JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной рукописи описываются оперативные процедуры и меры предосторожности для исследования потенциальных общих патогенетических механизмов, связывающих первичный синдром Шегрена и аденокарциному легкого, с помощью биоинформатического анализа и экспериментальной проверки.

Аннотация

Это исследование было направлено на изучение потенциальных общих патогенетических механизмов, связывающих первичный синдром Шегрена (pSS) и аденокарциному легкого (LUAD) посредством биоинформатического анализа и экспериментальной проверки. Соответствующие гены, ассоциированные с pSS и LUAD, были получены из баз данных Gene Expression Omnibus (GEO) и Genecard. Впоследствии дифференциально экспрессируемые гены (DEG), ассоциированные с pSS и LUAD, были подвергнуты скринингу как pSS-LUAD-DEGs. Для выяснения значимых биологических функций pSS-LUAD-DEGs были проведены анализы обогащения Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) и Gene Ontology (GO). Основные мишени были определены путем построения сети белок-белковых взаимодействий (PPI) с последующей оценкой диагностической точности гена-хаба с помощью анализа кривой операционной характеристики приемника (ROC). В этом исследовании мыши NOD/Ltj служили животными моделями pSS и стимулировались твердыми частицами 2,5 (PM2,5) для создания воспалительной реакции. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (кПЦР), иммуноферментный анализ (ИФА) и вестерн-блоттинг были использованы для соответствующей верификации экспериментов в молекулярной биологии. Результаты, полученные с помощью анализов обогащения KEGG и GO, указывают на то, что воспаление играет решающую роль в связывании pSS и LUAD. IL6, CCNA2, JAK2, IL1B, ASPM, CCNB2, NUSAP1 и CEP55 были определены в качестве ключевых мишеней pSS-LUAD. У мышей BALB/c и мышей NOD/Ltj наблюдалась повышенная экспрессия воспалительных цитокинов IL-6 и IL-1β в тканях легких после 21 дня стимуляции PM2,5, активируя сигнальный путь JAK2/STAT3 и повышая экспрессию ассоциированных с опухолью генов CCNA2, CCNB2 и CEP55, причем у мышей NOD/Ltj наблюдались более выраженные изменения, чем у мышей BALB/c. Этот протокол демонстрирует, что канцерогенез, индуцированный воспалительным микроокружением легких, может быть ключевой причиной высокой частоты LUAD у пациентов с псс. Кроме того, механизмы, связанные с блокированием, могут помочь предотвратить возникновение LUAD у пациентов с псс.

Введение

Первичный синдром Шегрена (ПСС) является аутоиммунным заболеванием, характеризующимся лимфоцитарной инфильтрацией экзокринных желез и приводящим к клиническим симптомам сухости глаз (ксерофтальмии) и сухости во рту (ксеростомии)1,2. ПСС также обычно сопровождается внежелезистыми проявлениями поражения, включая гиперглобулинемию3, интерстициальное заболевание легких4, почечный канальцевый ацидоз5, неврологические повреждения6 и тромбоцитопению7, которые являются основными неблагоприятными прогностическими факторами. В последние годы ряд исследований показал, что ПСС в целом сопровождается повышенной распространенностью онкологических заболеваний, включая гематологические злокачественные новообразования и солидные опухоли 8,9,10. Рак легких является одним из наиболее распространенных видов рака, связанных с псс, особенно аденокарцинома легкого (ЛУАД)11.

В целом, дальнейшие исследования показали, что пСС с LUAD может иметь некоторый общий патогенез. Согласно нашим текущим знаниям, пока нет специальных исследований, объясняющих общие механизмы между этими двумя заболеваниями. В последнее время биоинформатический анализ дает нам потенциальную возможность выявить потенциально общие механизмы заболевания у видов 12,13,14. Для дальнейшего выявления основных механизмов биоинформатический анализ используется для анализа общих мишеней и сигнальных путей между pSS и LUAD, а затем создаются животные модели для экспериментальной проверки. Выявление этих механизмов может помочь обеспечить доказательную базу для клинической профилактики LUAD у пациентов с pSS.

В этом исследовании использовались базы данных GEO и Genecard для извлечения соответствующих генов, связанных с pSS и LUAD. После этого DEG, связанные с pSS и LUAD, были проверены как pSS-LUAD-DEG. Мы провели анализ обогащения KEGG и GO для выяснения значимых биологических функций pSS-LUAD-DEGs. Для определения основных мишеней было использовано построение сети ИПП, и мы дополнительно оценили точность диагностики генов-хабов с помощью анализа кривой ROC. Мы использовали мышей NOD/Ltj в качестве животных моделей pSS, стимулированных твердыми частицами 2,5 (PM2,5) для создания воспалительной реакции. QPCR, ИФА и вестерн-блоттинг были проведены для экспериментальной проверки исследования. В целом, полученные результаты указывают на то, что канцерогенез, индуцированный воспалительным микроокружением легких, может быть критической причиной высокой частоты LUAD у пациентов с pSS. Это также говорит о том, что возникновение LUAD у пациентов с псс может быть предотвращено с помощью механизмов, связанных с блокированием.

протокол

Подопытные животные были размещены в здании Китайско-японской больницы дружбы, где условия содержания соответствовали условиям кормления животных в соответствии с национальным стандартом Китая «Требования к лабораторным животным в окружающей среде и жилищных условиях» (GB14925-2010). Все процедуры и эксперименты по уходу за животными соответствовали рекомендациям ARRIVE, и основывались на принципах 3R (сокращение, замена, доработка), придерживаясь руководящих принципов Национального закона о защите животных Китая. Мыши BALB/c были приобретены у SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd., а мыши NOD/Ltj были приобретены у Huafukang (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.

1. Биоинформатический анализ

  1. Подготовка наборов данных
    1. Откройте базу данных Gene Expression Omnibus (GEO) (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)15 и используйте первичный синдром Шегрена и аденокарциному легкого в качестве ключевых слов для поиска профилей экспрессии генов. Затем нажмите на результаты в базе данных GEO DataSets и выберите Homo sapiens в Top Organisms. Выберите и загрузите интересующий вас набор данных вместе с соответствующей информацией о платформе.
    2. Откройте базу данных Genecard (https://www.genecards.org/)16 и используйте синдромШегрена и аденокарциному легкого в качестве ключевых слов для получения генов pSS и LUAD. Загрузите таблицы генов заболевания.
  2. Идентификация общих DEG между pSS и LUAD
    1. Загрузите и откройте программное обеспечение R (https://cran.r-project.org/)17. Установите пакет GEOquery R, пакет Stringr R, пакет ggplot2 R, пакет reshape2 R и пакет limma R в программном обеспечении R.
    2. Идентифицируйте и визуализируйте дифференциально экспрессируемые гены (DEG) в различных наборах данных GEO (GSE84844, GSE51092, GSE32863 и GSE75037) с помощью программного обеспечения R, а затем сравнивайте и анализируйте экспрессию генов среди этих наборов данных. В качестве ДЭГ рассмотрим гены со скорректированным P-значением < 0,05 и кратным изменением (FC) > 1,2 или < 0,83.
    3. Выберите гены с уровнем экспрессии, превышающим или равным 20, связанные с pSS и LUAD, из базы данных Genecard.
    4. Объедините DEG, связанные с pSS, и DEG, связанные с LUAD, из базы данных GEO и базы данных Genecard.
    5. Установите и загрузите пакет VennDiagram в R, чтобы получить и визуализировать DEG, связанные с pSS и LUAD (PSS-LUAD-DEGs).
  3. Киотская энциклопедия генов и геномов (KEGG) анализ обогащения путей
    1. Встречайте Metascape (https://metascape.org/)18. Нажмите кнопку "Выбрать файл " и загрузите файл pSS-LUAD-DEG в формате .xlsx. Выберите H. sapiens в поле «Входные данные» в качестве вида. Аналогичным образом выберите H. sapiens в разделе «Анализ» в качестве вида.
    2. Нажмите кнопку Пользовательский анализ. Нажмите «Обогащение» и выберите KEGG Pathway. Нажмите «Анализ обогащения», а затем нажмите «Страница отчета об анализе», когда анализ обогащения будет завершен.
    3. Нажмите «Все в одном zip-файле», чтобы загрузить результат. Откройте файл _ FINAL_GO.csv в папке Enrichment_GO загрузки, чтобы просмотреть результат.
    4. Используйте пакет ggplot2 для выполнения программы визуализации KEGG в R.
  4. Анализ обогащения генной онтологии (GO)
    1. Установите и загрузите clusterProfiler и пакет enrichplot в R.
    2. Импортируйте список pSS-LUAD-DEGs в текстовом формате в R.
    3. Запустите пакеты clusterProfiler и enrichplot для анализа обогащения GO и визуализации результатов. Определите статистическую значимость в анализе при скорректированном P-значении < 0,05.
  5. Построение сети белок-белковых взаимодействий (ИПП) и модульный анализ
    1. Войдите в базу данных Retrieval of Interinteraction Genes (STRING) (http://string-db.org/)19. Нажмите кнопку Обзор и загрузите файл pSS-LUAD-DEGs. Выберите Homo sapiens в разделе «Организмы», затем нажмите «Поиск».
    2. Нажмите «Продолжить». Как только результаты будут доступны, нажмите «Настройки». В разделе «Основные настройки» > «Минимальный требуемый балл взаимодействия» выберите «Высокая достоверность» (0,700). Установите флажок «Скрыть отключенные узлы в сети» в «Дополнительных настройках», затем нажмите «Обновить».
    3. Нажмите « Экспорт» в строке заголовка, чтобы загрузить текст соотношения PPI в формате TSV.
    4. Загрузите и включите программу Cytoscape 3.7.1 (https://cytoscape.org/)20. Нажмите кнопку Файл > Импортировать > сеть из файла , чтобы импортировать файл формата TSV для построения сети PPI.
    5. Используйте инструмент Анализатор цепей для анализа топологических параметров в сети. Оптимизируйте размер и цвет узла с помощью панели стилей на левой панели управления.
    6. В строке меню выберите «Сервис» > «Анализ сети». На панели «Таблица » нажмите « Градус», чтобы отсортировать компоненты по степени в порядке убывания. Возьмем 20 лучших генов с более высокими степенями в качестве генов-хабов.
    7. Установите и загрузите пакеты igraph и ggplot2 в R, чтобы визуализировать гены-концентраторы по градусам.
  6. Идентификация и валидация генов-хабов
    1. Установите и загрузите пакет pROC в R.
    2. Импортируйте список генов-хабов в текстовом формате в R.
    3. Построение кривых рабочих характеристик приемника (ROC) генов-хабов и расчет площади под значениями кривой ROC (AUC).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к дополнительному файлу кодирования 1 для получения кода R для фильтрации DEG.

2. Экспериментальная проверка

ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к Таблице материалов для получения подробной информации о материалах, реагентах и инструментах, используемых в этом протоколе.

  1. Подготовка животных
    1. Кормите 12 девятинедельных самок мышей BALB/c и 12 девятинедельных самок мышей NOD/Ltj адаптивно в течение 1 недели.
    2. Используйте таблицу случайных чисел, чтобы равномерно распределить 12 девятинедельных самок мышей BALB/c в пустую контрольную группу и группу PM2.5. Аналогичным образом, равномерно разделите 12 девятинедельных самок мышей NOD/Ltj на группу pSS и группу pSS-PM2.5.
  2. Приготовление суспензии твердых частиц 2,5 (ТЧ2,5)
    ПРИМЕЧАНИЕ: PM2.5 может вызывать возникновение и развитие связанного с воспалением LUAD у мышиной модели21. У мышей BALB/c и мышей NOD/Ltj PM2.5 развивались изменения, связанные с воспалением. Согласно способу, описанному в Piao et al.22, концентрацию суспензии PM2,5 готовили из расчета 1 мг/мл.
    1. Взвесьте мембраны из кварцевого волокна PM2,5, разрежьте их на кусочки по 2 см × 2 см и погрузите в стакан, содержащий соответствующее количество деионизированной воды.
    2. Запечатайте стакан и проведите ультразвуковую обработку на водяной бане при температуре 37 °C в течение 30 минут каждый раз. Повторите этот процесс 3 раза до полного растворения частиц.
    3. Процедите жидкость в стакане через 16 слоев стерильной медицинской марли, затем отожмите остатки влаги из марли.
    4. Поместите фильтрат на плоскую посуду и заморозьте его в ледяные блоки в морозильной камере при температуре -20 °C. Затем с помощью прибора для сублимационной сушки (−52 °C, 0,1 мбар, 48 ч) высушите ледяные блоки фильтрата и соберите порошкообразные частицы.
    5. Тщательно растворите порошкообразные частицы в физрастворе для приготовления суспензии PM2,5 с концентрацией 1 мг/мл. Налейте суспензию PM2.5 в стеклянную бутылку, поместите ее в стерилизатор высокого давления и примените высокое давление и температуру (15 минут при 121°C, 15 фунтов на квадратный дюйм) для стерилизации.
    6. Выполняйте ультразвуковое перемешивание (200 Вт, 10 с перемешивания, 10 с отдыха, в течение 3 циклов). После обработки храните его в холодильнике при температуре 4 °C для последующего использования.
  3. Создание модели мыши PM2.5
    ПРИМЕЧАНИЕ: Группе PM2.5 и группе pSS-PM2.5 суспензию PM2.5 вводили капельно через трахею один раз в 3 дня в течение 28 дней, при этом каждая доза составляла 0,1 мл. Контрольная группа с холостым раствором и группа пСС получали физиологический раствор капельницей из трахеи один раз в 3 дня в течение 28 дней, при этом каждая доза составляла 0,1 мл.
    1. Введите мышке смесь кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг). Подтвердите операционную плоскость анестезии, проверив отсутствие реакции на защемление пальца ноги и обеспечив полное расслабление мышц. Постоянно контролируйте рефлексы, дыхание и общую реакцию, чтобы обеспечить адекватное содержание анестезии на протяжении всей процедуры до тех пор, пока все этапы не будут завершены.
    2. Расположите мышь на удерживающем устройстве для мелких животных животом вверх, голову вверх, а хвост опущен под углом 45°. Используйте тонкую нить, чтобы обхватить верхние резцы мыши, потянув их вверх, и закрепите нить на винте на держателе для животных, обеспечивая полное обнажение ротовой полости мыши.
    3. Откройте лампу холодного света и направьте свет на кожу шеи мыши. С помощью щипцов вытащите язык мыши, полностью обнажив голосовую щель. Наблюдайте в ротовой полости мыши за повторяющимся открывающимся и закрывающимся световым пятном, которое указывает на положение отверстия дыхательных путей мыши.
    4. Вставьте иглу для венозного проживания 18 G в трахею мыши, вытащите сердцевину иглы, поместите хлопчатобумажную нить на внешний конец венозной иглы и подтвердите успех, наблюдая за движением хлопчатобумажной нити вместе с движениями грудной клетки мыши.
    5. Сначала отасывайте 0,2 мл воздуха с помощью шприца объемом 1 мл, затем отсасывайте 0,1 мл суспензии PM2,5, затем отсасывайте еще 0,2 мл воздуха. Введите смесь через венозную постоянную иглу 18 г в трахею.
    6. Вытащите венозную постоянную иглу 18 G. Закрепите держатель животного в вертикальном положении и поверните его по часовой стрелке и против часовой стрелки 30 раз, чтобы равномерно распределить суспензию PM2.5 в легких мыши. Затем вытяните шею мыши прямо и положите ее на бок, чтобы предотвратить удушье.
  4. Сбор образцов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите образцы на29-й день эксперимента для последующих молекулярно-биологических анализов.
    1. Проверьте подключение системы эвтаназии и включите питание контроллера. Откройте вентиль баллона с углекислым газом (CO2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не заполняйте камеру для эвтаназии перед тем, как поместить в нее животных.
    2. Поместите мышей в камеру и вводите CO2 в количестве 30%-70% от объема камеры в минуту. Подвергайте мышей воздействиюCO2 в течение 5 минут, следя за тем, чтобы они были неподвижны, не дышали и имели расширенные зрачки. Закройте вентиль баллона CO2 и наблюдайте еще 5 минут, чтобы подтвердить смерть.
    3. Поместите усыпленную мышь в лежачем положении на чистую доску для препарирования. Обнажите трахею, сердце и легкие.
    4. С помощью ножниц и щипцов удалите кожу и мышцы, покрывающие вентральную, грудную и шейную области. С помощью ножниц и щипцов сделайте разрезы по краям ребер с обеих сторон грудной полости, чтобы обнажить грудную полость, содержащую сердце и легкие. Затем разрежьте ключицу, чтобы создать достаточно широкое отверстие для тщательного осмотра левой и правой долей легкого.
    5. Иссекайте мышцы шеи, идущие от грудины и ребер до челюсти. Вставьте ножницы ниже переднего края ребер и сделайте надрезы с обеих сторон, чтобы удалить костную часть, покрывающую трахею.
    6. Захватите трахею возле челюсти щипцами и сделайте полный поперечный разрез с помощью ножниц, размещенных над щипцами.
    7. Аккуратно подтяните трахею вверх щипцами, разрезая ножницами вентральные тканевые соединения до тех пор, пока вся ткань грудной клетки не будет удалена из организма.
    8. Положите легкие плашмя на верстак. Остатки поверхности легочной ткани промойте физиологическим раствором, промокните насухо фильтровальной бумагой, разложите по криопробиркам и храните при температуре -80 °C.
  5. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (кПЦР)
    1. Легочную ткань измельчить в порошок с помощью ступки, содержащей жидкий азот.
    2. Взвесьте 20 мг измельченной ткани с помощью прецизионных весов, смешайте ее с 750 μл буферного RL в центрифужной пробирке, тщательно перемешайте с помощью вихревого миксера и дайте постоять при комнатной температуре (RT) в течение 3 минут. Затем центрифугируйте его при 14 000 x g в течение 5 минут в RT и соберите надосадочную жидкость.
    3. Поместите мини-колонку с фильтром геномной ДНК (гДНК) в пробирку для сбора объемом 2 мл. Перенесите надосадочную жидкость в мини-колонку с фильтром гДНК и центрифугируйте при давлении 14 000 x g в течение 2 минут при RT.
    4. Выбросьте мини-колонку с фильтром гДНК. Добавьте в фильтрат равный объем 70% этанола и перемешайте пипетированием вверх и вниз 5 раз.
    5. Поместите мини-колонку РНК в пробирку для сбора объемом 2 мл. Перенесите 750 мкл смеси в мини-колонку для РНК и центрифугируйте при давлении 12 000 x g в течение 1 минуты при RT.
    6. Выбросьте фильтрат и поместите мини-колонку РНК обратно в пробирку для сбора объемом 2 мл. Добавьте 500 мкл буфера RW1 в мини-колонку для РНК и центрифугируйте при 12 000 x g в течение 1 минуты при RT.
    7. Выбросьте фильтрат и поместите мини-колонку РНК обратно в пробирку для сбора объемом 2 мл. Добавьте 500 мкл буфера RW2 в мини-колонку РНК. Центрифугируйте при 12 000 x g в течение 1 минуты при RT. Повторите этот шаг еще раз.
    8. Выбросьте фильтрат и поместите мини-колонку РНК обратно в пробирку для сбора объемом 2 мл. Центрифугируйте при 12 000 x g в течение 2 мин при RT.
    9. Перенесите мини-колонку РНК в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл, добавьте 100 мкл воды, не содержащей РНКазы, в центр мембраны колонки и инкубируйте при ОТ в течение 2 минут. Затем центрифугируйте при 12 000 x g в течение 1 минуты при RT. Выбросьте мини-колонку РНК и храните раствор РНК при температуре -80 °C.
    10. Возьмите 2 мкл раствора РНК и измерьте его с помощью спектрофотометра NanoDrop в соответствии с инструкцией по оборудованию, чтобы определить его концентрацию и качество.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В исследовании были выбраны соотношения 260/280 и 260/230 для контроля качества РНК.
    11. Приготовить раствор РНК путем последовательного добавления в микроцентрифужную пробирку следующих компонентов: 1 μг общей РНК, 4 μЛ MgCl2 (25 мМ), 2 μЛ 10-кратного буфера с обратной транскрипцией, 2 μЛ смеси dNTP (10 мМ), 0,5 μЛ рекомбинантного ингибитора рибонуклеазы, 15 единиц обратной транскриптазы, 0,5 μг праймера олиго(dT)15 , и добавьте воду без нуклеазы до 20 мкл. Аккуратно перемешайте содержимое, чтобы собрать всю жидкость на дне пробирки.
      Коктейльные растворы должны быть приготовлены таким образом, чтобы обеспечить более последовательный синтез кДНК и количественное определение РНК.
    12. Обратное транскрибирование раствора РНК объемом 20 мкл в кДНК путем инкубации при 42 °C в течение 15 мин, денатурации при 95 °C в течение 5 мин, а затем охлаждения до 4 °C с последующим хранением при -20 °C.
    13. Соедините и тщательно перемешайте 6,4 мкл дистиллированной воды, 10 мкл мастер-смеси SYBR Green для ПЦР в реальном времени, 2 мкл полученного раствора кДНК, 0,8 мкл прямого праймера (10 мкМ) и 0,8 мкл обратного праймера (10 мкМ) (Таблица 1) для приготовления реакционной системы.
    14. Запустите реакцию на приборе ПЦР, чтобы получить значения порога цикла (CT) для целевых генов и референсных генов.
      1. В начале каждого цикла ПЦР устанавливайте начальную денатурацию на уровне 95 °C в течение 60 с.
      2. Во время циклов ПЦР проводят денатурацию при 95 °C в течение 15 с, отжиг при 60 °C в течение 15 с и удлинение при 72 °C в течение 45 с, собирая данные на этапе удлинения. Проведите в общей сложности 40 циклов ПЦР.
      3. После завершения циклов ПЦР выполните автоматический анализ кривой плавления с помощью прибора для ПЦР.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если кривая плавления показывает двойной пик или неправильную форму пика, это указывает на то, что в эксперименте может быть проблема.
    15. Определите относительные уровни экспрессии каждого гена-мишени с помощью метода 2-ΔΔCT с последующим дальнейшим статистическим анализом. Используйте следующий список формул для метода 2-ΔΔCT:
      ΔCT (тест) = CT (мишень, тест) - CT (ссылка, тест)
      ΔCT (калибратор) = CT (мишень, калибратор) - CT (ссылка, калибратор)
      ΔΔCT = ΔCT (испытательный) -ΔCT (калибратор)
      2-ΔΔCT = Кратное изменение экспрессии генов

Название генаПоследовательность (от 5 до 3 минут)
Мышь CCNA2 впередCCCAGAAGTAGCAGAGTTTG
Мышь CCNA2 обратная сторонаTTGTCCCGTGACTGTGTAGAG
Наведение мыши ASPM впередCTTATTCAGGCTATGTGGAGGA
Реверс мыши ASPMCCAGGCTTGAATCTTGCAG
Мышь CCNB2 впередTTGAAATTTGAGTTGGGTCGAC
Реверс мыши CCNB2CTGTTCAACATCAACCTCCC
Мышь NUSAP1 впередCTCCCTCAAGTACAGTGACC
Реверс мыши NUSAP1TTTAACAACTTGGTTGCCCTC
Мышь CEP55 впередCCGCCAGAATGCAGCATCAAC
Мышь CEP55 реверсAGTGGGAATGGCTGCTGTGA

Таблица 1: Основные последовательности для количественной ПЦР в реальном времени.

  1. Иммуноферментный анализ (ИФА)
    ПРИМЕЧАНИЕ: В соответствии с инструкциями к набору ELISA уравновесьте набор ELISA по RT, подготовьте буфер для промывки и разбавьте стандарт. Развести 90 мкл концентрированного биотинилированного антитела с 8910 мкл буфера для разведения биотинилированных антител для получения рабочего раствора биотинилированного антитела (1:100). Аналогичным образом разбавляют 90 мкл концентрированного конъюгата фермента 8910 мкл буфера для разведения конъюгата фермента для предварительного получения рабочего раствора ферментного конъюгата (1:100).
    1. Измельчите легочную ткань в порошок с помощью ступки, содержащей жидкий азот.
    2. Взвесьте 50 мг легочной ткани с помощью прецизионных весов, соедините их с 1 мл PBS в пробирке для измельчения и тщательно измельчите на льду.
    3. Центрифугируйте смесь при 4 °C, 3000 x g в течение 5 минут и соберите надосадочную жидкость в виде образца.
    4. Поместите 100 μл образца/стандарта различных концентраций в соответствующие лунки планшета ИФА, накройте реакционные лунки клейкой герметизирующей пленкой и инкубируйте в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 90 минут.
    5. Используйте автоматическую промывку пластин для промывки пластины ИФА 4 раза, вводя 350 μл промывочного буфера каждый раз с интервалом 30 секунд между впрыском и аспирацией.
    6. Добавьте 100 μл рабочего раствора биотинилированного антитела в лунку, запечатайте лунки клейкой герметизирующей пленкой и инкубируйте в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 60 минут. После этого промойте пластину ИФА 4 раза, следуя процедуре, описанной ранее.
    7. Добавьте 100 μл рабочего раствора ферментного конъюгата на лунку, запечатайте лунки клейкой герметизирующей пленкой и инкубируйте в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 30 минут. После этого промойте пластину ИФА 4 раза, следуя процедуре, описанной ранее.
    8. Добавьте 100 μл хромогенного агента в лунку, защитите от света и инкубируйте в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 10-20 минут. Затем добавьте 100 мкл раствора для остановки на лунку, тщательно перемешайте и сразу же измерьте оптическую плотность при значениях 450 нм (наружный диаметр450).
      ПРИМЕЧАНИЕ: 8-канальная пипетка используется для добавления рабочего раствора биотинилированного антитела, рабочего раствора ферментного конъюгата и стоп-раствора, что позволяет быстро завершить добавление и избежать потенциальных ошибок.
    9. Постройте стандартную кривую с помощью программного обеспечения CurveExpert (http:// curveexpert.webhop.net/) для расчета концентрации целевых веществ в каждой пробной скважине.
  2. Вестерн-блоттинг
    1. Приготовьте раствор для радиоиммунопреципитации (RIPA), смешав буфер для лизиса RIPA, фенилметансульфонилфторид (PMSF) и ингибитор фосфатазы в соотношении 100:1:1, и поместите его на лед.
    2. Измельчите легочные ткани в порошок с помощью ступки, содержащей жидкий азот.
    3. Точно взвесьте 20 мг легочной ткани с помощью прецизионных весов и добавьте его в 250 мкл смешанного раствора RIPA.
    4. Инкубируйте смесь на льду в течение 20 минут, затем центрифугируйте ее при 12 000 x g в течение 15 минут при 4 °C и соберите надосадочную жидкость в качестве образца.
    5. Приготовьте рабочий раствор ВСА, смешав Реактив А и Реагент Б из набора ВСА в соотношении 50:1.
      1. Разбавляют стандарт для приготовления разведенных стандартных растворов с концентрациями 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 и 0,5 мг/мл. Добавьте по 20 мкл каждого стандартного раствора и образец в отдельные лунки 96-луночного планшета и инкубируйте при 37 °C в течение 30 минут.
      2. Измерьте поглощение на длине волны 490 нм с помощью считывателя микропланшетов. Подогнайте стандартную кривую, используя концентрации и поглощения стандартных растворов, и рассчитайте концентрацию образца23. Отрегулируйте концентрацию образца до того же уровня с помощью смешанного раствора RIPA.
    6. Смешайте надосадочную жидкость с 5-кратным загрузочным буфером в соотношении 4:1 в центрифужной пробирке. Кипятите на металлической бане в течение 5 минут, затем центрифугируйте при 12 000 х г в течение 15 минут при 4 °C и соберите надосадочную жидкость.
    7. Выполните разделение белков с помощью электрофореза в геле додецилсульфата натрия и полиакриламида (SDS-PAGE) и электрически перенесите белки на мембрану из поливинилиденфторида (PVDF). Заблокируйте мембрану PVDF 5% обезжиренным молоком при RT на 1 ч.
    8. Мембрану PVDF инкубируют с первичным антителом (разбавленным 1:1000) при 4 °C в течение 12 ч с последующей трехкратной промывкой TBST в течение 10 мин каждая, а затем инкубируют вторичным антителом (разбавленным 1:5000) при RT в течение 2 ч.
    9. Определите целевые полосы с помощью полностью автоматической системы электрохемилюминесцентного иммунологического анализа и выполните количественный анализ с помощью встроенного программного обеспечения.
  3. Статистический анализ
    1. Используйте соответствующее программное обеспечение для статистического анализа.
    2. Представить экспериментальные данные в виде среднего ± стандартного отклонения.
    3. Определение значимости с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA).
    4. Рассмотрим P < 0,05 как статистически значимый.

Результаты

В общей сложности было идентифицировано 3290 DEGs из 23348 генов in GSE84884 (pSS), включая 2659 генов с повышенной регуляцией и 631 ген с подавленной регуляцией (рис. 1A). Для GSE51092 (pSS) было идентифицировано в общей сложности 3290 DEGs из 11409 генов, включая 667 генов с повышенной ?...

Обсуждение

Хотя пСС считается заболеванием, характеризующимся в первую очередь инвазией экзокринных желез, нельзя игнорировать повреждение экстра-желез24. Легкие представляют собой орган-мишень для псс, а поражение легких является распространенным внежелезистым ?...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальным финансированием клинических исследований больницы высокого уровня (2023-NHLHCRF-BQ-01) и Молодежным проектом Больницы китайско-японской дружбы (No.2020-1-QN-8).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
3-Color Prestained Protein MarkerEpizymeWJ103Western Blot
Antibody Dilution BufferEpizymePS119Western Blot
BCA Protein Quantification KitEpizymeZJ101Western Blot
Cytoscape 3.7.1 softwareNational Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health (NIH)Version 3.7.1.Open-source software for biological network analysis and visualization
ECL Luminous FluidEpizymeSQ203Western Blot
Electrophoresis BufferEpizymePS105SWestern Blot
GraphPad Prism 10.0GraphPadVersion 10.0Data analysis
HRP-conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014)abclonalAS014Western Blot
JAK2 AntibodyCell Signaling Technology3230TWestern Blot
Mouse IL-1β ELISA KitBeijing 4A Biotech Co., LtdCME0015ELISA
Mouse IL-6 ELISA KitBeijing 4A Biotech Co., LtdCME0006ELISA
Phosphatase Inhibitor Cocktail (100×)EpizymeGRF102Western Blot
Phospho-JAK2 (Tyr1007/1008) AntibodyCell Signaling Technology3776SWestern Blot
Phospho-STAT3 (Tyr705) AntibodyCell Signaling Technology9145SWestern Blot
Protease Inhibitor Cocktail (100×)EpizymeGRF101Western Blot
Protein Free Rapid Blocking Buffer (5×)EpizymePS108Western Blot
PVDF membraneMilliporeIPVH00010Western Blot
R softwareR Foundation for Statistical ComputingNot ApplicableStatistical analysis software and programming language used for data analysis, visualization, and machine learning applications
Radio Immunoprecipitation AssayEpizymePC101Western Blot
Reverse Transcription SystemPromegaA3500PCR
SDS-PAGEEpizymeLK303Western Blot
SDS-PAGE Protein Loading Buffer (5×)EpizymeLT103Western Blot
STAT3 AntibodyCell Signaling Technology9139SWestern Blot
SYBR Green Realtime PCR Master MixTOYOBOQPK-201PCR
TBST (10×)EpizymePS103Western Blot
Western Blot Transfer Buffer (10×)EpizymePS109Western Blot
β-Actin AntibodyabclonalAC026Western Blot

Ссылки

  1. Thorlacius, G. E., Bjork, A., Wahren-Herlenius, M. Genetics and epigenetics of primary sjogren syndrome: Implications for future therapies. Nat Rev Rheumatol. 19 (5), 288-306 (2023).
  2. Bjordal, O., Norheim, K. B., Rodahl, E., Jonsson, R., Omdal, R. Primary Sjogren's syndrome and the eye. Surv Ophthalmol. 65 (2), 119-132 (2020).
  3. Zhong, H., et al. Hyperglobulinemia predicts increased risk of mortality in primary Sjogren's syndrome: Based on a Chinese multicentre registry. Mod Rheumatol. 34 (1), 137-143 (2023).
  4. Lin, W., et al. Interstitial lung disease in primary Sjogren's syndrome. BMC Pulm Med. 22 (1), 73 (2022).
  5. Aiyegbusi, O., et al. Renal disease in primary Sjogren's syndrome. Rheumatol Ther. 8 (1), 63-80 (2021).
  6. Liampas, A., et al. Primary sjogren syndrome-related peripheral neuropathy: A systematic review and meta-analysis. Eur J Neurol. 30 (1), 255-265 (2023).
  7. Wu, J., et al. Clinical and laboratory features of primary Sjogren's syndrome complicated with mild to severe thrombocytopenia. Ann Transl Med. 10 (6), 300 (2022).
  8. Zhong, H., et al. Primary Sjogren's syndrome is associated with increased risk of malignancies besides lymphoma: A systematic review and meta-analysis. Autoimmun Rev. 21 (5), 103084 (2022).
  9. Goulabchand, R., et al. Cancer incidence in primary Sjogren's syndrome: Data from the French hospitalization database. Autoimmun Rev. 20 (12), 102987 (2021).
  10. Witkowski Durand Viel, P., et al. Chronological interplay, clinical features, and treatments among patients with cancer and primary Sjogren's syndrome. Cancer Immunol Immunother. 72 (12), 4309-4322 (2023).
  11. Xu, Y., et al. The prevalence and clinical characteristics of primary Sjogren's syndrome patients with lung cancer: An analysis of ten cases in China and literature review. Thorac Cancer. 6 (4), 475-479 (2015).
  12. Shi, L., Du, X., Li, J., Zhang, G. Bioinformatics and systems biology approach to identify the pathogenetic link between psoriasis and cardiovascular disease. Clin Cosmet Investig Dermatol. 16, 2283-2295 (2023).
  13. Xu, R., Ma, L. L., Cui, S., Chen, L., Xu, H. Bioinformatics and systems biology approach to identify the pathogenetic link between heart failure and sarcopenia. Arq Bras Cardiol. 120 (10), e20220874 (2023).
  14. Lv, Y., et al. Bioinformatics and systems biology approach to identify the pathogenetic link of long COVID and myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome. Front Immunol. 13, 952987 (2022).
  15. Barrett, T., et al. Ncbi geo: Archive for functional genomics data sets--update. Nucleic Acids Res. 41 (database issue), D991-D995 (2013).
  16. Stelzer, G., et al. The GeneCards suite: From gene data mining to disease genome sequence analyses. Curr Protoc Bioinformatics. 54, 1.30.1-1.30.33 (2016).
  17. Liu, S., et al. Three differential expression analysis methods for RNA sequencing: limma, EdgeR, DESeq2. J Vis Exp. 175, e62528 (2021).
  18. Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nat Commun. 10 (1), 1523 (2019).
  19. Szklarczyk, D., et al. The string database in 2023: Protein-protein association networks and functional enrichment analyses for any sequenced genome of interest. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D638-D646 (2023).
  20. Shannon, P., et al. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  21. Hill, W., et al. Lung adenocarcinoma promotion by air pollutants. Nature. 616 (7955), 159-167 (2023).
  22. Piao, C. H., et al. PM2.5 exposure regulates th1/th2/th17 cytokine production through NF-κβ signaling in combined allergic rhinitis and asthma syndrome. Int Immunopharmacol. 119, 110254 (2023).
  23. Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume protein concentration determination using the nanodrop 2000c spectrophotometer. J Vis Exp. 33, e1610 (2009).
  24. Luo, J., et al. Distinct clinical phenotypes of primary Sjogren's syndrome differ by onset age: A retrospective study of 742 cases and review of the literature. Clin Exp Rheumatol. 40 (12), 2373-2380 (2022).
  25. Luppi, F., et al. Lung complications of Sjogren syndrome. Eur Respir Rev. 29 (157), (2020).
  26. Berardicurti, O., et al. Interstitial lung disease and pulmonary damage in primary Sjogren's syndrome: A systematic review and meta-analysis. J Clin Med. 12 (7), 2586 (2023).
  27. Roca, F., et al. Interstitial lung disease in primary Sjogren's syndrome. Autoimmun Rev. 16 (1), 48-54 (2017).
  28. Fisher, D. A., et al. Diagnosis and treatment of lung cancer in the setting of interstitial lung disease. Radiol Clin North Am. 60 (6), 993-1002 (2022).
  29. Okudela, K., et al. Implications of thyroid transcription factor-1 gene methylation in carcinogenesis of interstitial pneumonia-related non-terminal respiratory unit lung adenocarcinoma. Int J Clin Exp Pathol. 15 (3), 120-130 (2022).
  30. Sekine, A., et al. Disease activity of lung cancer at the time of acute exacerbation of interstitial lung disease during cytotoxic chemotherapy. Thorac Cancer. 13 (17), 2443-2449 (2022).
  31. Glaviano, A., et al. PI3K/AKT/mTOR signaling transduction pathway and targeted therapies in cancer. Mol Cancer. 22 (1), 138 (2023).
  32. Ediriweera, M. K., Tennekoon, K. H., Samarakoon, S. R. Role of the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in ovarian cancer: Biological and therapeutic significance. Semin Cancer Biol. 59, 147-160 (2019).
  33. Hoxhaj, G., Manning, B. D. The PI3K-AKT network at the interface of oncogenic signalling and cancer metabolism. Nat Rev Cancer. 20 (2), 74-88 (2020).
  34. Liu, R., et al. PI3K/AKT pathway as a key link modulates the multidrug resistance of cancers. Cell Death Dis. 11 (9), 797 (2020).
  35. Manogaran, P., Beeraka, N. M., Paulraj, R. S., Sathiyachandran, P., Thammaiappa, M. Impediment of cancer by dietary plant-derived alkaloids through oxidative stress: Implications of PI3K/AKT pathway in apoptosis, autophagy, and ferroptosis. Curr Top Med Chem. 23 (10), 860-877 (2023).
  36. Acosta-Martinez, M., Cabail, M. Z. The PI3K/AKT pathway in meta-inflammation. Int J Mol Sci. 23 (23), 15330 (2022).
  37. Chen, G. Y., et al. Prediction of Rhizoma Drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 5233462 (2021).
  38. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of Rhizoma Drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κβ and PI3K/AKT pathways. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 6634837 (2021).
  39. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of Rhizoma Drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Des Devel Ther. 16, 1743-1766 (2022).
  40. Yao, C., Narumiya, S. Prostaglandin-cytokine crosstalk in chronic inflammation. Br J Pharmacol. 176 (3), 337-354 (2019).
  41. Liu, P., et al. NOD-like receptor signaling in inflammation-associated cancers: From functions to targeted therapies. Phytomedicine. 64, 152925 (2019).
  42. Damasceno, L. E. A., et al. PKM2 promotes Th17 cell differentiation and autoimmune inflammation by fine-tuning stat3 activation. J Exp Med. 217 (10), e20190613 (2020).
  43. Banerjee, S., Biehl, A., Gadina, M., Hasni, S., Schwartz, D. M. JAK-STAT signaling as a target for inflammatory and autoimmune diseases: Current and future prospects. Drugs. 77 (5), 521-546 (2017).
  44. Jiramongkol, Y., Lam, E. W. FOXO transcription factor family in cancer and metastasis. Cancer Metastasis Rev. 39 (3), 681-709 (2020).
  45. Tong, X., et al. Targeting cell death pathways for cancer therapy: Recent developments in necroptosis, pyroptosis, ferroptosis, and cuproptosis research. J Hematol Oncol. 15 (1), 174 (2022).
  46. Ou, H. L., et al. Cellular senescence in cancer: From mechanisms to detection. Mol Oncol. 15 (10), 2634-2671 (2021).
  47. Felten, R., et al. Interleukin 6 receptor inhibition in primary Sjogren syndrome: A multicentre double-blind randomised placebo-controlled trial. Ann Rheum Dis. 80 (3), 329-338 (2021).
  48. Bardsen, K., et al. Interleukin-1-related activity and hypocretin-1 in cerebrospinal fluid contribute to fatigue in primary Sjogren's syndrome. J Neuroinflammation. 16 (1), 102 (2019).
  49. Barrera, M. J., et al. Tofacitinib counteracts il-6 overexpression induced by deficient autophagy: Implications in Sjogren's syndrome. Rheumatology (Oxford). 60 (4), 1951-1962 (2021).
  50. Liu, H., Zhou, Q., Xu, X., Du, Y., Wu, J. ASPM and TROAP gene expression as potential malignant tumor markers. Ann Transl Med. 10 (10), 586 (2022).
  51. Qian, X., et al. CCNB2 overexpression is a poor prognostic biomarker in Chinese NSCLC patients. Biomed Pharmacother. 74, 222-227 (2015).
  52. Mo, M. L., et al. Use of serum circulating CCNB2 in cancer surveillance. Int J Biol Markers. 25 (4), 236-242 (2010).
  53. Li, L., et al. NuSAP is degraded by APC/C-Cdh1 and its overexpression results in mitotic arrest dependent of its microtubules' affinity. Cell Signal. 19 (10), 2046-2055 (2007).
  54. Fabbro, M., et al. Cdk1/Erk2- and Plk1-dependent phosphorylation of a centrosome protein, cep55, is required for its recruitment to midbody and cytokinesis. Dev Cell. 9 (4), 477-488 (2005).
  55. Jeffery, J., Sinha, D., Srihari, S., Kalimutho, M., Khanna, K. K. Beyond cytokinesis: The emerging roles of CEP55 in tumorigenesis. Oncogene. 35 (6), 683-690 (2016).
  56. Feng, Z., et al. Overexpression of abnormal spindle-like microcephaly-associated (ASPM) increases tumor aggressiveness and predicts poor outcome in patients with lung adenocarcinoma. Transl Cancer Res. 10 (2), 983-997 (2021).
  57. Zheng, H., et al. Comprehensive pan-cancer analysis reveals NuSAP1 is a novel predictive biomarker for prognosis and immunotherapy response. Int J Biol Sci. 19 (14), 4689-4708 (2023).
  58. Verstappen, G. M., Pringle, S., Bootsma, H., Kroese, F. G. M. Epithelial-immune cell interplay in primary sjogren syndrome salivary gland pathogenesis. Nat Rev Rheumatol. 17 (6), 333-348 (2021).
  59. El Rayes, T., et al. Lung inflammation promotes metastasis through neutrophil protease-mediated degradation of Tsp-1. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (52), 16000-16005 (2015).
  60. Zhao, L., et al. PM2.5 and serum metabolome and insulin resistance, potential mediation by the gut microbiome: A population-based panel study of older adults in china. Environ Health Perspect. 130 (2), 27007 (2022).
  61. Li, J., et al. PM2.5 exposure perturbs lung microbiome and its metabolic profile in mice. Sci Total Environ. 721, 137432 (2020).
  62. Liao, J. H., et al. Network pharmacology-based strategy to investigate the mechanisms of artemisinin in treating primary sjogren's syndrome. BMC Immunol. 25 (1), 16 (2024).
  63. Hu, Q., et al. JAK/STAT pathway: Extracellular signals, diseases, immunity, and therapeutic regimens. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1110765 (2023).
  64. Xue, C., et al. Evolving cognition of the JAK-STAT signaling pathway: Autoimmune disorders and cancer. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 204 (2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

KEGGGOJAK2 STAT3PM2 5QPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены