פיתוח גשושית ביו-היברידית מבוססת מיקרוסקופ כוח אטומי מבוסס יתושים

Summary

מחקרים כמותיים ומבוקרים של התנהגויות עקיצת חרקים חיוניים לגיבוש אסטרטגיות יעילות למאבק במחלות המועברות על ידי וקטורים. בהקשר זה מוצגת שיטה לייצור מיקרוסקופ כוח אטומי ביו-היברידי (AFM).

Abstract

יתושים, הידועים לשמצה כבעלי החיים הקטלניים ביותר לבני אדם בשל יכולתם להעביר מחלות, מהווים אתגר מתמשך לבריאות הציבור. אסטרטגיית המניעה העיקרית הנמצאת בשימוש כיום כוללת חומרים דוחי כימיקלים, אשר לעתים קרובות מתגלים כלא יעילים מכיוון שיתושים מפתחים עמידות במהירות. כתוצאה מכך, המצאת שיטות מניעה חדשות היא חיונית. פיתוח כזה תלוי בהבנה מעמיקה של התנהגויות עקיצת יתושים, מה שמחייב מערך ניסויי שמשכפל במדויק תרחישי עקיצה אמיתיים עם פרמטרים של בדיקה נשלטת ומדידות כמותיות. כדי לגשר על פער זה, הונדס מיקרוסקופ כוח אטומי ביו-היברידי (AFM), הכולל עוקץ ביולוגי - במיוחד, לברום יתושים - כקצהו. בדיקה ביו-היברידית זו, התואמת למערכות AFM סטנדרטיות, מאפשרת סימולציה כמעט אותנטית של התנהגויות חדירת יתושים. שיטה זו מסמנת צעד קדימה במחקר הכמותי של מנגנוני עקיצה, מה שעשוי להוביל ליצירת מחסומים יעילים נגד מחלות המועברות על ידי וקטורים (VBDs) ולפתוח אפיקים חדשים במאבק במחלות המועברות על ידי יתושים.

Introduction

ארגון הבריאות העולמי (WHO) דיווח כי מחלות המועברות על ידי וקטורים (VBDs) מהוות מעל 17% מכלל המחלות הזיהומיות, הגורמות ליותר מ -7,00,000 מקרי מוות בשנה ברחבי העולם. לדוגמה, כחיה הקטלנית ביותר בעולם, יתושים מפיצים פתוגנים רבים, כגון דנגי, מלריה וזיקה, באמצעות פרוקי רגליים הניזונים מדם, וכתוצאה מכך 700 מיליון זיהומים מדי שנה¹. מחקרים לקראת פיתוח אמצעים יעילים למניעת VBDs הם בעלי חשיבות מכרעת, כולל חיקוי התנהגויות החדירה של יתושים כדי לחקור את מנגנוני העקיצה שלהם ומחקרים על חסמים פוטנציאליים כדי להוכיח את יעילותם במניעת חדירה. אתגר מרכזי אחד הוא לפתח גישות מתאימות לביצוע חקירות כאלה. נעשו מאמצים בספרות, כולל פיתוח מחטים בקנה מידה זעיר הדומות לגיאומטריה של עוקץ יתושים; עם זאת, רבים מהחומרים המשמשים לייצור מיקרו-מחטים אלה (כלומר, חומרים ויסקו-אלסטיים², סיליקון (Si), זכוכית, קרמיקה³ וכו ') הם בעלי תכונות מכניות שונות מאשר החומר הביולוגי של היתוש. החומרים המהונדסים יכולים להיות שבירים ונוטים לשבר ואבזמים ^3,4, בעוד שחוטמו של היתוש יכול לעמוד בשבר או באבזם טוב יותר⁴. היתרון של בדיקה ביו-היברידית המשתמשת בלברום של יתוש במקום בחומרים מהונדסים הוא שהיא יכולה להיות ייצוג מדויק יותר של מנגנון הפירסינג של יתושים. כמו כן, יש לשלב כלים מיוחדים עם מחטי מיקרו לביצוע מחקרים כמותיים, כגון מדידה מדויקת של כוח⁵, שאינה ניתנת להשגה בקלות עם הגדרות מותאמות אישית באמצעות מיקרו-מחטים מהונדסות.

הגישה המבוססת על מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מבטיחה בכך שהיא פועלת על ידי שימוש במקל עם קצה דק במיוחד הממוקם בזהירות קרוב לפני השטח של הדגימה. הקצה יכול לסרוק לרוחב או להילחץ לכיוונ/לתוך משטח, חווה כוחות מושכים או דוחים משתנים עקב האינטראקציות שלו עם מדגם⁶. אינטראקציות אלה מובילות לסטייה של הקנטילבר, אשר עוקבת על ידי השתקפות של קרן לייזר מראש הקנטיליבר אל פוטו-גלאי⁶. הרגישות יוצאת הדופן לתנועה של המערכת מאפשרת ל-AFM לבצע מגוון רחב של מדידות, כולל, אך לא רק, מיפוי מורפולוגי בדיוק פיקומטר, מדידות כוח החל מפיקוניוטון ועד מיקרוניוטון, וחקירות מולטיפיזיקליות מקיפות⁷. לדוגמה, ניתן לבצע הזחות AFM כדי להעריך במדויק את התגובה לכוח המופעל של מדגם וגם כדי למדוד את הקשיות, האלסטיות ותכונות מכניות אחרות של מדגם על ידי צימוד עם מודלים אנליטיים מתאימים⁸. הגשושית של AFM עשויה לרוב מסיליקון (Si) או סיליקון ניטריד (Si₃N₄)⁸ באורך של 20-300 מיקרומטר⁹ ורדיוס קצה בסדר גודל של כמה עד עשרות ננומטרים¹⁰. רדיוס קצה קנה המידה הננומטרי יכול להיות אידיאלי עבור יישומים כגון הדמיה ברזולוציה גבוהה; עם זאת, אין לו את המאפיינים של עוקצים ביולוגיים למחקרים המנסים לחקות התנהגויות חדירה במונחים של נוקשות, רדיוס, צורה ויחס גובה-רוחב. לדוגמה, מבנה המיקרו-מחט של יתוש הוא הפשיקל, שיש לו יחס גובה-רוחב של ~60¹¹ (אורך ~ 1.5 מ"מ עד 2 מ"מ; קוטר ~ 30 מיקרומטר)¹². בעוד שניתן להניח שגשושית AFM קונבנציונלית דומה לעקיצות ביולוגיות כמו לברום, התכונות והממדים החומריים הייחודיים שלה לא ישקפו את המצב האמיתי במהלך נשיכה.

כדי לאפשר חקירה כמותית של התנהגויות חדירה המחקות עקיצות ביולוגיות של חרקים או בעלי חיים אחרים עם עוקץ, כאן מפותח תהליך לייצור מכלי AFM ביו-היברידיים עם עוקץ ביולוגי כקצהו. כמקרה בוחן, הודגם בהצלחה מקל AFM עם קצה לברום יתוש מחובר. תוך רתימת מידע קיים מהספרות על כוחות ההחדרה האופייניים שיתוש משתמש בהם כדי לחדור דרך עורו של קורבן^12,13, AFM ביו-היברידי זה יכול לאפשר חיקוי כמעט אמיתי של עקיצות יתושים תחת AFM רגיל. הפרוטוקול של מינוף עוקצים מיקרו-ביולוגיים לייצור מיכלי AFM ביו-היברידיים יכול להיות מיושם גם בפיתוח של מכלי AFM ביו-היברידיים חדים אחרים מבוססי עוקץ חד לחקירות כמותיות של מגוון מנגנוני נשיכה.

טרמינולוגיות
סכמה של חוטם ומרכיבי העניין שלו מוצגים באיור 1, וההגדרות שלהם הן: (1) פרובוסקיס: חלק גוף מפיו של יתוש המאפשר ליתוש להאכיל את עצמו, עם מבנה של קליפת ליבה המורכב מהפשקוויל (הליבה) והלאביום (קונכייה), (2) לאביום: הכיסוי החיצוני הכהה והקהה של חוטם², (3) פשקוויל: קבוצה של מחטים דקות הכלולות בתוך הלביום, כולל שתי מקסילות, שתי לסתות, היפופרינקס ולברום², (4) היפופרינקס: אחראי על הפרשת רוק למחזור הדם של הפונדקאי², (5) מקסילה: חבר משונן המסייע במנגנון ההזנה², (5) מנדבלים: בדומה למקסילה, הם מסייעים ליתוש במנגנון ההזנה ויש להם קצה חד², (6) לברום: האיבר העיקרי לחדירה לעור הקורבן, שהוא הרבה יותר גדול מהמקסילה, הלסת התחתונה וההיפופרינקס. יש לו גם מבנים חושיים המאפשרים לו למצוא כלי דם ותעלות פנימיות מתחת לעור², (7) מניפולטור: הרכבה עם שלוש דרגות חופש ודיוק בקנה מידה מיקרוני למיקום, המאפשר תנועה בכיווני XYZ, (8) הרכבת מהדק: מהדק 2 חלקים בהתאמה אישית המורכב על המניפולטור המשמש להידוק ה- AFM חסר הקצה במהלך הניסוי.

Protocol

מין היתושים המשמש לפרוטוקול זה הוא נקבה בוגרת לא נגועה Aedes aegypti (A. aegypti), שקיבלה הקפאה ואוחסנה במקפיא של -20 מעלות צלזיוס. המין סופק על ידי NIH/NIAID Filariasis Research Reagent Resource Center להפצה באמצעות BEI Resources, NIAID, NIH: Uninfected Aedes aegypti, Strain Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920. הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. לנתח את labium מן proboscis

1. בעזרת פינצטה, הניחו יתוש מת על מגלשת זכוכית מתחת למיקרוסקופ וודאו שיש קצה מחודד בקצה החוטם (איור 2A).
2. בזמן שאתם שומרים את היתוש על מגלשת הזכוכית, הניחו להב אזמל בעדינות מעל הלביום ליד ראשו של היתוש (איור 2B).
3. ממשיכים לבצע חתך לאורך כל החצי העליון של הלביום (חתך של כ 80 מיקרומטר) עם עומק חדירה רדוד דרך עובי הלביום. הקפידו להפעיל לחץ קל על הלהב כדי לחתוך רק את הלביום אך לא את הפאשקוויל שנמצא מתחת.
4. בעזרת זוג פינצטה, החזיקו היטב את ראש היתוש, ובעזרת זוג פינצטה מדויק נוסף, צבטו קלות את הלביום בכל מיקום בין הקצה המחודד למיקום החתך (איור 2B).
   1. משכו את הפינצטה שמחזיקה את הלביום לכיוון הקצה המחודד (איור 2C). המשיכו למשוך את הפינצטה עד שהלביום נקרע והוסר לחלוטין מהפשקוויל.
5. הניחו את היתוש מתחת למיקרוסקופ ובדקו אם קצה הלברום קיים. אפשר לזהות זאת על-ידי נוכחות של קצה מחודד על הפשקוויל (איור 2D).

2. הפרדת קצה הלברום משאר חברי הפשקוויל

1. מהדקים וסוגרים את הקצוות של סט פינצטות מדויקות ומניחים את קצה הפינצטה ממש ליד הלברום ליד קצהו.
2. השתמשו בקצה הפינצטה כדי להפעיל כוח עדין על הלברום בכיוון המאונך לאורך הפאשקוויל (איור 3A).
3. המשיכו לדחוף את הלברום על פני מגלשת הזכוכית עד שתושג הפרדה של הלברום משאר חברי הפשקוויל.
4. בדקו את הדגימה תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהושגה הפרדה נכונה בין הלברום לבין חברי פשקוויל אחרים (איור 3, משמאל). אם ההפרדה נכשלה, עיין שוב בשלב 2.1.

3. חיתוך קצה הלברום

1. בזמן שהלברום עדיין על מגלשת הזכוכית, הניחו להב אזמל מעל הלברום במרחק של כ~200 מיקרומטר מקצה הלברום (איור 4A). הפעילו בעדינות לחץ מספיק וחתכו את קצה הלברום עד הסוף. בעוד קצה הלברום צריך להיות קצר ככל האפשר, ~ 200 מיקרומטר הוא הטוב ביותר שהגישה הנוכחית יכולה להתמודד איתו.
2. מדדו את אורך הלברום החתוך כדי לוודא שאורכו אינו עולה על 300 מיקרומטר (איור 4B) באמצעות כל תוכנת מדידה דיגיטלית. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש ב- ImageJ¹⁴.

4. תופסים את קצה הלברום

1. בעזרת זוג פינצטות מדויקות, אתרו ובודדו את קצה הלברום במגלשת הזכוכית. השליכו את כל החלקים שנותרו על מגלשת הזכוכית מלבד קצה הלברום.
2. עם אותה פינצטה מדויקת, צובטים לאט ובקלילות את הלברום כך שהקצה החתוך חופשי וללא הפרעה על ידי הפינצטה. כמו כן, יש לוודא שהכיוון של הלברום מקביל לכיוון אורך הפינצטה והקצה החתוך של הלברום מצביע הרחק מגוף הפינצטה.
3. לאחר שהדגימה נצבטה היטב, הסירו את כוח ההידוק המחזיק את קצות הפינצטה יחד. קצה הלברום יידבק לאחד מקצות הפינצטה.
4. תחת מיקרוסקופ, בדקו את קצות הפינצטה וודאו שקצה הלברום נמצא על אחד מקצות הפינצטה (איור 5). אם קצה הלברום אינו נמצא בפינצטה, יש לחזור לשלב 4.2, ואם קצה הלברום אינו על הפינצטה וגם לא על מגלשת הזכוכית, יש לחזור לשלב 1.

5. מריחת אפוקסי על קרן הקצוות

1. הניחו טיפה (~0.05 מ"ל) אפוקסי על קצה מגלשת זכוכית חדשה על ידי הטלת הדבק ישירות מהבקבוק/מיכל המקורי שלו. הניחו את מגלשת הזכוכית המכילה אפוקסי מתחת לתחנת הבדיקה והתמקדו בה.
2. הרכיבו את מכלול המהדק ללא קצה על מכלול המהדק על ידי אבטחת הבסיס (כלומר, הקצה הגדול יותר), והותירו את קצה הפתח חופשי ותלוי בחלל. ודא שהחלק התחתון של מזנון AFM פונה כלפי מטה.
3. הרכיבו את המניפולטור על תחנת הבדיקה.
4. הרם את ציר Z של המניפולטור למצב שבו הקנטייבר חסר הקצה נמצא כמה מילימטרים מעל מגלשת הזכוכית המכילה אפוקסי.
5. הזז ידנית את המניפולטור כך שהמעצור חסר הקצה יהיה גלוי בתצוגת השדה של המצלמה בתחנת הבדיקה.
6. באמצעות המניפולטור, הזיזו את ה-AFM לאורך כיווני X ו-Y עד שקצה המזנון מונח ישירות מעל האפוקסי בקצה מגלשת הזכוכית.
7. בעזרת המניפולטור שוב, הורידו באיטיות את המזנון חסר הקצה בכיוון Z מעבר לקצה מגלשת הזכוכית.
8. כאשר המזנון מונמך ומתקרב למגלשת הזכוכית, המשיכו להוריד את המזנון לאט מאוד עד שהוא נוגע לראשונה באפוקסי. אין להנמיך את המגן עוד.
9. בזהירות, הפעילו את המניפולטור כדי להזיז את הקנטיל באיטיות בכיוון X או Y והסירו את הקנטיל ממאגר האפוקסי על ידי הזזת הקנטיל ברציפות בכיוון שנבחר עד שהקנטיל מופרד לחלוטין מהאפוקסי במגלשת הזכוכית. למיכל חסר הקצה צריכה להיות בועה מיניאטורית של אפוקסי בקצהו, הנראית מתחת לתחנת הבדיקה.
10. הרם את המגן בכיוון Z באמצעות המניפולטור.

6. הצמדת קצה הלברום לקורה ללא קצה

1. סובב את המניפולטור על הציר הארוך של הקנילטור ב -90 מעלות והנח את המניפולטור על תחנת הבדיקה על צידו. בתצורה זו, העוביים לאורך ה-AFM הוא בכיוון האנכי.
2. מקם את הפינצטה המדויקת המכילה את קצה הלברום מתחת למצלמת תחנת הבדיקה, כך שכל אורך קצה הלברום יהיה גלוי על צג המחשב.
3. מקם את מכלול המניפולטור המחזיק את המהדק ואת הקנטליבר חסר הקצה מתחת למצלמת תחנת הגשוש, כך שכל אורכו של המהדק ללא קצה נראה על צג המחשב.
4. מקדו את המיקרוסקופ של תחנת הגשושית על קצה הלברום ועל הקנטיליבר חסר החוד.
5. כיוון את המזנון בניצב לקצה הלברום על-ידי סיבוב זהיר וידני של המניפולטור (איור 6A).
6. באמצעות דרגות החופש של המניפולטור, הזיזו באיטיות את הקנטיליבר חסר הקצה בכיווני XY כך שהדבק שעל הקנטיל ייגע בקצה החתוך של קצה הלברום (איור 6B).
7. לרפא את אפוקסי, מצק את המפגש בין cantilever ו יתושים labrum.
8. לאחר שהאפוקסי נרפא, הפעילו בעדינות את המניפולטור בכיווני XY והרחיקו את המזנון מהפינצטה, תוך אימות שקצה הלברום עומד כעת על קרן הקנטיל חסרת הקצה (איור 6C).

תוצאות

תמונות של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) של גשושית AFM ביו-היברידית מפוברקת ניתן למצוא באיור 7. קצה הלברום הודבק בהצלחה לקורה חסרת החוד. בשל העקמומיות הטבעית של עוקץ יתושים ואת הפעולה הידנית של הפרוטוקול המוצג, קשה מאוד להשיג cantilever עם קצה עוקץ בניצב לחלוטין cantilever. הזווית הלא מר...

Discussion

שלב 1 של הפרוטוקול נועד לנקות את הדגימה הביולוגית של הלביום הלא רצוי. כדי להשיג זאת, מבצעים חתך על הלביום, אבל לא על הפשקוויל, שנמצא ישירות מתחת ללאביום (איור 1). מכיוון שהפאשיל והלביום אינם מחוברים זה לזה בממשק שלהם (כלומר, הלביום חופשי להחליק לאורך הפאשקוויל ונשמר במקומו רק ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers	Excelta	N/A	For manipulating/dissecting the proboscis.
C-4D Probe station	Everbeing Int’l Corp	N/A	Used for AFM assembly.
Tipless Tapping Mode Cantilever	NanoAndMore USA	TL-NCH	AFM cantilever used for mounting the labrum. Specs are shown here: Shape: Beam Force Constant: 42 N/m (10 - 130 N/m) Resonance Frequency: 330 kHz (204 - 497 kHz) Length: 125 µm (115 - 135 µm) Width: 30 µm (22.5 - 37.5 µm) Thickness: 4 µm ( 3 - 5 µm)
UV Expoxy	Let's resin	ALR00146	For stinger attachment.