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Resumen

Este manuscrito describe los procedimientos operativos y las precauciones para investigar los posibles mecanismos patogénicos comunes que vinculan el síndrome de Sjögren primario y el adenocarcinoma de pulmón a través del análisis bioinformático y la verificación experimental.

Resumen

Este estudio tuvo como objetivo investigar los posibles mecanismos patogénicos comunes que vinculan el síndrome de Sjögren primario (pSS) y el adenocarcinoma de pulmón (LUAD) a través del análisis bioinformático y la verificación experimental. Los genes relevantes asociados con pSS y LUAD se recuperaron de la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) y de la base de datos Genecard. Posteriormente, los genes expresados diferencialmente (DEGs) asociados con pSS y LUAD se examinaron como pSS-LUAD-DEGs. Se realizaron análisis de enriquecimiento de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) y de Gene Ontology (GO) para dilucidar las funciones biológicas significativas de los pSS-LUAD-DEG. Los objetivos principales se identificaron mediante la construcción de la red de interacción proteína-proteína (PPI), evaluando aún más la precisión del diagnóstico del gen central a través de análisis de la curva de características operativas del receptor (ROC). En este estudio, los ratones NOD/Ltj sirvieron como modelos animales pSS y fueron estimulados con material particulado 2.5 (PM2.5) para generar una reacción inflamatoria. Se empleó la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR), el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y la transferencia de Western para la verificación relevante del experimento de biología molecular. Los resultados revelados a través de los análisis de enriquecimiento de KEGG y GO indican que la inflamación desempeña un papel fundamental en la vinculación de pSS y LUAD. IL6, CCNA2, JAK2, IL1B, ASPM, CCNB2, NUSAP1 y CEP55 se determinaron como objetivos clave de pSS-LUAD. Los ratones BALB/c y los ratones NOD/Ltj mostraron una mayor expresión de las citocinas inflamatorias IL-6 e IL-1β en los tejidos pulmonares después de 21 días de estimulación con PM2.5, activando la vía de señalización JAK2/STAT3 y regulando al alza la expresión de los genes asociados al tumor CCNA2, CCNB2 y CEP55, con los ratones NOD/Ltj exhibiendo cambios más pronunciados que los ratones BALB/c. Este protocolo demuestra que la carcinogénesis inducida por el microambiente inflamatorio pulmonar puede ser una razón clave para la alta incidencia de LUAD en pacientes con pSS. Además, los mecanismos relacionados con el bloqueo pueden ayudar a prevenir la aparición de LUAD en pacientes con pSS.

Introducción

El síndrome primario de Sjögren (SSp) es una enfermedad autoinmune caracterizada por la infiltración linfocítica de las glándulas exocrinas y conduce a los síntomas clínicos de ojo seco (xeroftalmia) y boca seca (xerostomía)1,2. La pSS también suele acompañarse de manifestaciones extraglandulares de afectación, como hiperglobulinemia3, enfermedad pulmonar intersticial4, acidosis tubular renal5, daño neurológico6 y trombocitopenia7, que constituyen los principales factores pronósticos adversos. En los últimos años, una serie de estudios ha demostrado que la pSS generalmente se acompaña de una mayor prevalencia de cáncer, incluyendo neoplasias hematológicas malignas y tumores sólidos 8,9,10. El cáncer de pulmón es uno de los cánceres relacionados con el pSS más comunes, especialmente el adenocarcinoma de pulmón (LUAD)11.

En conjunto, investigaciones posteriores sugirieron que la pSS con LUAD puede tener alguna patogenia común subyacente. De acuerdo con nuestro conocimiento actual, aún no hay estudios especiales que expliquen los mecanismos comunes entre las dos enfermedades. Recientemente, el análisis bioinformático ofrece una posibilidad potencial para que revelemos mecanismos de enfermedad potencialmente compartidos entre especies 12,13,14. Para revelar aún más los mecanismos subyacentes, se utiliza el análisis bioinformático para el análisis de objetivos comunes y vías de señalización entre pSS y LUAD, y posteriormente se establecen modelos animales para su verificación experimental. La revelación de estos mecanismos puede ayudar a proporcionar una base de evidencia para la prevención clínica de LUAD en pacientes con pSS.

Este estudio utilizó las bases de datos GEO y Genecard para recuperar los genes relevantes asociados con pSS y LUAD. Posteriormente, los DEG asociados con pSS y LUAD se examinaron como pSS-LUAD-DEGs. Realizamos análisis de enriquecimiento de KEGG y GO para dilucidar las funciones biológicas significativas de pSS-LUAD-DEGs. Se utilizó la construcción de la red PPI para identificar los objetivos principales, y evaluamos más a fondo la precisión del diagnóstico del gen hub mediante análisis de la curva ROC. Utilizamos ratones NOD/Ltj como modelos animales de pSS estimulados con material particulado 2.5 (PM2.5) para generar una reacción inflamatoria. Se realizaron QPCR, ELISA y western blot para verificar experimentalmente el estudio. En general, los resultados aquí indican que la carcinogénesis inducida por el microambiente inflamatorio pulmonar puede ser una razón crítica para la alta incidencia de LUAD en pacientes con pSS. También sugiere que la aparición de LUAD en pacientes con pSS puede prevenirse mediante mecanismos relacionados con el bloqueo.

Protocolo

Los animales de experimentación se alojaron en el animalario del Hospital de la Amistad China-Japón, donde las condiciones de alojamiento cumplían con el entorno de alimentación animal de acuerdo con el estándar nacional de China, Requisitos de Animales de Laboratorio del Medio Ambiente y las Instalaciones de Alojamiento (GB14925-2010). Todos los procedimientos y experimentos de cuidado animal cumplieron con las directrices ARRIVE y se basaron en los principios de las 3R (reducción, reemplazo, refinamiento), adhiriéndose a las directrices de la Ley Nacional de Bienestar Animal de China. Los ratones BALB/c se compraron a SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd., y los ratones NOD/Ltj se compraron a Huafukang (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.

1. Análisis bioinformático

  1. Preparación de conjuntos de datos
    1. Abra la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)15 y utilice el síndrome de Sjögren primario y el adenocarcinoma de pulmón como palabras clave para buscar perfiles de expresión génica. A continuación, haga clic en los resultados de la base de datos GEO DataSets y seleccione Homo sapiens en Top Organisms. Seleccione y descargue el conjunto de datos de interés junto con la información de la plataforma correspondiente.
    2. Abrir la base de datos Genecard (https://www.genecards.org/)16 y utilizar elsíndrome de Sjögren y el adenocarcinoma de pulmón como palabras clave para obtener los genes de pSS y LUAD. Descargue las hojas de cálculo de los genes de la enfermedad.
  2. Identificación de DEGs compartidos entre pSS y LUAD
    1. Descargue y abra el software R (https://cran.r-project.org/)17. Instale el paquete GEOquery R, el paquete stringr R, el paquete ggplot2 R, el paquete reshape2 R y el paquete limma R en el software R.
    2. Identifique y visualice genes expresados diferencialmente (DEG) en diferentes conjuntos de datos GEO (GSE84844, GSE51092, GSE32863 y GSE75037) utilizando el software R, y luego compare y analice la expresión génica entre estos conjuntos de datos. Considere los genes con un valor P ajustado < 0.05 y un cambio de pliegue (FC) > 1.2 o < 0.83 como DEGs.
    3. Seleccione genes con un nivel de expresión mayor o igual a 20 relacionados con pSS y LUAD de la base de datos Genecard.
    4. Combine los DEG asociados con pSS y los DEG asociados con LUAD de la base de datos GEO y la base de datos Genecard.
    5. Instale y cargue el paquete VennDiagram en R para obtener y visualizar los DEG asociados con pSS y LUAD (pSS-LUAD-DEGs).
  3. Análisis de enriquecimiento de la vía de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG)
    1. Entra en Metascape (https://metascape.org/)18. Haga clic en Seleccionar archivo y cargue el archivo de formato .xlsx de pSS-LUAD-DEGs. Seleccione H. sapiens en Entrada como especie. Del mismo modo, seleccione H. sapiens en Análisis como especie.
    2. Haga clic en Análisis personalizado. Haga clic en Enriquecimiento y seleccione KEGG Pathway. Haga clic en Análisis de enriquecimiento y, a continuación, haga clic en Página de informe de análisis cuando finalice el análisis de enriquecimiento.
    3. Haga clic en Archivo zip todo en uno para descargar el resultado. Acceda al archivo _ FINAL_GO.csv en la carpeta de Enrichment_GO de descarga para ver el resultado.
    4. Utilice el paquete ggplot2 para realizar el programa de visualización KEGG en R.
  4. Análisis de enriquecimiento de ontología génica (GO)
    1. Instale y cargue el paquete clusterProfiler y enrichplot en R.
    2. Importe la lista de formato de texto de pSS-LUAD-DEG en R.
    3. Ejecute los paquetes clusterProfiler y enrichplot para el análisis de enriquecimiento de GO y la visualización de resultados. Defina la significación estadística en el análisis con un valor P ajustado < 0,05.
  5. Construcción de redes de interacción proteína-proteína (PPI) y análisis de módulos
    1. Ingrese a la base de datos Retrieval of Interacting Genes (STRING) (http://string-db.org/)19. Haga clic en Examinar y cargue el archivo de pSS-LUAD-DEGs. Selecciona Homo sapiens en Organismos y, a continuación, haz clic en Buscar.
    2. Haga clic en Continuar. Una vez que los resultados estén disponibles, haga clic en Configuración. En Configuración básica > Puntuación de interacción mínima requerida, seleccione Confianza alta (0,700). Marque Ocultar nodos desconectados en la red en Configuración avanzada y, a continuación, haga clic en Actualizar.
    3. Haga clic en Exportaciones en la barra de título para descargar el texto de la relación PPI en formato TSV.
    4. Descargue y encienda el software Cytoscape 3.7.1 (https://cytoscape.org/)20. Haga clic en Archivo > Importar > red desde archivo para importar el archivo de formato TSV para construir la red PPI.
    5. Utilice la herramienta Analizador de red para analizar los parámetros topológicos de la red. Optimice el tamaño y el color del nodo a través de la barra de estilo en el panel de control izquierdo.
    6. En la barra de menús, seleccione Herramientas > Analizar red. En el panel Tabla , haga clic en Grado para ordenar los componentes por grado en orden descendente. Tome los 20 genes principales con grados más altos como genes centrales.
    7. Instale y cargue los paquetes igraph y ggplot2 en R para visualizar los genes hub por grado.
  6. Identificación y validación de genes hub
    1. Instale y cargue el paquete pROC en R.
    2. Importe la lista en formato de texto de los genes hub en R.
    3. Traza las curvas de características operativas del receptor (ROC) de los genes hub y calcula el área bajo los valores de la curva ROC (AUC).
      NOTA: Consulte el Archivo de codificación suplementaria 1 para obtener el código R para filtrar DEG.

2. Verificación experimental

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo.

  1. Preparación animal
    1. Alimente a 12 ratones hembra BALB/c de nueve semanas de edad y a 12 ratones hembra NOD/Ltj de nueve semanas de edad de forma adaptativa durante 1 semana.
    2. Utilice una tabla de números aleatorios para asignar uniformemente 12 ratones hembra BALB/c de nueve semanas de edad en el grupo de control en blanco y en el grupo PM2.5. Del mismo modo, divida uniformemente 12 ratones hembra NOD/Ltj de nueve semanas de edad en el grupo pSS y el grupo pSS-PM2.5.
  2. Preparación de la suspensión de material particulado 2.5 (PM2.5)
    NOTA: PM2.5 puede inducir la aparición y el desarrollo de LUAD relacionado con la inflamación en el modelo de ratón21. Los ratones BALB/c y los ratones NOD/Ltj fueron inducidos por PM2.5 a desarrollar cambios relacionados con la inflamación. De acuerdo con el método descrito por Piao et al.22, la concentración de la suspensión de PM2,5 se preparó a 1 mg/mL.
    1. Pesar las membranas de fibra de cuarzo PM2.5, cortarlas en trozos de 2 cm × 2 cm y sumergirlas en un vaso de precipitados que contenga una cantidad adecuada de agua desionizada.
    2. Selle el vaso de precipitados y sonicélo en un sonicador de baño de agua a 37 °C durante 30 minutos cada vez. Repite este proceso 3 veces hasta que las partículas se disuelvan por completo.
    3. Filtre el líquido del vaso de precipitados a través de 16 capas de gasa médica estéril y, a continuación, exprima la humedad residual de la gasa.
    4. Coloque el filtrado en un plato plano y congélelo en bloques de hielo en un congelador a -20 °C. A continuación, utilice un instrumento de liofilización (-52 °C, 0,1 mbar, 48 h) para secar los bloques de hielo del filtrado y recoger las partículas en polvo.
    5. Disuelva bien las partículas en polvo en solución salina para preparar una suspensión de PM2.5 con una concentración de 1 mg/mL. Vierta la suspensión de PM2.5 en una botella de vidrio, colóquela en un esterilizador de alta presión y aplique alta presión y temperatura (15 min a 121 °C, 15 psi) para la esterilización.
    6. Realizar agitación ultrasónica (200 W, 10 s de agitación, 10 s de reposo, durante 3 ciclos). Después del tratamiento, guárdelo en un refrigerador a 4 °C para su uso posterior.
  3. Establecimiento del modelo de ratón PM2.5
    NOTA: Al grupo PM2.5 y al grupo pSS-PM2.5 se les administró suspensión de PM2.5 por goteo de tráquea una vez cada 3 días durante 28 días, con cada dosis de 0.1 mL. Al grupo control en blanco y al grupo pSS se les administró solución salina fisiológica por goteo de tráquea una vez cada 3 días durante 28 días, con cada dosis de 0,1 mL.
    1. Inyecte una mezcla de ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) en el ratón. Confirme el plano quirúrgico de la anestesia comprobando la falta de respuesta a un pellizco del dedo del pie y asegurando una relajación muscular completa. Monitoree continuamente los reflejos, la respiración y la respuesta general para garantizar que se mantenga una anestesia adecuada durante todo el procedimiento hasta que se completen todos los pasos.
    2. Coloque el ratón en el sujetador de animales pequeños con el abdomen hacia arriba, la cabeza elevada y la cola bajada en un ángulo de 45°. Use hilo fino para enrollar los incisivos superiores del ratón, tirando de ellos hacia arriba, y asegure la rosca en un tornillo en el soporte del animal, asegurando la exposición completa de la cavidad bucal del ratón.
    3. Abra la lámpara de luz fría y haga brillar la luz sobre la piel del cuello del ratón. Usa fórceps para sacar la lengua del ratón, exponiendo completamente la glotis. Observe dentro de la cavidad bucal del ratón un punto de luz recurrente de apertura y cierre, que indica la posición de la apertura de las vías respiratorias del ratón.
    4. Inserte la aguja venosa permanente de 18 G en la tráquea del ratón, extraiga el núcleo de la aguja, coloque el hilo de algodón en el extremo exterior de la aguja venosa permanente y confirme el éxito al observar el movimiento del hilo de algodón con los movimientos del pecho del ratón.
    5. Aspire primero 0,2 mL de aire con una jeringa de 1 mL, luego aspire 0,1 mL de suspensión PM2.5 y luego aspire otros 0,2 mL de aire. Inyecte la mezcla a través de la aguja venosa permanente de 18 G en la tráquea.
    6. Extraiga la aguja venosa permanente de 18 G. Asegure el soporte para animales en posición vertical y gírelo en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj 30 veces para distribuir uniformemente la suspensión PM2.5 en los pulmones del ratón. Luego, extiende el cuello del ratón recto y colócalo de lado para evitar la asfixia.
  4. Colección de especímenes
    NOTA: Recoja muestrasel día 29 del experimento para análisis de biología molecular posteriores.
    1. Compruebe la conexión del sistema de eutanasia y encienda el controlador. Abra la válvula del cilindro de dióxido de carbono (CO2).
      NOTA: No llene previamente la cámara de eutanasia antes de colocar a los animales dentro.
    2. Coloque los ratones en la cámara e infunda CO2 a un 30%-70% del volumen de la cámara por minuto. Exponga a los ratones al CO2 durante 5 minutos, asegurándose de que estén inmóviles, que no respiren y que tengan las pupilas dilatadas. Cierre la válvula del cilindro deCO2 y observe durante 5 minutos adicionales para confirmar la muerte.
    3. Coloque el ratón sacrificado en posición supina sobre una tabla de disección limpia. Exponga la tráquea, el corazón y los pulmones.
    4. Use tijeras y fórceps para quitar la piel y los músculos que cubren las regiones ventral, torácica y del cuello. Use tijeras y fórceps para hacer incisiones a lo largo de los bordes de las costillas a ambos lados de la cavidad torácica para exponer la cavidad torácica que contiene el corazón y los pulmones. Luego, corte la clavícula para crear una abertura lo suficientemente ancha como para examinar minuciosamente los lóbulos pulmonares izquierdo y derecho.
    5. Extirpar los músculos del cuello que se extienden desde el esternón y las costillas hasta la mandíbula. Inserte unas tijeras por debajo del borde anterior de las costillas y haga incisiones en ambos lados para extirpar la parte ósea que cubre la tráquea.
    6. Agarre la tráquea cerca de la mandíbula con pinzas y haga una incisión transversal completa con unas tijeras colocadas encima de las pinzas.
    7. Tire suavemente de la tráquea con fórceps, cortando las conexiones del tejido ventral con unas tijeras hasta que se extraiga todo el tejido torácico del cuerpo.
    8. Coloque los pulmones planos sobre la mesa de trabajo. Enjuague los residuos de la superficie del tejido pulmonar con solución salina, séquelos con papel de filtro, alículos en criotubos y guárdelos a -80 °C.
  5. Reacción en cadena de la polimerasa (qPCR) cuantitativa en tiempo real
    1. Muele el tejido pulmonar hasta convertirlo en polvo con un mortero que contenga nitrógeno líquido.
    2. Pesar 20 mg de tejido molido con una balanza de precisión, combinarlo con 750 μL de Buffer RL en un tubo de centrífuga, mezclar bien con un mezclador de vórtice y dejar reposar a temperatura ambiente (RT) durante 3 min. A continuación, centrifugar a 14.000 x g durante 5 min a RT y recoger el sobrenadante.
    3. Coloque la minicolumna del filtro de ADN genómico (ADNg) en un tubo de recolección de 2 ml. Transfiera el sobrenadante a la minicolumna del filtro de ADNg y centrifugue a 14.000 x g durante 2 min en RT.
    4. Deseche la mini columna del filtro de ADNg. Agregue un volumen igual de etanol al 70% al filtrado y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo 5 veces.
    5. Coloque la minicolumna de ARN en un tubo de recolección de 2 ml. Transfiera 750 μL de la mezcla a la minicolumna de ARN y centrifugue a 12.000 x g durante 1 min en RT.
    6. Deseche el filtrado y vuelva a colocar la minicolumna de ARN en el tubo de recolección de 2 ml. Añadir 500 μL de tampón RW1 a la minicolumna de ARN y centrifugar a 12.000 x g durante 1 min en RT.
    7. Deseche el filtrado y vuelva a colocar la minicolumna de ARN en el tubo de recolección de 2 ml. Añada 500 μL de tampón RW2 a la minicolumna de ARN. Centrifugar a 12.000 x g durante 1 min en RT. Repita este paso una vez más.
    8. Deseche el filtrado y vuelva a colocar la minicolumna de ARN en el tubo de recolección de 2 ml. Centrífuga a 12.000 x g durante 2 min en RT.
    9. Transfiera la minicolumna de ARN a un tubo de centrífuga de 1,5 mL, agregue 100 μL de agua libre de ARNasa al centro de la membrana de la columna e incube en RT durante 2 min. A continuación, centrifugar a 12.000 x g durante 1 min en RT. Deseche la minicolumna de ARN y almacene la solución de ARN a -80 °C.
    10. Tome 2 μL de la solución de ARN y mídala con el espectrofotómetro NanoDrop de acuerdo con el manual del equipo para determinar su concentración y calidad.
      NOTA: El estudio seleccionó proporciones 260/280 y 260/230 para el control de calidad del ARN.
    11. Prepare la solución de ARN añadiendo secuencialmente los siguientes componentes en un tubo de microcentrífuga: 1 μg de ARN total, 4 μL de MgCl2 (25 mM), 2 μL de tampón 10x de transcripción inversa, 2 μL de mezcla de dNTP (10 mM), 0,5 μL de inhibidor de la ribonucleasa recombinante, 15 unidades de transcriptasa inversa, 0,5 μg de cebador oligo(dT)15 , y añadir Agua Sin Nucleasas a 20 μL. Mezclar el contenido suavemente para recoger todo el líquido en el fondo del tubo.
      NOTA: Las soluciones de cóctel deben prepararse para garantizar una síntesis de ADNc y una cuantificación de ARN más consistentes.
    12. Transcriba inversamente la solución de ARN de 20 μL en ADNc incubándola a 42 °C durante 15 min, desnaturalizándola a 95 °C durante 5 min y luego enfriándola a 4 °C, seguida de almacenamiento a -20 °C.
    13. Combine y mezcle bien 6,4 μL de agua destilada, 10 μL de mezcla maestra de PCR en tiempo real SYBR Green, 2 μL de la solución de ADNc obtenida, 0,8 μL de cebador directo (10 μM) y 0,8 μL de cebador inverso (10 μM) (Tabla 1) para preparar el sistema de reacción.
    14. Ejecute la reacción en el instrumento de PCR para obtener los valores del umbral del ciclo (CT) para los genes objetivo y los genes de referencia.
      1. Ajuste la desnaturalización inicial a 95 °C durante 60 s al comienzo de cada ciclo de PCR.
      2. Durante los ciclos de PCR, realice la desnaturalización a 95 °C durante 15 s, el recocido a 60 °C durante 15 s y la extensión a 72 °C durante 45 s, recopilando datos durante el paso de extensión. Realizar un total de 40 ciclos de PCR.
      3. Después de completar los ciclos de PCR, realice el análisis de la curva de fusión automáticamente utilizando el instrumento de PCR.
        NOTA: Si la curva de fusión muestra un pico doble o una forma de pico irregular, esto indica que puede haber un problema con el experimento.
    15. Determine los niveles relativos de expresión de cada gen diana utilizando el método 2-ΔΔCT, seguido de un análisis estadístico adicional. Utilice la siguiente lista de fórmulas para el método 2-ΔΔCT:
      ΔCT (prueba) = CT (objetivo, prueba) - TC (ref, prueba)
      ΔCT (calibrador) = CT (objetivo, calibrador) - CT (ref, calibrador)
      ΔΔCT = ΔCT (prueba) -ΔCT (calibrador)
      2-ΔΔCT = Cambio de pliegue en la expresión génica

Nombre del genSecuencia (5′ a 3′)
Ratón CCNA2 hacia adelanteCCCAGAAGTAGCAGAGTTTGTG
Ratón CCNA2 reversoTTGTCCCGTGACTGTGTAGAG
Avance ASPM del ratónCTTATTCAGGCTATGTGGAGGA
Ratón ASPM inversoCCAGGCTTGAATCTTGCAG
Ratón CCNB2 hacia adelanteTTGAAATTTGAGTTGGGTCGAC
Ratón CCNB2 inversoCTGTTCAACATCAACCTCCC
Ratón NUSAP1 hacia adelanteCTCCCTCAAGTACAGTGACC
Ratón NUSAP1 reversoTTTAACAACTTGGTTGCCCTC
Ratón CEP55 hacia adelanteCCGCCAGAATATGCAGCATCAAC
Ratón CEP55 reversoAGTGGGAATGGCTGCTCTGTGA

Tabla 1: Secuencias de cebado para PCR cuantitativa en tiempo real.

  1. Ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA)
    NOTA: De acuerdo con las instrucciones del kit ELISA, equilibre el kit ELISA con RT, prepare un tampón de lavado y diluya el estándar. Diluya 90 μL de anticuerpo biotinilado concentrado con 8910 μL de tampón de dilución de anticuerpos biotinilados para preparar una solución de trabajo de anticuerpos biotinilados (1:100) por adelantado. Del mismo modo, diluya 90 μL de conjugado enzimático concentrado con 8910 μL de tampón de dilución de conjugado enzimático para preparar una solución de trabajo de conjugado enzimático (1:100) por adelantado.
    1. Muele el tejido pulmonar hasta convertirlo en polvo con un mortero que contenga nitrógeno líquido.
    2. Pese 50 mg de tejido pulmonar usando una balanza de precisión, combínelo con 1 ml de PBS en un tubo de molienda y muélalo completamente en hielo.
    3. Centrifugar la mezcla a 4 °C, 3000 x g durante 5 min, y recoger el sobrenadante como muestra.
    4. Coloque 100 μL de muestra/patrón de diferentes concentraciones en los pocillos respectivos de la placa ELISA, cubra los pocillos de reacción con una película de sellado adhesiva e incube en una incubadora a 37 °C durante 90 min.
    5. Utilice una lavadora de placas automatizada para lavar la placa ELISA 4 veces, inyectando 350 μL de tampón de lavado cada vez con un intervalo de 30 s entre la inyección y la aspiración.
    6. Añadir 100 μL de solución de trabajo de anticuerpos biotinilados por pocillo, sellar los pocillos con una película adhesiva de sellado e incubar en una incubadora a 37 °C durante 60 min. Posteriormente, lave la placa ELISA 4 veces siguiendo el procedimiento descrito anteriormente.
    7. Añadir 100 μL de solución de trabajo conjugada enzimática por pocillo, sellar los pocillos con una película adhesiva de sellado e incubar en una incubadora a 37 °C durante 30 min. Posteriormente, lave la placa ELISA 4 veces siguiendo el procedimiento descrito anteriormente.
    8. Añadir 100 μL de agente cromogénico por pocillo, proteger de la luz e incubar en una incubadora a 37 °C durante 10-20 min. A continuación, añada 100 μL de solución de parada por pocillo, mezcle bien e inmediatamente mida la densidad óptica a valores de 450 nm (OD450).
      NOTA: Se utiliza una pipeta de 8 canales para agregar la solución de trabajo de anticuerpos biotinilados, la solución de trabajo conjugada enzimática y la solución de parada, lo que permite completar la adición rápidamente y evitar posibles errores.
    9. Genere una curva estándar utilizando el software CurveExpert (http:// curveexpert.webhop.net/) para calcular la concentración de las sustancias objetivo en cada pocillo de muestra.
  2. Western blot
    1. Prepare la solución del ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) mezclando tampón de lisis RIPA, fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) e inhibidor de fosfatasa en una proporción de 100:1:1 y colóquela en hielo.
    2. Muele los tejidos pulmonares hasta convertirlos en polvo con un mortero que contenga nitrógeno líquido.
    3. Pesar 20 mg de tejido pulmonar con precisión utilizando una balanza de precisión y añadirlo a 250 μL de la solución mixta RIPA.
    4. Incubar la mezcla en hielo durante 20 minutos, luego centrifugarla a 12.000 x g durante 15 minutos a 4 °C y recoger el sobrenadante como muestra.
    5. Prepare la solución de trabajo de BCA mezclando el reactivo A y el reactivo B del kit de BCA en una proporción de 50:1.
      1. Diluya el patrón para preparar soluciones patrón diluidas con concentraciones de 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 y 0,5 mg/mL. Añada 20 μL de cada solución patrón y tome la muestra en pocillos separados de una placa de 96 pocillos e incube a 37 °C durante 30 min.
      2. Mida la absorbancia a 490 nm con el lector de microplacas. Ajuste la curva estándar utilizando las concentraciones y absorbancias de las soluciones patrón y calcule la concentración de la muestra23. Ajuste las concentraciones de la muestra al mismo nivel utilizando la solución mezclada RIPA.
    6. Mezcle el sobrenadante de proteínas con un tampón de carga 5x en una proporción de 4:1 en un tubo de centrífuga. Hervir en un baño de metal durante 5 minutos, luego centrifugar a 12.000 x g durante 15 minutos a 4 °C y recoger el sobrenadante.
    7. Realice la separación de proteínas mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y transfiera las proteínas a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) eléctricamente. Bloquear la membrana de PVDF con leche desnatada al 5% en RT durante 1 h.
    8. Incubar la membrana de PVDF con anticuerpo primario (diluido 1:1000) a 4 °C durante 12 h, seguido de un lavado tres veces con TBST durante 10 min cada una, y luego incubar con anticuerpo secundario (diluido 1:5000) a RT durante 2 h.
    9. Detecte las bandas objetivo utilizando un sistema de inmunoensayo de electroquimioluminiscencia totalmente automático y realice análisis cuantitativos utilizando el software incorporado.
  3. Análisis estadístico
    1. Utilice el software adecuado para el análisis estadístico.
    2. Presentar los datos experimentales como media ± desviación estándar.
    3. Determine la significación mediante el análisis de varianza de un factor (ANOVA).
    4. Considere P < 0,05 como estadísticamente significativo.

Resultados

Se identificaron un total de 3290 DEG de los 23348 genes en GSE84884 (pSS), incluidos 2659 genes regulados al alza y 631 genes regulados a la baja (Figura 1A). Para GSE51092 (pSS), se identificaron un total de 3290 DEG de los 11409 genes, incluidos 667 genes regulados al alza y 587 genes regulados a la baja (Figura 1B). La base de datos GeneCards obtuvo 102 DEG relacionados con pSS ováricos, y la puntuación de correlación de ...

Discusión

A pesar de que la pSS es considerada una enfermedad caracterizada principalmente por la invasión de glándulas exocrinas, el daño de las extraglándulas no puede ser ignorado24. Los pulmones representan un órgano diana para la pSS, y la afectación pulmonar es una manifestación extraglandular común de la pSS, que suele implicar la infiltración linfocítica de la mucosa bronquial y el intersticio pulmonar25. Las investigaciones indican...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este estudio contó con el apoyo de la Financiación de Investigación Clínica del Hospital Nacional de Alto Nivel (2023-NHLHCRF-BQ-01) y el Proyecto Juvenil del Hospital de la Amistad China-Japón (No.2020-1-QN-8).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
3-Color Prestained Protein MarkerEpizymeWJ103Western Blot
Antibody Dilution BufferEpizymePS119Western Blot
BCA Protein Quantification KitEpizymeZJ101Western Blot
Cytoscape 3.7.1 softwareNational Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health (NIH)Version 3.7.1.Open-source software for biological network analysis and visualization
ECL Luminous FluidEpizymeSQ203Western Blot
Electrophoresis BufferEpizymePS105SWestern Blot
GraphPad Prism 10.0GraphPadVersion 10.0Data analysis
HRP-conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014)abclonalAS014Western Blot
JAK2 AntibodyCell Signaling Technology3230TWestern Blot
Mouse IL-1β ELISA KitBeijing 4A Biotech Co., LtdCME0015ELISA
Mouse IL-6 ELISA KitBeijing 4A Biotech Co., LtdCME0006ELISA
Phosphatase Inhibitor Cocktail (100×)EpizymeGRF102Western Blot
Phospho-JAK2 (Tyr1007/1008) AntibodyCell Signaling Technology3776SWestern Blot
Phospho-STAT3 (Tyr705) AntibodyCell Signaling Technology9145SWestern Blot
Protease Inhibitor Cocktail (100×)EpizymeGRF101Western Blot
Protein Free Rapid Blocking Buffer (5×)EpizymePS108Western Blot
PVDF membraneMilliporeIPVH00010Western Blot
R softwareR Foundation for Statistical ComputingNot ApplicableStatistical analysis software and programming language used for data analysis, visualization, and machine learning applications
Radio Immunoprecipitation AssayEpizymePC101Western Blot
Reverse Transcription SystemPromegaA3500PCR
SDS-PAGEEpizymeLK303Western Blot
SDS-PAGE Protein Loading Buffer (5×)EpizymeLT103Western Blot
STAT3 AntibodyCell Signaling Technology9139SWestern Blot
SYBR Green Realtime PCR Master MixTOYOBOQPK-201PCR
TBST (10×)EpizymePS103Western Blot
Western Blot Transfer Buffer (10×)EpizymePS109Western Blot
β-Actin AntibodyabclonalAC026Western Blot

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