Desenvolvimento de uma sonda de microscopia de força atômica baseada em ferrão de mosquito bio-híbrido

Resumo

Investigações quantitativas e controladas sobre comportamentos de picada de insetos são cruciais para a elaboração de estratégias eficazes de combate a doenças transmitidas por vetores. Neste contexto, é introduzido um método para fabricar uma sonda de microscopia de força atômica (AFM) bio-híbrida.

Resumo

Os mosquitos, notórios como os animais mais mortais para os seres humanos devido à sua capacidade de transmitir doenças, representam um desafio persistente para a saúde pública. A estratégia de prevenção primária atualmente em uso envolve repelentes químicos, que muitas vezes se mostram ineficazes, pois os mosquitos desenvolvem resistência rapidamente. Consequentemente, a invenção de novos métodos preventivos é crucial. Esse desenvolvimento depende de uma compreensão completa dos comportamentos de picada de mosquito, necessitando de uma configuração experimental que reproduza com precisão os cenários reais de picada com parâmetros de teste controláveis e medições quantitativas. Para preencher essa lacuna, uma sonda de microscopia de força atômica bio-híbrida (AFM) foi projetada, apresentando um ferrão biológico - especificamente, um labrum de mosquito - como sua ponta. Esta ponta de prova bio-híbrida, compatível com sistemas padrão do AFM, permite uma simulação quase autêntica de comportamentos da penetração do mosquito. Este método marca um passo à frente no estudo quantitativo dos mecanismos de picada, potencialmente levando à criação de barreiras eficazes contra doenças transmitidas por vetores (VBDs) e abrindo novos caminhos na luta contra doenças transmitidas por mosquitos.

Introdução

A Organização Mundial da Saúde (OMS) informou que as doenças transmitidas por vetores (VBDs) são responsáveis por mais de 17% de todas as doenças infecciosas, que causam mais de 7,00,000 mortes por ano em todo o mundo. Por exemplo, como o animal mais mortal do mundo, os mosquitos espalham vários patógenos, como dengue, malária e zika, por meio de artrópodes que se alimentam de sangue, resultando em 700 milhões de infecções a cada ano¹. Explorações para o desenvolvimento de medidas eficazes para prevenir VBDs são de importância crucial, incluindo imitar os comportamentos de penetração de mosquitos para investigar seus mecanismos de picada e estudos de barreiras potenciais para provar sua eficácia na prevenção da penetração. Um dos principais desafios é desenvolver abordagens adequadas para realizar tais investigações. Esforços têm sido feitos na literatura, incluindo o desenvolvimento de agulhas em microescala que se assemelham à geometria de um ferrão de mosquito; no entanto, muitos dos materiais usados para fazer essas microagulhas (ou seja, materiais viscoelásticos², silício (Si), vidro, cerâmica³, etc.) têm propriedades mecânicas diferentes do material biológico da tromba do mosquito. Os materiais de engenharia podem ser quebradiços e propensos a fraturas e flambagens ^3,4, enquanto a tromba do mosquito pode suportar melhor fraturas ou flambagens⁴. O benefício de ter uma sonda bio-híbrida usando o labrum de um mosquito em vez de materiais de engenharia é que ela pode ser uma representação mais precisa do mecanismo de perfuração dos mosquitos. Além disso, ferramentas especializadas devem ser integradas com microagulhas para realizar estudos quantitativos, como a medição precisa da força⁵, o que não é facilmente alcançável com configurações personalizadas usando microagulhas projetadas.

A abordagem baseada em microscopia de força atômica (AFM) é promissora, pois opera empregando um cantilever com uma ponta ultrafina que é cuidadosamente posicionada perto da superfície de uma amostra. A ponta pode escanear ou ser pressionada em direção a uma superfície, experimentando forças atrativas ou repulsivas variadas devido às suas interações com uma amostra⁶. Essas interações levam à deflexão do cantilever, que é rastreada pelo reflexo de um feixe de laser do topo do cantilever para um fotodetector⁶. A sensibilidade excepcional ao movimento do sistema permite que o AFM conduza uma escala diversa de medições, incluindo mas não limitadas ao mapeamento morfológico com precisão do picômetro, às medidas da força que variam dos piconewtons aos micronewtons, e às investigações multifísicas detalhadas⁷. Por exemplo, as reentrâncias do AFM podem ser executadas para avaliar precisamente a resposta à força aplicada de uma amostra e igualmente para medir a dureza, a elasticidade, e outras propriedades mecânicas de uma amostra acoplando com os modelos analíticos apropriados⁸. A ponta de prova do AFM é feita o mais geralmente do silicone (Si) ou do nitreto de silicone (Si₃N₄)⁸ com um comprimento do μm⁹ de 20-300 e de um raio da ponta na ordem de diversos às dezenas dos nanômetros¹⁰. O raio da ponta da escala nanométrica pode ser ideal para aplicações como imagens de alta resolução; no entanto, não possui as características dos ferrões biológicos para estudos que tentam imitar comportamentos de penetração em termos de rigidez, raio, forma e proporção. Por exemplo, a estrutura da microagulha de um mosquito é o fascículo, que tem uma proporção de ~ 60¹¹ (comprimento ~ 1,5 mm a 2 mm; diâmetro ~ 30 μm) ¹² . Quando uma ponta de prova convencional do AFM puder ser suposta assemelhar-se a um ferrão biológico como um labrum, suas propriedades e dimensões materiais distintas não refletirão a situação real durante uma mordida.

Para permitir investigações quantitativas de comportamentos de penetração que imitam mordidas biológicas de insetos ou outros animais com ferrões, aqui, um processo para fabricar balanços AFM bio-híbridos com um ferrão biológico à medida que sua ponta é desenvolvido. Como um estudo de caso, um modilhão do AFM com a ponta de um labrum do mosquito unido foi demonstrado com sucesso. Aproveitando as informações existentes da literatura sobre as forças de inserção típicas que um mosquito usa para perfurar a pele de uma vítima^12,13, este cantilever AFM bio-híbrido pode potencialmente permitir uma imitação quase real de picadas de mosquito sob um AFM regular. O protocolo de alavancar micro ferrões biológicos para fabricar os cantilares bio-híbridos do AFM pode igualmente ser aplicado ao desenvolvimento de outros suportes biohíbridos afiados-baseados ferrão-baseados do AFM para investigações quantitativas de uma variedade de mecanismos de mordida.

Terminologias
Um esquema de uma tromba e seus componentes de interesse são mostrados na Figura 1, e suas definições são (1) Probóscide: uma parte do corpo da boca de um mosquito que permite que o mosquito se alimente, com uma estrutura núcleo-concha composta pelo fascículo (núcleo) e o lábio (concha), (2) Lábio: a cobertura externa escura e romba de uma tromba², (3) Fascículo: um grupo de agulhas delgadas contidas dentro do lábio, incluindo duas maxilas, duas mandíbulas, uma hipofaringe e um lábio², (4) Hipofaringe: responsável pela secreção de saliva na corrente sanguínea do hospedeiro², (5) Maxilas: membro serrilhado auxiliando no mecanismo de alimentação², (5) Mandíbulas: semelhantes à maxila, auxiliam o mosquito no mecanismo de alimentação e têm uma ponta afiada², (6) Labrum: o principal membro para penetrar na pele de uma vítima, que é muito maior que as maxilas, mandíbulas e hipofaringe. Igualmente tem estruturas sensoriais que lhe permitem encontrar vasos sanguíneos e canais internos sob a pele², (7) Manipulador: um conjunto com três graus de liberdade e precisão da mícron-escala para o posicionamento, permitindo o movimento em sentidos de XYZ, (8) Conjunto da braçadeira: uma braçadeira feito-à-medida de 2 partes montada ao manipulador usado para prender o modilhão sem ponta do AFM durante a experiência.

Protocolo

A espécie de mosquito utilizada para este protocolo é uma fêmea adulta não infectada Aedes aegypti (A. aegypti), recebida congelada e armazenada em freezer de -20 °C. A espécie foi fornecida pelo Centro de Recursos de Reagentes de Pesquisa de Filariose do NIH / NIAID para distribuição através da BEI Resources, NIAID, NIH: Aedes aegypti não infectado, cepa Black Eye Liverpool (congelado), NR-48920. Os reagentes e equipamentos utilizados para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Dissecando o lábio da tromba

1. Usando uma pinça, coloque um mosquito morto em uma lâmina de vidro sob o microscópio e certifique-se de que haja uma ponta cônica na extremidade da tromba (Figura 2A).
2. Enquanto mantém o mosquito na lâmina de vidro, coloque uma lâmina de bisturi suavemente sobre o lábio perto da cabeça do mosquito (Figura 2B).
3. Proceda a uma incisão em toda a metade superior do lábio (um corte de aproximadamente 80 μm) com uma profundidade de penetração rasa através da espessura do lábio. Certifique-se de aplicar uma leve pressão na lâmina para cortar apenas o lábio, mas não o fascículo que fica abaixo.
4. Com uma pinça, segure firmemente a cabeça do mosquito e, com outra pinça de precisão, aperte levemente o lábio em qualquer posição entre a ponta cônica e o local da incisão (Figura 2B).
   1. Puxe a pinça que segura o lábio na direção da ponta cônica (Figura 2C). Continue puxando a pinça até que o lábio se solte e seja totalmente removido do fascículo.
5. Coloque o mosquito sob o microscópio e verifique se a ponta do labrum está presente. Isso pode ser identificado pela presença de uma ponta cônica no fascículo (Figura 2D).

2. Separando a ponta do labrum dos outros membros do fascículo

1. Prenda e feche as pontas de um conjunto de pinças de precisão e coloque a ponta da pinça ao lado do labrum perto de sua ponta.
2. Use a ponta da pinça para aplicar uma força suave no lábio na direção perpendicular ao comprimento do fascículo (Figura 3A).
3. Continue empurrando o labrum pela lâmina de vidro até que a separação do labrum dos outros membros do fascículo seja alcançada.
4. Inspecione a amostra ao microscópio para verificar se a separação adequada entre o labrum e outros membros do fascículo foi alcançada (Figura 3, à esquerda). Se a separação não for bem-sucedida, consulte a etapa 2.1.

3. Cortando a ponta do labrum

1. Enquanto o labrum ainda está na lâmina de vidro, coloque uma lâmina de bisturi sobre o labrum a aproximadamente ~ 200 μm de distância da ponta do labrum ( Figura 4A ). Aplique suavemente pressão suficiente e corte a ponta do labrum até o fim. Embora a ponta do labrum deva ser idealmente a mais curta possível, ~ 200 μm é o melhor que a abordagem atual pode suportar.
2. Meça o comprimento do labrum cortado para garantir que não seja superior a 300 μm (Figura 4B) usando qualquer software de medição digital. Nesse protocolo, foi utilizado o ImageJ¹⁴.

4. Agarrando a ponta do labrum

1. Com uma pinça de precisão, localize e isole a ponta do labrum na lâmina de vidro. Descarte todas as partes restantes na lâmina de vidro, exceto a ponta do labrum.
2. Com a mesma pinça de precisão, aperte lenta e levemente o labrum para que a extremidade cortada fique livre e desobstruída pelas pinças. Além disso, certifique-se de que a orientação do labrum esteja paralela à direção do comprimento da pinça e que a extremidade cortada do labrum esteja apontando para longe do corpo da pinça.
3. Assim que a amostra estiver firmemente presa, remova a força de fixação que prende as pontas das pinças. A ponta do labrum grudará em uma das pontas da pinça.
4. Sob um microscópio, inspecione as pontas das pinças e certifique-se de que a ponta do labrum esteja presente em uma das pontas das pinças (Figura 5). Se a ponta do labrum não estiver na pinça, consulte a etapa 4.2 e, se a ponta do labrum não estiver na pinça nem na lâmina de vidro, consulte a etapa 1.

5. Aplicação de epóxi na viga cantilever sem ponta

1. Coloque uma gota (~0,05 mL) de epóxi na borda de uma nova lâmina de vidro, fundindo diretamente o adesivo de seu frasco/recipiente original. Coloque a corrediça de vidro contendo epóxi sob a estação de sonda e concentre-se nela.
2. Monte o modilhão sem ponta do AFM ao conjunto da braçadeira fixando a base (isto é, a extremidade maior), deixando a extremidade do modilhão livre e suspendida no espaço. Certifique-se de que a parte inferior do cantilever AFM esteja voltada para baixo.
3. Monte o manipulador na estação de sonda.
4. Levante o eixo Z do manipulador para uma posição em que o cantilever sem ponta esteja alguns milímetros acima da corrediça de vidro contendo epóxi.
5. Mova manualmente o manipulador de forma que o cantilever sem ponta seja visível no campo view da câmera na estação de sonda.
6. Usando o manipulador, mova o modilhão AFM ao longo das direções X e Y até que a ponta do cantilever esteja descansando diretamente acima do epóxi na borda da corrediça de vidro.
7. Usando o manipulador novamente, abaixe lentamente o cantilever sem ponta na direção Z sobre a borda da lâmina de vidro.
8. À medida que o cantilever é abaixado e se aproxima da corrediça de vidro, continue abaixando o cantilever muito lentamente até que ele toque primeiro no epóxi. Não baixe mais o cantilever.
9. Com cuidado, engate o manipulador para mover lentamente o cantilever na direção X ou Y e remova o cantilever da poça de epóxi movendo continuamente o cantilever na direção selecionada até que o cantilever esteja totalmente separado do epóxi na corrediça de vidro. O cantilever sem ponta deve ter uma bolha em miniatura de epóxi em sua ponta, visível sob a estação de sonda.
10. Levante o cantilever na direção Z usando o manipulador.

6. Colagem da ponta do labrum à viga cantilever sem ponta

1. Gire o manipulador em torno do eixo longo do balanço em 90 graus e apoie o manipulador na estação de sonda de lado. Nesta configuração, as espessuras ao longo do comprimento do modilhão do AFM estão no sentido vertical.
2. Posicione as pinças de precisão que contêm a ponta do labrum sob a câmera da estação de sonda de modo que todo o comprimento da ponta do labrum fique visível no monitor do computador.
3. Posicione o conjunto do manipulador segurando o grampo e o cantilever sem ponta sob a câmera da estação de sonda de modo que todo o comprimento do cantilever sem ponta fique visível no monitor do computador.
4. Concentre o microscópio da estação de sonda na ponta do labrum e no balanço sem ponta.
5. Oriente o cantilever perpendicularmente à ponta do labrum girando cuidadosa e manualmente o manipulador (Figura 6A).
6. Usando os graus de liberdade do manipulador, mova lentamente o cantilever sem ponta nas direções XY de modo que a cola no cantilever entre em contato com a extremidade cortada da ponta do labrum (Figura 6B).
7. Cure o epóxi, solidificando a interseção entre o cantilever e o labrum do mosquito.
8. Uma vez que o epóxi tenha curado, engate suavemente o manipulador nas direções XY e afaste o cantilever das pinças, verificando se a ponta do labrum está agora apoiada na viga cantilever sem ponta (Figura 6C).

Resultados

As imagens da microscopia eletrônica da exploração (SEM) da ponta de prova bio-híbrida fabricada do AFM podem ser encontradas na figura 7. A extremidade do labrum foi colada com sucesso à viga cantilever sem ponta. Devido à curvatura natural dos ferrões de mosquito e ao funcionamento manual do protocolo apresentado, é extremamente difícil obter um cantilever com uma ponta de ferrão perfeitamente perpendicular ao cantilever. O ângulo descentralizado entre o ferrão e uma linha cent...

Discussão

A etapa 1 do protocolo destina-se a limpar a amostra biológica do lábio indesejado. Para isso, é feita uma incisão no lábio, mas não no fascículo, que repousa diretamente abaixo do lábio (Figura 1). Como o fascículo e o lábio não estão unidos em sua interface (ou seja, o lábio está livre para deslizar ao longo do fascículo e só é mantido no lugar por sua fixação à cabeça do mosquito), a incisão realizada destina-se a separar parte do lábio da cabeça do mosquito, facil...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers	Excelta	N/A	For manipulating/dissecting the proboscis.
C-4D Probe station	Everbeing Int’l Corp	N/A	Used for AFM assembly.
Tipless Tapping Mode Cantilever	NanoAndMore USA	TL-NCH	AFM cantilever used for mounting the labrum. Specs are shown here: Shape: Beam Force Constant: 42 N/m (10 - 130 N/m) Resonance Frequency: 330 kHz (204 - 497 kHz) Length: 125 µm (115 - 135 µm) Width: 30 µm (22.5 - 37.5 µm) Thickness: 4 µm ( 3 - 5 µm)
UV Expoxy	Let's resin	ALR00146	For stinger attachment.