Desarrollo de una sonda de microscopía de fuerza atómica biohíbrida basada en un aguijón de mosquitos

Resumen

Las investigaciones cuantitativas y controladas sobre los comportamientos de picadura de insectos son cruciales para diseñar estrategias efectivas para combatir las enfermedades transmitidas por vectores. En este contexto, se introduce un método para fabricar una sonda de microscopía de fuerza atómica (AFM) biohíbrida.

Resumen

Los mosquitos, conocidos por ser los animales más mortíferos para los humanos debido a su capacidad de transmitir enfermedades, representan un desafío persistente para la salud pública. La estrategia de prevención primaria que se utiliza actualmente consiste en el uso de repelentes químicos, que a menudo resultan ineficaces ya que los mosquitos desarrollan resistencia rápidamente. En consecuencia, la invención de nuevos métodos preventivos es crucial. Tal desarrollo depende de una comprensión profunda de los comportamientos de picadura de mosquitos, lo que requiere una configuración experimental que replique con precisión escenarios reales de picaduras con parámetros de prueba controlables y mediciones cuantitativas. Para cerrar esta brecha, se diseñó una sonda de microscopía de fuerza atómica (AFM) biohíbrida, con un aguijón biológico, específicamente, un labrum de mosquitos, como punta. Esta sonda biohíbrida, compatible con los sistemas AFM estándar, permite una simulación casi auténtica de los comportamientos de penetración de los mosquitos. Este método supone un paso adelante en el estudio cuantitativo de los mecanismos de picadura, lo que podría conducir a la creación de barreras eficaces contra las enfermedades transmitidas por vectores (VBD) y abrir nuevas vías en la lucha contra las enfermedades transmitidas por mosquitos.

Introducción

La Organización Mundial de la Salud (OMS) informó que las enfermedades transmitidas por vectores (VBD) representan más del 17% de todas las enfermedades infecciosas, que causan más de 7.00.000 muertes por año en todo el mundo. Por ejemplo, como el animal más mortífero del mundo, los mosquitos propagan numerosos patógenos, como el dengue, la malaria y el zika, a través de los artrópodos que se alimentan de sangre, lo que resulta en 700 millones de infecciones^{cada año.} Las exploraciones hacia el desarrollo de medidas efectivas para prevenir las VBD son de crucial importancia, incluida la imitación de los comportamientos de penetración de los mosquitos para investigar sus mecanismos de picadura y estudios de barreras potenciales para demostrar su eficacia en la prevención de la penetración. Un desafío clave es desarrollar enfoques adecuados para llevar a cabo tales investigaciones. Se han realizado esfuerzos en la literatura, incluido el desarrollo de agujas a microescala que se asemejan a la geometría de un aguijón de mosquito; sin embargo, muchos de los materiales utilizados para fabricar estas microagujas (es decir, materiales viscoelásticos², silicio (Si), vidrio, cerámica³, etc.) tienen propiedades mecánicas diferentes a las del material biológico de la probóscide del mosquito. Los materiales de ingeniería pueden ser frágiles y propensos a fracturarse y pandearse ^3,4, mientras que la probóscide del mosquito puede resistir mejor la fractura o el pandeo⁴. La ventaja de tener una sonda biohíbrida que utiliza el labrum de un mosquito en lugar de materiales de ingeniería es que puede ser una representación más precisa del mecanismo de perforación de los mosquitos. Además, se deben integrar herramientas especializadas con microagujas para realizar estudios cuantitativos, como la medición precisa de la fuerza⁵, que no se puede lograr fácilmente con configuraciones personalizadas que utilizan microagujas diseñadas.

El enfoque basado en la microscopía de fuerza atómica (AFM) es prometedor porque funciona mediante el empleo de un voladizo con una punta ultrafina que se coloca cuidadosamente cerca de la superficie de una muestra. La punta puede escanear a través o ser presionada hacia/dentro de una superficie, experimentando diferentes fuerzas de atracción o repulsión debido a sus interacciones con una muestra⁶. Estas interacciones conducen a la deflexión del voladizo, que es rastreada por el reflejo de un rayo láser desde la parte superior del voladizo en un fotodetector⁶. La excepcional sensibilidad al movimiento del sistema permite a AFM realizar una amplia gama de mediciones, que incluyen, entre otras, el mapeo morfológico con precisión de pisómetro, mediciones de fuerza que van desde piconewtons hasta micronewtons, e investigaciones multifísicas exhaustivas⁷. Por ejemplo, las indentaciones de AFM se pueden realizar para evaluar con precisión la respuesta a la fuerza aplicada de una muestra y también para medir la dureza, elasticidad y otras propiedades mecánicas de una muestra mediante el acoplamiento con modelos analíticos apropiados⁸. La sonda del AFM está hecha más comúnmente de silicio (Si) o nitruro de silicio (Si₃N₄)⁸ con una longitud de 20-300 μm⁹ y un radio de punta del orden de varios a decenas de nanómetros¹⁰. El radio de la punta a escala nanométrica puede ser ideal para aplicaciones como imágenes de alta resolución; Sin embargo, no posee las características de los aguijones biológicos para los estudios que intentan imitar los comportamientos de penetración en términos de rigidez, radio, forma y relación de aspecto. Por ejemplo, la estructura de la microaguja de un mosquito es el fascículo, que tiene una relación de aspecto de ~60¹¹ (longitud ~1,5 mm a 2 mm; diámetro ~30 μm)¹². Si bien se puede suponer que una sonda AFM convencional se asemeja a un aguijón biológico como un labrum, sus distintas propiedades y dimensiones del material no reflejarán la situación real durante una mordedura.

Para permitir investigaciones cuantitativas de comportamientos de penetración que imitan mordeduras biológicas de insectos u otros animales con aguijones, aquí se desarrolla un proceso para fabricar voladizos AFM biohíbridos con un aguijón biológico como punta. Como caso de estudio, se demostró con éxito un voladizo de AFM con la punta de un labrum de mosquitos adherida. Aprovechando la información existente de la literatura sobre las fuerzas de inserción típicas que utiliza un mosquito para perforar la piel de una víctima^12,13, este voladizo de AFM biohíbrido puede permitir potencialmente la imitación casi real de las picaduras de mosquitos bajo una AFM regular. El protocolo de aprovechamiento de aguijones microbiológicos para fabricar voladizos AFM biohíbridos también se puede aplicar al desarrollo de otros voladizos AFM biohíbridos basados en aguijones afilados para investigaciones cuantitativas de una variedad de mecanismos de mordida.

Terminologías
En la Figura 1 se muestra un esquema de una probóscide y sus componentes de interés, y sus definiciones son (1) Probóscide: una parte del cuerpo de la boca de un mosquito que permite que el mosquito se alimente a sí mismo, con una estructura núcleo-concha compuesta por el fascículo (núcleo) y el labio (caparazón), (2) Labio: la cubierta exterior oscura y roma de una probóscide², (3) Fascículo: un grupo de agujas delgadas contenidas en el interior del labio, incluyendo dos maxilares, dos mandíbulas, una hipofaringe y un labrum², (4) Hipofaringe: responsable de secretar saliva en el torrente sanguíneo del huésped², (5) Maxilares: miembro dentado que ayuda en el mecanismo de alimentación², (5) Mandíbulas: similares al maxilar, ayudan al mosquito en el mecanismo de alimentación y tienen una punta afilada², (6) Labrum: el miembro principal para penetrar la piel de una víctima, que es mucho más grande que los maxilares, las mandíbulas y la hipofaringe. También tiene estructuras sensoriales que le permiten encontrar vasos sanguíneos y canales internos debajo de la piel², (7) Manipulador: un conjunto con tres grados de libertad y precisión a escala de micras para el posicionamiento, lo que permite el movimiento en direcciones XYZ, (8) Conjunto de abrazadera: una abrazadera de 2 partes hecha a medida montada en el manipulador utilizada para sujetar el voladizo AFM sin punta durante el experimento.

Protocolo

La especie de mosquito utilizada para este protocolo es una hembra adulta no infectada de Aedes aegypti (A. aegypti), recibida congelada y almacenada en un congelador a -20 °C. La especie fue proporcionada por el Centro de Recursos de Reactivos de Investigación de Filariasis de NIH/NIAID para su distribución a través de BEI Resources, NIAID, NIH: Aedes aegypti no infectado, cepa Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920. Los reactivos y equipos utilizados para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Disección del labio de la probóscide

1. Con unas pinzas, coloque un mosquito muerto en un portaobjetos de vidrio bajo el microscopio y asegúrese de que haya una punta cónica en el extremo de la probóscide (Figura 2A).
2. Mientras mantiene el mosquito en el portaobjetos de vidrio, coloque una hoja de bisturí suavemente sobre el labio cerca de la cabeza del mosquito (Figura 2B).
3. Proceda a hacer una incisión a través de toda la mitad superior del labio (un corte de aproximadamente 80 μm) con una profundidad de penetración poco profunda a través del grosor del labio. Asegúrese de aplicar una ligera presión sobre la hoja para cortar solo el labio pero no el fascículo que se encuentra debajo.
4. Con un par de pinzas, sujete firmemente la cabeza del mosquito y, con otro par de pinzas de precisión, pellizque ligeramente el labio en cualquier posición entre la punta cónica y la ubicación de la incisión (Figura 2B).
   1. Tire de las pinzas que sujetan el labio en la dirección de la punta cónica (Figura 2C). Continúe tirando de las pinzas hasta que el labio se haya desprendido y se haya retirado por completo del fascículo.
5. Coloque el mosquito bajo el microscopio y verifique si la punta del labrum está presente. Esto se puede identificar por la presencia de una punta cónica en el fascículo (Figura 2D).

2. Separar la punta del labrum de los demás miembros del fascículo

1. Sujete y cierre las puntas de un juego de pinzas de precisión y coloque la punta de las pinzas justo al lado del labrum cerca de su punta.
2. Utilice la punta de la pinza para aplicar una fuerza suave sobre el labrum en la dirección perpendicular a la longitud del fascículo (Figura 3A).
3. Continúe empujando el labrum a través del portaobjetos de vidrio hasta que se logre la separación del labrum de los otros miembros del fascículo.
4. Inspeccione la muestra bajo el microscopio para verificar que se haya logrado una separación adecuada entre el labrum y otros miembros del fascículo (Figura 3, izquierda). Si la separación no se realiza correctamente, consulte el paso 2.1.

3. Cortar la punta del labrum

1. Mientras el labrum todavía está en el portaobjetos de vidrio, coloque una hoja de bisturí sobre el labrum a aproximadamente ~200 μm de distancia de la punta del labrum (Figura 4A). Aplique suavemente suficiente presión y corte la punta del labrum por completo. Si bien lo ideal es que la punta del labrum sea lo más corta posible, ~ 200 μm es lo mejor que puede manejar el enfoque actual.
2. Mida la longitud del labrum cortado para asegurarse de que no supere los 300 μm (Figura 4B) utilizando cualquier software de medición digital. En este protocolo se utilizó ImageJ¹⁴.

4. Agarrar la punta del labrum

1. Con un par de pinzas de precisión, localice y aísle la punta del labrum en el portaobjetos de vidrio. Deseche todas las partes que queden en el portaobjetos de vidrio que no sean la punta del labrum.
2. Con las mismas pinzas de precisión, pellizque lenta y ligeramente el labrum para que el extremo cortado quede libre y no esté obstruido por las pinzas. Además, asegúrese de que la orientación del labrum sea paralela a la dirección de la longitud de las pinzas y que el extremo cortado del labrum apunte en dirección opuesta al cuerpo de las pinzas.
3. Una vez que la muestra esté firmemente apretada, retire la fuerza de sujeción que mantiene unidas las puntas de las pinzas. La punta del labrum se pegará a una de las puntas de las pinzas.
4. Bajo un microscopio, inspeccione las puntas de las pinzas y asegúrese de que la punta del labrum esté presente en una de las puntas de las pinzas (Figura 5). Si la punta del labrum no está en las pinzas, consulte el paso 4.2, y si la punta del labrum no está en las pinzas ni en el portaobjetos de vidrio, consulte el paso 1.

5. Aplicación de epoxi en la viga en voladizo sin punta

1. Coloque una gota (~0,05 ml) de epoxi en el borde de un nuevo portaobjetos de vidrio fundiendo directamente el adhesivo desde su botella/recipiente original. Coloque el portaobjetos de vidrio que contiene epoxi debajo de la estación de sonda y concéntrelo.
2. Monte el voladizo AFM sin punta en el conjunto de abrazadera asegurando la base (es decir, el extremo más grande), dejando el extremo del voladizo libre y suspendido en el espacio. Asegúrese de que la parte inferior del voladizo AFM esté hacia abajo.
3. Monte el manipulador en la estación de sonda.
4. Eleve el eje Z del manipulador a una posición en la que el voladizo sin punta esté unos milímetros por encima del portaobjetos de vidrio que contiene epoxi.
5. Mueva manualmente el manipulador de modo que el voladizo sin punta sea visible en la vista de campo de la cámara en la estación de sonda.
6. Con el manipulador, mueva el voladizo AFM a lo largo de las direcciones X e Y hasta que la punta del voladizo descanse directamente sobre el epoxi en el borde del portaobjetos de vidrio.
7. Usando el manipulador nuevamente, baje lentamente el voladizo sin punta en la dirección Z sobre el borde del portaobjetos de vidrio.
8. A medida que el voladizo se baja y se acerca al portaobjetos de vidrio, siga bajando el voladizo muy lentamente hasta que primero toque el epoxi. No baje más el voladizo.
9. Con cuidado, active el manipulador para mover lentamente el voladizo en la dirección X o Y y retire el voladizo del charco de epoxi moviendo continuamente el voladizo en la dirección seleccionada hasta que el voladizo esté completamente separado del epoxi en el portaobjetos de vidrio. El voladizo sin punta debe tener una burbuja en miniatura de epoxi en su punta, visible debajo de la estación de sonda.
10. Levante el voladizo en la dirección Z con el manipulador.

6. Unir la punta del labrum a la viga en voladizo sin punta

1. Gire el manipulador alrededor del eje largo del voladizo 90 grados y apoye el manipulador en la estación de sonda de lado. En esta configuración, los espesores a lo largo de la longitud del voladizo AFM están en la dirección vertical.
2. Coloque las pinzas de precisión que contienen la punta del labrum debajo de la cámara de la estación de sonda de modo que toda la longitud de la punta del labrum sea visible en el monitor de la computadora.
3. Coloque el conjunto del manipulador que sujeta la abrazadera y el voladizo sin punta debajo de la cámara de la estación de sonda de modo que toda la longitud del voladizo sin punta sea visible en el monitor de la computadora.
4. Enfoque el microscopio de la estación de sonda en la punta del labrum y en el voladizo sin punta.
5. Oriente el voladizo perpendicularmente a la punta del labrum girando cuidadosa y manualmente el manipulador (Figura 6A).
6. Usando los grados de libertad del manipulador, mueva lentamente el voladizo sin punta en las direcciones XY de modo que el pegamento del voladizo haga contacto con el extremo cortado de la punta del labrum (Figura 6B).
7. Cura el epoxi, solidificando la intersección entre el voladizo y el labrum de los mosquitos.
8. Una vez que el epoxi se haya curado, enganche suavemente el manipulador en las direcciones XY y aleje el voladizo de las pinzas, verificando que la punta del labrum esté ahora en la viga del voladizo sin punta (Figura 6C).

Resultados

Las imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de la sonda AFM biohíbrida fabricada se pueden encontrar en la Figura 7. El extremo del labrum se pegó con éxito a la viga en voladizo sin punta. Debido a la curvatura natural de los aguijones de mosquitos y a la operación manual del protocolo presentado, es extremadamente difícil obtener un voladizo con una punta de aguijón perfectamente perpendicular al voladizo. El ángulo descentrado entre el aguijón y una línea central ...

Discusión

El paso 1 del protocolo está destinado a limpiar la muestra biológica del labio no deseado. Para ello, se realiza una incisión en el labio, pero no en el fascículo, que descansa directamente debajo del labio (Figura 1). Debido a que el fascículo y el labio no están unidos en su interfaz (es decir, el labio puede deslizarse libremente a lo largo del fascículo y solo se mantiene en su lugar mediante su unión a la cabeza del mosquito), la incisión realizada está destinada a separar pa...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers	Excelta	N/A	For manipulating/dissecting the proboscis.
C-4D Probe station	Everbeing Int’l Corp	N/A	Used for AFM assembly.
Tipless Tapping Mode Cantilever	NanoAndMore USA	TL-NCH	AFM cantilever used for mounting the labrum. Specs are shown here: Shape: Beam Force Constant: 42 N/m (10 - 130 N/m) Resonance Frequency: 330 kHz (204 - 497 kHz) Length: 125 µm (115 - 135 µm) Width: 30 µm (22.5 - 37.5 µm) Thickness: 4 µm ( 3 - 5 µm)
UV Expoxy	Let's resin	ALR00146	For stinger attachment.