate ideali per caratterizzare la qualità dell'imaging AFM²¹ e per valutare l'effetto punta dell'AFM²² ad alta velocità. Le stelle a tre punti del DNA smussato (3PS) sono diventate pratiche come sistema modello programmabile per studiare l'organizzazione supramolecolare di molecole strutturate in modo simile in sistemi biologici altrimenti complessi¹⁹. In precedenza, l'autoassemblaggio di reticoli formati da monomeri di DNA trimerici con estremità smussata è stato monitorato tramite HS-AFM²³. Alla fine, questi si organizzano in grandi reti con ordine esagonale. Qui, l'autoassemblaggio del DNA delle stelle a 3 punti¹⁹ viene ripreso con la tecnica PORT a velocità di scansione sufficientemente elevate da tracciare l'autoassemblaggio e i suoi meccanismi di correzione²⁴, garantendo al contempo un'interruzione minima del processo o il danneggiamento del campione. Come per qualsiasi modalità HS-AFM, esiste un compromesso tra qualità dell'immagine ottenibile, velocità dell'immagine e disturbo indesiderato del campione. Scegliendo il giusto compromesso, si possono comprendere meglio i modelli di auto-organizzazione degli assemblaggi supramolecolari. Questo protocollo, quindi, utilizzerà una configurazione simile con DNA 3PS come sistema modello per ottimizzare i parametri specifici di PORT. Ciò consentirà il funzionamento a velocità di imaging elevate con dimensioni di scansione sufficientemente grandi, riducendo al minimo i danni al campione.

Protocollo

1. Campione e tamponi

NOTA: La piastrella di DNA utilizzata in questo studio è il motivo della stella a 3 punte sviluppato presso il laboratorio di Mao presso la Purdue University^19,25. Tutti gli oligonucleotidi utilizzati in questo studio sono stati acquistati da Integrated DNA Technologies, Inc. Raccogli i materiali e i reagenti necessari.

1. Mescolare i DNA a filamento singolo (ssDNA) con un rapporto molare 1:3:3 (S1, 0,6 μM, 1,8 μM per S2 e 1,8 μM per S3) nel tampone di ricottura (5 mM TRIS, 1 mM EDTA e 10 mM MgAc₂). La concentrazione finale del motivo del DNA deve essere di 0,6 μM (49 ng/μL con un peso molecolare di 3PS pari a 82020,3 g/mol).
2. Porre la soluzione di DNA in un contenitore resistente al calore e riscaldarla a 80 °C. Raffreddare lentamente la soluzione di DNA da 80 °C a 20 °C per un periodo di 4 ore. Questo processo di ricottura aiuta gli oligonucleotidi ssDNA a formare il motivo di DNA a doppio filamento desiderato.
3. Per la purificazione, caricare la soluzione di DNA ricotto su un gel di agarosio al 3% per rimuovere gli ssDNA in eccesso e qualsiasi prodotto collaterale indesiderato. Far funzionare il gel al 3% a 60 V per circa 2,5 ore in un tampone di corsa contenente 0,5x Tris-Borato-EDTA (TBE) e 10 mM di Mg(CH₃COO)₂.
4. Identifica e individua la fascia sul gel che contiene il motivo del DNA. Assicurati che il cinturino sia migrato in una posizione specifica in base alle sue dimensioni.
5. Asportare accuratamente la fascia contenente il motivo del DNA dal gel. Estrarre il motivo del DNA dal frammento di gel asportato ponendolo in una colonna di centrifugazione per l'estrazione del gel e centrifugando a 3.000 x g e 4 °C per 10 minuti.
6. Sostituire il tampone nel motivo di DNA estratto con il tampone di ricottura utilizzando un concentratore centrifugo. Centrifugare a 3000 x g a temperatura ambiente (o inferiore) fino a quando la soluzione concentrata è inferiore a 100 μL. Quindi, aggiungere 300 μl di tampone di ricottura e ripetere questo passaggio due volte per assicurarsi che il tampone venga sostituito.
7. Diluire il motivo del DNA a 6 nM per scopi di imaging. Utilizzare uno spettrofotometro o altri metodi appropriati per determinare e regolare con precisione la concentrazione. Il motivo del DNA è ora pronto per l'imaging.
   NOTA: Tutti i tamponi nel protocollo sono a pH 8,0. Le informazioni sulla sequenza per le tre rispettive bande sono le seguenti:
   S1: AGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGT
   AGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC
   S2: ACTATGCAACCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGACA
   CGGTAACG
   S3: CGTTACCGTGTGGTTGCATAGT

2. Crescita della punta a sbalzo

1. Montaggio a sbalzo sul supporto a sbalzo SEM: assicurarsi che i cantilever siano puliti e privi di contaminanti. Montare i cantilever su un apposito supporto compatibile con il sistema SEM. Il design del supporto a sbalzo su misura può essere condiviso su richiesta.
2. Iniezione di gas: Riscaldare il gas precursore (ad es. fenantrene C₁₄H₁₀ precursore per punte di carbonio amorfo) da utilizzare sul sistema di iniezione del gas per far crescere la nuova punta. Non appena il vuoto è inferiore a ^10-5 mbar, spurgare la linea di iniezione del gas 10 volte per 2 s per assicurarsi che non ci siano residui di aria indesiderati nella linea dell'ugello (che deve essere fatto con la valvola della camera della pistola chiusa).
3. Regolazione della posizione della punta: utilizzare la microscopia elettronica a scansione (SEM) per individuare l'estremità del cantilever. Inclinare il supporto a sbalzo a un angolo (ad esempio, 11° in questo caso) equivalente a quello che il cantilever presenterà quando posizionato sul supporto a sbalzo AFM rispetto alla superficie in modo che la punta cresciuta sia perpendicolare alla superficie durante l'imaging. Regola la posizione e la messa a fuoco del SEM per ottenere una visione chiara della punta del cantilever, dove verrà coltivata una nano-punta di carbonio affilata.
4. Deposizione indotta da fascio di elettroni focalizzato (FEBID):
   1. Impostare i parametri di deposizione sul software selezionato (in questo caso, SmartFIB), come la corrente del fascio (I) e la tensione di accelerazione (V), la distanza di lavoro (WD), l'ingrandimento, la forma esposta, il tempo di dose/deposizione e il tempo di permanenza. I seguenti parametri sono stati utilizzati per far crescere punte di carbonio amorfo, che presentano buone proprietà meccaniche per l'imaging AFM, portando a lunghezze intorno a 130 nm e raggi nell'intervallo di 2-4 nm:
      Seleziona punto/punto come forma esposta
      WD = 5 mm
      I = 78 pA e V = 5 kV
      Tempo di permanenza = 1 μs
      Dose = 0,05 nC e tempo di deposizione = 0,64 s
      Ingrandimento = 20000x
   2. Iniziare il processo di deposizione per far crescere la punta irradiando il fascio di elettroni in un punto sulla punta a sbalzo e contemporaneamente iniettare il gas precursore, chiudendo il gas quando la deposizione è terminata. In questo caso, il software SmartFIB esegue questa operazione automaticamente dopo aver impostato la ricetta sopra menzionata.
5. Analisi post-crescita: eseguire l'imaging SEM post-crescita per esaminare la punta appena cresciuta e garantirne la qualità e le caratteristiche (raggio e lunghezza della punta). Attendere 1-2 minuti dopo la crescita della punta per assicurarsi che tutto il gas precursore venga pompato fuori per evitare la ri-deposizione durante l'imaging SEM. Rimuovere il portacampioni dalla camera SEM.
6. Riciclaggio a sbalzo: nel caso in cui il sistema SEM abbia installato anche un fascio ionico focalizzato combinato (FIB), rimuovere una punta precedentemente cresciuta danneggiata o sporca fresandola con il sistema FIB utilizzando basse correnti FIB (ad esempio, 1 pA, per evitare danni al cantilever). Eseguire la rimozione della punta fresando in una forma di sezione trasversale, dall'estremità della punta alla base, per evitare il collasso della punta. Questo permetterà di ricrescerne uno nuovo.

3. Hardware HS-AFM

1. La configurazione dell'imaging è composta dalla testa PORT^{5, 26} (Figura 1A), dallo scanner ad alta velocità²⁶ con un disco campione con mica sulla parte superiore, dal controller^{compatibile 27}, dall'amplificatore ad alta tensione con l'elevata larghezza di banda richiesta per l'imaging ad alta velocità, dalla base AFM e dal PC con il software necessario per controllare l'apparecchiatura sopra menzionata²⁷.
   NOTA: In questo caso, si tratta di componenti open source per i quali è possibile ottenere i piani presso il Laboratorio per la biostrumentazione e la nanostrumentazione dell'EPFL^{27, 28}. È inoltre possibile partecipare a workshop su come costruire la testa PORT e il controller²⁹, nonché scaricare e utilizzare il software basato su LabView.
2. Posizionare con cautela un cantilever ultra-corto (ad es. AC10DS o equivalente) sotto la clip a molla sul supporto del cantilever utilizzando una pinzetta. Assicurarsi che il chip a sbalzo sia fisso e stabile.
3. Aggiungere 50 μl di liquido utilizzando una siringa attraverso la porta di accesso al fluido sinistra, come mostrato nella Figura 1B. Con il laser di eccitazione ancora spento, allineare il laser di lettura sul cantilever utilizzando le tre manopole dedicate sulla testa AFM mostrate nella Figura 1A. Fallo osservando l'ombra del cantilever su un foglio bianco massimizzando la somma (metodo dell'ombra). Quindi, centrare lo spot laser sul fotodiodo utilizzando le due manopole dedicate.
4. Accendere e allineare il laser di azionamento selezionando la casella Excitation Enable in Excitation VI, in modo che attivi e faccia oscillare il cantilever. Mostra il segnale di eccitazione a sbalzo e il segnale di deflessione a sbalzo su un oscilloscopio collegato. Se l'oscillazione di deflessione è troppo bassa (o inesistente), è possibile che il laser di azionamento sia molto lontano dal cantilever. In tal caso, utilizzare il metodo dell'ombra e spegnere il laser di deflessione per facilitare l'allineamento. Massimizzare l'ampiezza dell'oscillazione utilizzando le manopole di regolazione del laser di azionamento mostrate nella Figura 1A.
5. Per regolare l'ampiezza dell'oscillazione a sbalzo in PORT, inserire nel controllo corrispondente del software la tensione picco-picco inviata al circuito di controllo del diodo laser (d'ora in poi, ingresso CA picco-picco) in Eccitazione VI. Per mantenere il diodo laser in regime di conduzione e, quindi, laser, aggiungere una tensione CC al circuito di controllo del diodo laser (d'ora in poi, ingresso offset CC), che viene eseguito anche da una casella di configurazione in Excitation VI. Entrambi influenzeranno anche la potenza del laser, che può essere misurata con un misuratore di potenza laser e viene utilizzata per regolare l'ampiezza dell'oscillazione a sbalzo.
6. Determinare la frequenza massima di eccitazione fototermica che può essere applicata al cantilever, che deve essere inferiore alla frequenza di risonanza del cantilever. Determinare la frequenza di risonanza mediante una sintonizzazione termica o uno sweep di frequenza. I cantilever utilizzati in questo studio (AC10DS), la cui frequenza di risonanza nei liquidi è di circa 400 kHz (1 MHz in aria)³⁰, hanno una regione di flessione quasistatica inferiore a 300 kHz⁵. Pertanto, devono essere utilizzate frequenze PORT inferiori a tale limite (circa 100-200 kHz).
7. Regolare i parametri di imaging e le impostazioni per la velocità PORT e la velocità di scansione sui valori richiesti rispettivamente in Eccitazione e Scansione Vista (i parametri utilizzati in questo articolo sono indicati nelle descrizioni delle figure). Una volta configurati i parametri di configurazione e di imaging, eseguire gli esperimenti di imaging necessari per osservare e tracciare le interazioni molecolari.
   NOTA: Poiché i cantilever AC10DS non sono più in vendita, potrebbe essere necessario utilizzare un'alternativa come Fastscan D o BioLever³¹ fino a quando non sarà disponibile un equivalente.

4. Ottenere curve di interazione corrette

1. Inizialmente, avvicinarsi alla superficie del campione in modalità di contatto facendo clic su Start sullo Z-controller VI impostato su Contact Mode.
   1. In questa modalità, la punta dell'AFM entra in contatto diretto con il campione. Una volta raggiunta la superficie, eseguire una curva forza in funzione della distanza nella rampa VI per ottenere la calibrazione della sensibilità alla deflessione a sbalzo.
   2. Inoltre, stimare la costante della molla a sbalzo, sia dalle specifiche del fornitore di cantilever (meno accuratamente), ottenute con un interferometro, sia attraverso una calibrazione basata sulla sintonizzazione termica dopo la calibrazione della sensibilità alla deflessione. Una taratura precisa del cantilever è essenziale per un accurato controllo della forza del puntale.
2. Dopo aver ritirato completamente lo Z-piezo dalla superficie in cui la punta non può raggiungere la superficie facendo clic su Su nel controller Z VI, passare alla modalità PORT nel controller Z VI e attivare il laser di eccitazione nella casella di controllo Excitation VI. Per iniziare, impostare la modalità PORT in modo che funzioni alla frequenza desiderata in Excitation VI, che, in questo caso sperimentale, è di 100 kHz, utilizzando un cantilever AC10DS.
3. Registrare l'oscillazione senza sbalzo da vicino ma senza toccare la superficie. Quindi, accendere il feedback nel controller Z a contatto con la superficie da registrare e fare clic su Correggi per ottenere l'oscillazione del cantilever quando il cantilever è a contatto intermittente con la superficie, entrambi in nanometri. Sottrarre la curva di oscillazione libera dalla curva di contatto intermittente per ottenere la vera curva di interazione, convertendola in pN utilizzando la costante della molla a sbalzo (in questo caso, 0,1 N/m).

5. Imaging HS-AFM

1. Preparare una soluzione di Mg(CH₃COO)₂ alla concentrazione di 10 mM. Utilizzando una siringa Hamilton, iniettare 50 μl della soluzione preparata di 10 mM Mg(CH₃COO)₂ nel canale fluidico del supporto a sbalzo, creando una goccia di liquido che ingloba il cantilever.
2. Avvicina gradualmente il cantilever alla superficie facendo clic su Start sullo Z Controller VI. Una volta rilevata la superficie, attivare il feedback e trovare il picco della curva di interazione nelle curve di forza ORT VI. Trova il setpoint di forza più basso che consenta un corretto tracciamento (inferiore a 300 pN per evitare il danneggiamento di fragili campioni biologici).
3. Impostare la dimensione della scansione VI su 800 nm per 800 nm e la velocità della linea su 100 Hz. Eseguire la scansione della superficie facendo clic sulla freccia Frame (giù) in Scan VI per verificare la qualità della superficie. Se vengono rilevate contaminazioni, risolvere il problema pulendo la superficie, il cantilever e/o il supporto del cantilever prima di procedere.
4. Dopo la scansione, ritrarre il cantilever dalla superficie facendo clic su Ritira nel controller Z VI. Rimuovere la soluzione tampone dal foro nel supporto a sbalzo con una siringa Hamilton per evitare problemi di volume morto.
5. Preparare una soluzione diluita di DNA 3PS dalla parte 1 del protocollo. Iniettare 50 μl della soluzione diluita di DNA 3PS nel canale dedicato del supporto a sbalzo.
6. Avviare il processo di imaging ripetendo i passaggi 5.2-5.3, scansionando un'area di 800 nm per 800 nm a una velocità di linea predefinita di 100 Hz (256 linee × 256 pixel). Dopo la scansione iniziale, regolare le dimensioni e la velocità dell'immagine in Scan VI sui valori specificati per un'ulteriore acquisizione dei dati.
7. Mantenere il setpoint della forza di ingresso dell'interazione punta-campione nella casella Setpoint del controller Z VI al livello più basso richiesto per un corretto tracciamento (inferiore a 300 pN) durante il processo di imaging per ridurre al minimo il danno/disturbo del campione, se non diversamente specificato. Ripetere questo processo per tutte le aree di campionamento richieste.

6. Elaborazione delle immagini

1. Configura l'ambiente per l'esecuzione del codice di elaborazione batch Pygwy (Python for Gwyddion) personalizzato, assicurandoti che Python e tutte le librerie necessarie. Ulteriori informazioni possono essere trovate sul sito Web di Gwyddion³² sono installati correttamente sul sistema. Ciò garantisce che il codice funzioni senza problemi e possa accedere alle funzionalità richieste.
2. Apri il codice di elaborazione batch Pygwy personalizzato (fornito su richiesta). Ciò fornirà l'accesso agli strumenti e alle funzionalità necessarie per l'elaborazione e l'analisi delle immagini.
3. Iniziare l'elaborazione delle immagini eseguendo la correzione della linea mediana orizzontale sulle immagini. Questa fase ha lo scopo di rimuovere eventuali irregolarità o artefatti presenti nelle linee di scansione, garantendo che le successive fasi di elaborazione si basino su dati accurati. Dopo la rimozione dello sfondo del piano, applicare la correzione della linea. Usa la rimozione delle cicatrici per migliorare ulteriormente le immagini eliminando eventuali segni o imperfezioni indesiderate causati da fattori esterni. Questo passaggio migliora l'aspetto visivo generale delle immagini.
4. Migliora la visibilità e il contrasto delle immagini regolando la mappa dell'altezza dei colori. In questo modo si garantisce che le caratteristiche di interesse siano chiaramente visualizzate e risaltino nelle immagini.
5. Seleziona le immagini elaborate che devono essere combinate in un video. Determina la frequenza fotogrammi desiderata per il video. In questo caso, impostalo su 7 fotogrammi al secondo (fps).
6. Calcola la durata di ogni fotogramma. Usa Fiji (ImageJ) per combinare le immagini elaborate in un video. Assicurati che la frequenza dei fotogrammi e la durata dei fotogrammi siano impostate correttamente.

Risultati

In questa indagine, il processo di assemblaggio dinamico dei motivi delle stelle a 3 punte del DNA in isole stabili è stato osservato con successo utilizzando le capacità dell'HS-PORT AFM. Questa tecnica ci ha permesso di catturare l'assemblaggio di queste strutture in tempo reale. Nella Figura 2A, B, otteniamo una scansione chiara dell'immagine a velocità di linea di 100 Hz e 200 Hz, rispettivamente, per una velocità PORT di 100 kHz (80...

Discussione

Quando si esegue l'imaging di campioni biologici delicati, le modalità di imaging di maschiatura fuori risonanza in AFM sono particolarmente utili poiché possono controllare direttamente le forze di interazione punta-campione¹⁰. Tra queste, la modalità PORT si distingue per le velocità di oscillazione più elevate che può raggiungere, che consente velocità di scansione più elevate. Poiché PORT aziona direttamente e solo il cantilever con un laser, consente...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AC10DS	Olympus	BL-AC10FS-A2	Discontinued
Biometra Compact XS/S	Biometra GmbH	846-025-199	Electrophoresis  unit
Biometra TRIO	Biometra GmbH	207072X	thermocycler for annealing
Custom AFM setup	Laboratory for Bio-Nano Instrumentation, Interfaculty Bioengineering Institute, School of Engineering, Ecole Polytechnique Fédérale Lausanne		Obtainable through Laboratory for Bio-Nano Instrumentation
EDTA	ITW Reagents	A5097	In annealing buffer
Laser Power Meter	Thorlabs	PM100D	Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console
Lively 3AP Power Supply, MP-310	Major Science	MP-310	Electrophoresis Power Supply
MgAc2	ABCR GmbH	AB544692	In annealing buffer
TBE	Thermo Scientific	327330010	Running buffer for electrophoresis
TRIS	Bio-Rad	1610719	In annealing buffer