光熱オフレゾナンスタッピングを用いたDNA三点星モチーフ自己組織化の高速原子間力顕微鏡イメージング

要約

ここでは、光熱オフレゾナンスタッピング(PORT)による生体分子の相互作用を観察するためのイメージングプロトコルを示し、イメージングパラメータを最適化し、システム限界を特定し、3点スターDNAモチーフアセンブリのイメージングにおける潜在的な改善を調査しました。

要約

高速原子間力顕微鏡(HS-AFM)は、液体環境の生理学的条件下でイメージングする能力があるため、単一分子の生物学的プロセスをリアルタイムで視覚化するための一般的な分子イメージング技術です。光熱オフレゾナンスタッピング(PORT)モードは、ドライブレーザーを使用してカンチレバーを制御して発振します。この直接カンチレバー作動は、MHz範囲で効果的です。PORTは、共振振幅ではなく時間領域の力曲線でフィードバックループを操作することと組み合わせることで、チップサンプルの力を直接制御しながら、最大10フレーム/秒の高速イメージングを可能にします。PORTは、繊細なアセンブリダイナミクスのイメージングと、生体分子によって形成されるパターンの正確なモニタリングを可能にすることが示されています。これまで、この手法は、この研究で示されたDNA 3点スターモチーフの集合パターンなど、さまざまな動的 in vitro 研究に使用されてきました。一連の実験を通じて、このプロトコルは、HS-PORT AFMイメージングシステムの最適なイメージングパラメータ設定と最終的な限界、およびそれらが生体分子アセンブリプロセスにどのように影響するかを体系的に特定します。さらに、特にスキャンが小さな領域に限定されている場合に、ドライブレーザーがサンプルや周囲の液体に引き起こす潜在的な望ましくない熱影響を調査します。これらの知見は、複雑な生体システムの研究におけるPORTモードの応用を前進させる貴重な知見を提供します。

概要

高速原子間力顕微鏡(HS-AFM)は、急速に成長しているイメージング技術^です1,2,3,4。これは、研究者が生体分子の相互作用をリアルタイムで視覚化できる速度で動作します5,6,7,8,9。光熱オフ共鳴タッピング(PORT)は、ピークフォースタッピング^{10、11、パルス}フォースモード^12、13、またはジャンピングモード¹⁴と同様のオフ共鳴イメージングモードです。ただし、スキャナーを垂直に振動させるのではなく、PORTはカンチレバー(通常はクランプポイントの近く)に集束した励起レーザーを介してカンチレバーのみを垂直に振動させます。カンチレバーはバイモルフ効果により変形する:パワー変調励起レーザーは、カンチレバーとコーティング材料の異なる熱膨張係数のために曲がる被覆カンチレバーを周期的に加熱する¹⁵。カンチレバーとサンプルの加熱は、完全な正弦波ドライブ⁵を使用するのではなく、各振動サイクル中に定期的にオフにされてオンに戻るドライブレーザーを使用することで最小限に抑えることができます。

DNAは、生物学的に関連性があり、構造的に興味深く、生化学的に有用なモチーフを形成するために使用されてきた16,17,18,19,20。さらに、DNA構造は、AFMイメージング品質²¹を特徴付け、高速^AFM22の先端効果を評価するのに理想的に適していることが証明されています。平滑末端DNAスリーポイントスター(3PS)は、複雑な生物学的システムにおける同様の構造の分子の超分子組織を調査するためのプログラム可能なモデルシステムとして実用的になった¹⁹。これまで、平滑末端の三量体DNAモノマーによって形成された格子の自己組織化は、HS-AFM²³を介して追跡されていました。最終的には、これらは六角形の順序で大きなネットワークに編成されます。ここでは、DNAの自己組織化3点星¹⁹は、自己組織化およびその修正メカニズム²⁴を追跡するのに十分な速さでPORT技術を用いて画像化され、プロセスまたはサンプルの損傷の中断を最小限に抑えながら行われる。他のHS-AFMモードと同様に、達成可能なイメージング品質、イメージング速度、およびサンプルの望ましくない乱れとの間にはトレードオフがあります。適切な妥協点を選択することで、超分子集合体の自己組織化パターンをよりよく理解することができます。したがって、このプロトコルでは、DNA 3PSをモデルシステムとして同様のセットアップを使用して、PORTに固有のパラメータを最適化します。これにより、サンプルの損傷を最小限に抑えながら、十分な大きさのスキャンサイズで高速イメージング速度で操作できます。

プロトコル

1. サンプルとバッファー

注:この研究で使用されたDNAタイルは、パデュー大学のMao研究室で開発された3点星モチーフ^です19,25。この研究で使用したすべてのオリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies, Inc.から購入しました。

1. アニーリングバッファー(5 mM TRIS、1 mM EDTA、および10 mM MgAc₂)で、一本鎖DNA(ssDNA)を1:3:3 mol比(S1 0.6 μM、S2 1.8 μM、S3 1.8 μM)で混合します。DNAモチーフの最終濃度は0.6μM(49 ng/μL、3PSの分子量は82020.3 g/mol)でなければなりません。
2. DNA溶液を耐熱容器に入れ、80°Cに加熱します。 DNA溶液を80°Cから20°Cまで4時間かけてゆっくりと冷却します。このアニーリングプロセスは、ssDNAオリゴヌクレオチドが目的の二本鎖DNAモチーフを形成するのを助けます。
3. 精製するには、アニールしたDNA溶液を3%アガロースゲルにロードして、余分なssDNAと不要な副産物を取り除きます。3%ゲルを60 Vで約2.5時間、0.5x Tris-Borate-EDTA(TBE)と10 mM Mg(CH₃COO)₂を含むランニングバッファーで分析します。
4. DNAモチーフを含むゲル上のバンドを特定し、位置を特定します。バンドがそのサイズに基づいて特定の位置に移行したことを確認します。
5. DNAモチーフを含むバンドをゲルから慎重に切除します。切除したゲルフラグメントからDNAモチーフを抽出し、ゲル抽出スピンカラムに入れ、3,000 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。
6. 抽出したDNAモチーフのバッファーを、遠心濃縮器を使用してアニーリングバッファーに置き換えます。濃縮溶液が100 μL未満になるまで、室温(またはそれ以下)で3000 x g で遠心分離します。次に、300 μLのアニーリングバッファーを加え、この手順を2回繰り返して、バッファーが交換されていることを確認します。
7. イメージングのためにDNAモチーフを6 nMに希釈します。分光光度計またはその他の適切な方法を使用して、濃度を正確に決定および調整します。これで、DNAモチーフをイメージングする準備が整いました。
   注:プロトコル内のすべての緩衝液はpH 8.0です。3 つのそれぞれのバンドの配列情報は次のとおりです。
   S1: AGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGT
   AGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC
   S2: ACTATGCAACCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGACA
   CGGTAACGの
   S3: CGTTACCGTGTGGTTGCATAGT

2.カンチレバーチップの成長

1. SEMカンチレバーホルダーへのカンチレバーの取り付け:カンチレバーが清潔で、汚染物質がないことを確認してください。カンチレバーをSEMシステムと互換性のある適切なホルダーに取り付けます。特注のカンチレバーホルダーのデザインは、ご要望に応じて共有することができます。
2. ガス注入:ガス注入システムで使用する前駆体ガス(例:アモルファスカーボンチップ用のフェナントレンC₁₄H₁₀ 前駆体)を加熱して、新しいチップを成長させます。真空が10^〜5 mbarを下回ったらすぐに、ガス注入ラインを10回2秒間パージして、ノズルラインに望ましくない残留空気がないことを確認します(これは、ガンチャンバーのバルブを閉じた状態で行う必要があります)。
3. 先端位置の調整:走査型電子顕微鏡(SEM)を使用して、カンチレバーの端を特定します。カンチレバーホルダーを、AFMカンチレバーホルダーに置いたときにカンチレバーが表面に対して示す角度と同等の角度(この場合は11°など)に傾けて、成長した先端がイメージング中に表面に対して垂直になるようにします。SEMの位置と焦点を調整して、カンチレバーの先端がはっきりと見えるようになり、そこで鋭いカーボンナノチップが成長します。
4. 集束電子ビーム誘起堆積法(FEBID):
   1. 選択したソフトウェア(この場合はSmartFIB)で、ビーム電流(I)と加速電圧(V)、作動距離(WD)、倍率、露光形状、線量/蒸着時間、滞留時間などの蒸着パラメータを設定します。以下のパラメータを使用して、AFMイメージングに良好な機械的特性を示すアモルファスカーボンチップを成長させ、約130 nmの長さと2〜4 nmの範囲の半径を実現しました。
      スポット/ドットを露出形状として選択
      WD=5ミリメートル
      I = 78 pA、V = 5 kV
      滞留時間 = 1 μs
      線量 = 0.05 nC、沈着時間 = 0.64 秒
      倍率= 20000x
   2. カンチレバーの先端に一点の電子ビームを照射すると同時に、前駆体ガスを注入し、堆積が完了したらガスを閉じることにより、チップを成長させるための堆積プロセスを開始します。この場合、SmartFIBソフトウェアは、上記のレシピを設定した後、これを自動的に実行します。
5. 成長後の分析:成長後のSEMイメージングを実行して、新しく成長したチップを検査し、その品質と特性(チップの半径と長さ)を確認します。チップの成長後1〜2分待って、SEMイメージング中の再堆積を避けるために、すべての前駆体ガスが送り出されていることを確認してください。サンプルホルダーをSEMチャンバーから取り外します。
6. カンチレバーリサイクル:SEMシステムに複合集束イオンビーム(FIB)も取り付けられている場合は、損傷した、または汚れた以前に成長したチップを、低FIB電流(カンチレバーの損傷を避けるために1 pAなど)を使用してFIBシステムでフライス加工することにより、取り除きます。先端の潰れを防ぐために、先端の端から基部まで断面形状でフライス加工して先端の取り外しを行います。これにより、新しいものを再成長させることができます。

3. HS-AFMハードウェア

1. 撮像装置は、特注のPORTヘッド^5、26(図1A)、マイカを上に乗せたサンプルディスクを備えた高速スキャナ²⁶、互換コントローラ²⁷、高速撮像に必要な高帯域幅の高電圧増幅器、AFMベース、および前述の装置²⁷を制御するために必要なソフトウェアを備えたPCで構成される。
   注:この場合、これらはオープンソースのコンポーネントであり、EPFL^27、28のバイオおよびナノインスツルメンテーション研究所から計画を入手できます。また、PORTヘッドとコントローラ²⁹の構築方法に関するワークショップに参加したり、LabViewベースのソフトウェアをダウンロードして使用したりすることも可能です。
2. ピンセットを使用して、カンチレバーホルダーのスプリングクリップの下に超短カンチレバー(AC10DSまたは同等品など)を慎重に配置します。カンチレバーチップが固定され、安定していることを確認します。
3. 図1Bに示すように、シリンジを使用して左の液体アクセスポートから50μLの液体を加えます。励起レーザーをオフのまま、図1Aに示すAFMヘッドの3つの専用ノブを使用して、読み出しレーザーをカンチレバーに合わせます。これを行うには、白い紙の上でカンチレバーの影を観察しながら、合計を最大化します(シャドウ法)。次に、2つの専用ノブを使用して、レーザースポットをフォトダイオードの中央に配置します。
4. 「Excitation VI」の「 Excitation Enable 」ボックスにチェックを入れてドライブレーザーのスイッチを入れ、位置を合わせると、カンチレバーが作動して発振します。カンチレバー励起信号とカンチレバーたわみ信号を、接続したオシロスコープに表示します。たわみ振動が小さすぎる(または存在しない)場合は、ドライブレーザーがカンチレバーから非常に離れている可能性があります。その場合は、シャドー方式を使用し、偏向レーザーをオフにしておくと位置合わせがしやすくなります。 図1Aに示す駆動レーザー調整ノブを使用して、発振振幅を最大化します。
5. PORTでカンチレバー振動振幅を調整するには、レーザーダイオード制御回路に送られたピークtoピーク電圧(以下、P-P-PAC入力)をソフトウェアの対応する制御にExcitation VIに入力します。レーザダイオードを伝導領域に保ち、したがってレーザを発振するには、レーザダイオード制御回路にDC電圧を追加します(以降、DCオフセット入力)が、これも励起VIの構成ボックスから行います。どちらもレーザー出力にも影響しますが、レーザー出力計で測定でき、カンチレバー振動振幅の調整に使用されます。
6. カンチレバーに適用できる最大光熱励起周波数を決定します。これは、カンチレバーの共振周波数より低くなければなりません。共振周波数は、サーマルチューンまたは周波数スイープによって決定します。この研究で使用されたカンチレバー(AC10DS)は、液体中の共振周波数が約400kHz(空気中1MHz)³⁰であり、300kHz5未満の準静的曲げ領域^{を持っています。}したがって、その制限を下回るPORT周波数(約100〜200 kHz)を使用する必要があります。
7. PORTレートとスキャンレートのイメージングパラメータと設定を、それぞれExcitation VisとScan Visで必要な値に調整します(この記事で使用されているパラメータは、図の説明に記載されています)。セットアップとイメージングパラメータを設定したら、必要なイメージング実験を行い、分子相互作用を観察および追跡します。
   注意: AC10DSカンチレバーは販売されなくなったため、同等のものが利用可能になるまで、FastscanDや^BioLever31 などの代替品を使用する必要がある場合があります。

4. 適切な交互作用曲線の取得

1. 最初に、接触モードに設定されたZコントローラVIのスタートをクリックして、接触モードでサンプル表面にアプローチします。
   1. このモードでは、AFMチップがサンプルに直接接触します。サーフェスに到達したら、Ramp VIで力対距離曲線を実行して、カンチレバーのたわみ感度キャリブレーションを取得します。
   2. また、カンチレバーのばね定数は、干渉計で取得したカンチレバープロバイダーの仕様(精度は低い)から、またはたわみ感度キャリブレーション後のサーマルチューンベースのキャリブレーションを通じて推定します。正確なカンチレバーキャリブレーションは、正確なチップサンプルの力制御に不可欠です。
2. ZコントローラVIの 「上 」をクリックして、先端が表面に届かない表面からZピエゾを完全に引っ込めた後、ZコントローラVIの PORT モードに切り替え、「励起VI」のチェックボックスで励起レーザーをオンにします。まず、AC10DSカンチレバーを使用して、Excitation VIで目的の周波数(この実験的なケースでは100 kHz)で動作するように PORT モードを設定します。
3. 片持ち梁のない振動を、表面に触れないように閉じて記録します。次に、記録する表面に接触しているZコントローラーのフィードバック をオンにして [ 修正 ]をクリックすると、カンチレバーが断続的に表面に接触しているときのカンチレバーの振動(両方ともナノメートル)が得られます。断続的な接触曲線から自由振動曲線を差し引いて真の相互作用曲線を求め、カンチレバースプリング定数(この場合は0.1 N/m)を使用してpNに変換します。

5. HS-AFMイメージング

1. Mg(CH₃COO)₂ の溶液を10 mMの濃度で調製します。ハミルトンシリンジを使用して、調製した10 mM Mg(CH₃COO)₂ 溶液50 μLをカンチレバーホルダーの流体チャネルに注入し、カンチレバーを包み込む液体の滴を生成します。
2. ZコントローラVIの スタート をクリックして、カンチレバーを徐々に表面に近づけます。サーフェスが検出されたら、フィードバック をONにし、 ORTフォースカーブVIで相互作用カーブのピークを見つけます。適切なトラッキングが可能な最小の力の設定値を見つけます(壊れやすいバイオサンプルの損傷を避けるために300 pN未満)。
3. 「スキャン」VIの 「スキャンサイズ 」を800 nm x 800 nmに、「 ラインレート 」を100 Hzに設定します。「スキャン」VIの 「フレーム 」(下)矢印をクリックしてサーフェスをスキャンし、サーフェスの品質を確認します。汚れが検出された場合は、続行する前に、表面、カンチレバー、および/またはカンチレバーホルダーを清掃して問題に対処してください。
4. スキャン後、ZコントローラVIの 引き出し をクリックして、カンチレバーを表面から引っ込めます。カンチレバーホルダーの穴からハミルトンシリンジで緩衝液を取り出し、デッドボリュームの問題を防ぎます。
5. プロトコールのパート1から希釈したDNA 3PS溶液を調製します。希釈したDNA 3PS溶液50 μLをカンチレバーホルダーの専用チャネルに注入します。
6. 手順5.2〜5.3を繰り返し、デフォルトのラインレート100Hz(256ライン×256ピクセル)で800nm×800nmの領域をスキャンして、イメージングプロセスを開始します。最初のスキャン後、Scan VIのイメージングサイズと速度を指定された値に調整して、さらにデータを取得できるようにします。
7. Z Controller VI の設定値 ボックスのチップとサンプルの相互作用の入力力の設定値を、イメージングプロセス全体で適切なトラッキングに必要な最低レベル(300 pN未満)に保ち、特に指定がない限り、サンプルの損傷/乱れを最小限に抑えます。必要なすべてのサンプル領域について、このプロセスを繰り返します。

6. 画像処理

1. カスタマイズされた Pygwy (Python for Gwyddion) バッチ処理コードを実行するための環境を設定し、Python と必要なすべてのライブラリを確保します。詳細については、GwyddionのWebサイト³² がシステムに適切にインストールされています。これにより、コードがスムーズに実行され、必要な機能にアクセスできるようになります。
2. カスタマイズした Pygwy バッチ処理コードを開きます(リクエストに応じて提供)。これにより、画像処理と分析に必要なツールと機能にアクセスできるようになります。
3. 画像処理を開始するには、画像に対して水平方向の中央線補正を実行します。このステップは、スキャンラインに存在する不規則性やアーティファクトを除去し、後続の処理ステップが正確なデータに基づいていることを確認することを目的としています。平面の背景を削除した後、線の補正を適用します。傷跡の除去を使用して、外部要因によって引き起こされる不要なマークや欠陥を排除することにより、画像をさらに強化します。この手順により、画像の全体的な外観が向上します。
4. カラーハイトマップを調整することで、画像の視認性とコントラストを高めます。これにより、関心のある特徴が明確に視覚化され、画像内で目立つようになります。
5. 動画に結合する必要のある処理済みの画像を選択します。ビデオの目的のフレームレートを決定します。この場合は、7 フレーム/秒 (fps) に設定します。
6. 各フレームのデュレーションを計算します。フィジー(ImageJ)を使用して、処理された画像をビデオに結合します。フレームレートとフレーム時間が正しく設定されていることを確認します。

結果

本研究では、HS-PORT AFMの能力を利用して、DNAの3点星モチーフの安定な島への動的集合過程を観察することに成功しました。この技術により、これらの構造の組み立てをリアルタイムでキャプチャすることができました。 図2A、Bでは、100 kHz PORTレート(800 nm x 800 nmスキャンサイズ)で、それぞれ100 Hzと200 Hzのラインレートで鮮明な画像?...

ディスカッション

デリケートな生体試料をイメージングする場合、AFMのオフレゾナンスタッピングイメージングモードは、先端と試料の相互作用力¹⁰を直接制御できるため、特に有用である。その中でも、PORTモードは、より高い発振率に到達できるため、より高いスキャンレートが可能になるという点で際立っています。PORTは直接かつレーザーでカンチレバーを作?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AC10DS	Olympus	BL-AC10FS-A2	Discontinued
Biometra Compact XS/S	Biometra GmbH	846-025-199	Electrophoresis  unit
Biometra TRIO	Biometra GmbH	207072X	thermocycler for annealing
Custom AFM setup	Laboratory for Bio-Nano Instrumentation, Interfaculty Bioengineering Institute, School of Engineering, Ecole Polytechnique Fédérale Lausanne		Obtainable through Laboratory for Bio-Nano Instrumentation
EDTA	ITW Reagents	A5097	In annealing buffer
Laser Power Meter	Thorlabs	PM100D	Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console
Lively 3AP Power Supply, MP-310	Major Science	MP-310	Electrophoresis Power Supply
MgAc2	ABCR GmbH	AB544692	In annealing buffer
TBE	Thermo Scientific	327330010	Running buffer for electrophoresis
TRIS	Bio-Rad	1610719	In annealing buffer