JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כתב יד זה מתאר את הנהלים התפעוליים ואמצעי הזהירות כדי לחקור את המנגנונים הפתוגניים הנפוצים הפוטנציאליים המקשרים בין תסמונת סיוגרן ראשונית ואדנוקרצינומה ריאתית באמצעות ניתוח ביואינפורמטי ואימות ניסיוני.

Abstract

מחקר זה נועד לחקור את המנגנונים הפתוגניים הנפוצים הפוטנציאליים המקשרים בין תסמונת סיוגרן ראשונית (pSS) ואדנוקרצינומה ריאתית (LUAD) באמצעות ניתוח ביואינפורמטי ואימות ניסיוני. הגנים הרלוונטיים הקשורים ל-pSS ו-LUAD אוחזרו ממסד הנתונים של Gene Expression Omnibus (GEO) וממסד הנתונים של Genecard. לאחר מכן, גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי (DEGs) הקשורים ל-pSS ו-LUAD הוקרנו כ-pSS-LUAD-DEGs. אנציקלופדיה של קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) ואונטולוגיה גנטית (GO) בוצעו כדי להבהיר את הפונקציות הביולוגיות המשמעותיות של pSS-LUAD-DEGs. מטרות הליבה זוהו על ידי בניית רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI), הערכה נוספת של דיוק האבחון של גן הרכזת באמצעות ניתוחי עקומת מאפיין הפעלה של מקלט (ROC). במחקר זה, עכברי NOD/Ltj שימשו כמודלים של בעלי חיים pSS ועוררו עם חומר חלקיקי 2.5 (PM2.5) כדי ליצור תגובה דלקתית. תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qPCR), בדיקת אימונוסורבנט מקושרת לאנזים (ELISA) וכתמים מערביים שימשו לאימות ניסויים רלוונטיים בביולוגיה מולקולרית. התוצאות שהתגלו באמצעות ניתוחי העשרה של KEGG ו-GO מצביעות על כך שדלקת ממלאת תפקיד קריטי בקישור בין pSS ל-LUAD. IL6, CCNA2, JAK2, IL1B, ASPM, CCNB2, NUSAP1 ו-CEP55 נקבעו כמטרות עיקריות של pSS-LUAD. עכברי BALB/c ועכברי NOD/Ltj הראו ביטוי מוגבר של ציטוקינים דלקתיים IL-6 ו-IL-1β ברקמות הריאה לאחר 21 יום של גירוי עם PM2.5, הפעלת מסלול האיתות JAK2/STAT3 וויסות הביטוי של גנים הקשורים לגידול CCNA2, CCNB2 ו-CEP55, כאשר עכברי NOD/Ltj הראו שינויים בולטים יותר מעכברי BALB/c. פרוטוקול זה מדגים כי קרצינוגנזה הנגרמת על ידי המיקרו-סביבה הדלקתית הריאתית עשויה להיות סיבה מרכזית לשכיחות הגבוהה של LUAD בחולי pSS. בנוסף, מנגנונים הקשורים לחסימה עשויים לסייע במניעת התרחשות של LUAD בחולי pSS.

Introduction

תסמונת סיוגרן ראשונית (pSS) היא מחלה אוטואימונית המאופיינת בחדירה לימפוציטית של הבלוטות האקסוקריניות ומובילה לתסמינים קליניים של עיניים יבשות (קסרופתלמיה) ויובש בפה (קסרוסטומיה)1,2. pSS מלווה בדרך כלל גם בביטויים חוץ-בלוטיים של מעורבות, כולל היפרגלובולינמיה3, מחלת ריאות אינטרסטיציאלית4, חמצת צינורית כלייתית5, נזק נוירולוגי6 וטרומבוציטופניה7, המהווים את הגורמים הפרוגנוסטיים השליליים העיקריים. בשנים האחרונות, שורה של מחקרים הוכיחה כי pSS מלווה בדרך כלל בשכיחות מוגברת של סרטן, כולל ממאירויות המטולוגיות וגידולים מוצקים 8,9,10. סרטן ריאות הוא אחד מסוגי הסרטן הנפוצים ביותר הקשורים ל-pSS, במיוחד אדנוקרצינומה של הריאות (LUAD)11.

באופן קולקטיבי, חקירה נוספת הצביעה על כך של-pSS עם LUAD עשויה להיות פתוגנזה נפוצה בסיסית. על פי הידע הנוכחי שלנו, עדיין אין מחקרים מיוחדים המסבירים את המנגנונים המשותפים בין שתי המחלות. לאחרונה, ניתוח ביואינפורמטיקה מציע לנו אפשרות פוטנציאלית לחשוף מנגנוני מחלה משותפים פוטנציאליים בין מינים 12,13,14. כדי לחשוף עוד יותר את המנגנונים הבסיסיים, ניתוח ביואינפורמטיקה משמש לניתוח מטרות נפוצות ומסלולי איתות בין pSS ל-LUAD, ולאחר מכן מוקמים מודלים של בעלי חיים לאימות ניסיוני. חשיפת מנגנונים אלה עשויה לסייע במתן בסיס ראיות למניעה קלינית של LUAD בחולי pSS.

מחקר זה השתמש במאגרי הנתונים GEO ו-Genecard כדי לאחזר את הגנים הרלוונטיים הקשורים ל-pSS ו-LUAD. לאחר מכן, DEGs הקשורים ל-pSS ו-LUAD הוקרנו כ-pSS-LUAD-DEGs. ביצענו ניתוחי העשרה של KEGG ו-GO כדי להבהיר את הפונקציות הביולוגיות המשמעותיות של pSS-LUAD-DEGs. בניית רשת PPI שימשה לזיהוי מטרות ליבה, והערכנו עוד יותר את דיוק האבחון של גנים מרכזיים באמצעות ניתוחי עקומת ROC. השתמשנו בעכברי NOD/Ltj כמודלים של חיות pSS המגורים עם חומר חלקיקי 2.5 (PM2.5) כדי ליצור תגובה דלקתית. QPCR, ELISA ו-Western Blotting בוצעו כדי לאמת את המחקר בניסוי. בסך הכל, התוצאות כאן מצביעות על כך שסרטן הנגרם על ידי המיקרו-סביבה הדלקתית הריאתית עשוי להיות סיבה קריטית לשכיחות הגבוהה של LUAD בחולי pSS. זה גם מציע כי ניתן למנוע את הופעת LUAD בחולי pSS על ידי מנגנונים הקשורים לחסימה.

Protocol

חיות הניסוי שוכנו במתקן בעלי החיים של בית החולים לידידות סין-יפן, שם תנאי הדיור עמדו בסביבת האכלת בעלי החיים בהתאם לתקן הלאומי של סין, דרישות חיות מעבדה של סביבה ומתקני דיור (GB14925-2010). כל ההליכים והניסויים לטיפול בבעלי חיים עמדו בהנחיות ARRIVE והתבססו על עקרונות 3R (הפחתה, החלפה, עידון), תוך הקפדה על הנחיות החוק הלאומי לרווחת בעלי חיים של סין. עכברי BALB/c נרכשו מ-SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd., ועכברי NOD/Ltj נרכשו מ-Huafukang (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.

1. ניתוח ביואינפורמטי

  1. הכנת מערכי נתונים
    1. פתח את מסד הנתונים Gene Expression Omnibus (GEO) (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)15, והשתמש בתסמונת סיוגרן ראשונית ואדנוקרצינומה של הריאות כמילות מפתח לחיפוש פרופילי ביטוי גנים. לאחר מכן לחץ על התוצאות במסד הנתונים של GEO DataSets ובחר הומו ספיינס באורגניזמים מובילים. בחר והורד את מערך הנתונים המעניין יחד עם פרטי הפלטפורמה המתאימים להם.
    2. פתח את מסד הנתונים של Genecard (https://www.genecards.org/)16, והשתמשבתסמונת סיוגרן ואדנוקרצינומה של הריאות כמילות מפתח כדי להשיג את הגנים של pSS ו-LUAD. הורד את הגיליונות האלקטרוניים של גני המחלה.
  2. זיהוי DEGs משותפים בין pSS ו-LUAD
    1. הורד ופתח את תוכנת R (https://cran.r-project.org/)17. התקן את חבילת GEOquery R, חבילת stringr R, חבילת ggplot2 R, חבילת reshape2 R וחבילת limma R בתוכנת R.
    2. זהה והמחיש גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי (DEGs) במערכי נתונים שונים של GEO (GSE84844, GSE51092, GSE32863 ו-GSE75037) באמצעות תוכנת R, ולאחר מכן השווה ונתח את ביטוי הגנים בין מערכי נתונים אלה. קחו בחשבון את הגנים עם ערך P מותאם < 0.05 ושינוי קיפול (FC) > 1.2 או < 0.83 כ-DEGs.
    3. בחר גנים עם רמת ביטוי גדולה או שווה ל-20 הקשורים ל-pSS ו-LUAD ממסד הנתונים של Genecard.
    4. מזג את ה-DEGs הקשורים ל-pSS ואת ה-DEGs הקשורים ל-LUAD הן ממסד הנתונים של GEO והן ממסד הנתונים של Genecard.
    5. התקן וטען את חבילת VennDiagram ב-R כדי להשיג ולדמיין את ה-DEGs המשויכים ל-pSS ו-LUAD (pSS-LUAD-DEGs).
  3. אנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) ניתוח מסלול העשרה
    1. היכנסו ל-Metascape (https://metascape.org/)18. נקישה בחר קובץ והעלה את הקובץ בפורמט .xlsx של pSS-LUAD-DEGs. בחר H. sapiens ב-Input as Species. באופן דומה, בחר הומו ספיינס בניתוח כמינים.
    2. לחץ על ניתוח מותאם אישית. לחץ על העשרה ובחר מסלול KEGG. לחץ על ניתוח העשרה ולאחר מכן לחץ על דף דוח ניתוח לאחר השלמת ניתוח ההעשרה.
    3. לחץ על הכל בקובץ Zip אחד כדי להוריד את התוצאה. גש לקובץ _ FINAL_GO.csv בתיקיית Enrichment_GO ההורדה כדי להציג את התוצאה.
    4. השתמש בחבילת ggplot2 כדי לבצע את תוכנית ההדמיה KEGG ב-R.
  4. ניתוח העשרה של גנים (GO)
    1. התקן וטען את חבילת clusterProfiler ו-enrichplot ב-R.
    2. ייבא את רשימת פורמט הטקסט של pSS-LUAD-DEGs ל-R.
    3. הפעל את חבילות clusterProfiler ו-enrichplot לניתוח העשרה של GO ותצוגה חזותית של תוצאות. הגדר מובהקות סטטיסטית בניתוח בערך P מתואם < 0.05.
  5. בניית רשת אינטראקציה בין חלבון לחלבון (PPI) וניתוח מודולים
    1. היכנס למסד הנתונים אחזור גנים אינטראקטיביים (STRING) (http://string-db.org/)19. לחץ על עיון והעלה את הקובץ של pSS-LUAD-DEGs. בחר הומו ספיינס באורגניזמים ולאחר מכן לחץ על חיפוש.
    2. לחץ על המשך. לאחר שהתוצאות זמינות, לחץ על הגדרות. תחת הגדרות בסיסיות > ניקוד אינטראקציה מינימלי נדרש, בחר מהימנות גבוהה (0.700). סמן את הסתר צמתים מנותקים ברשת בהגדרות מתקדמות ולאחר מכן לחץ על עדכן.
    3. לחץ על ייצוא בשורת הכותרת כדי להוריד את טקסט קשרי ה-PPI בפורמט TSV.
    4. הורד והפעל את תוכנת Cytoscape 3.7.1 (https://cytoscape.org/)20. לחץ על קובץ > ייבוא רשת > מקובץ כדי לייבא את הקובץ בפורמט TSV לבניית רשת PPI.
    5. השתמש בכלי מנתח הרשת כדי לנתח את הפרמטרים הטופולוגיים ברשת. בצע אופטימיזציה של גודל הצומת וצבעו באמצעות סרגל הסגנון בלוח הבקרה השמאלי.
    6. בשורת התפריטים, בחר כלים > ניתוח רשת. בחלונית טבלה , לחץ על מעלות כדי למיין רכיבים לפי מעלה בסדר יורד. קחו את 20 הגנים המובילים עם דרגות גבוהות יותר כגנים מרכזיים.
    7. התקן וטען את חבילות ה-igraph וה-ggplot2 ב-R כדי לדמיין גנים של רכזת לפי דרגה.
  6. זיהוי ואימות של גנים מרכזיים
    1. התקן וטען את חבילת pROC ב-R.
    2. ייבא את רשימת פורמט הטקסט של גנים רכזת ל-R.
    3. שרטט עקומות מאפיין הפעלה של מקלט (ROC) של גנים רכזת וחשב את השטח מתחת לערכי עקומת ROC (AUC).
      הערה: עיין בקידוד משלים file 1 עבור קוד R לסינון DEGs.

2. אימות ניסיוני

הערה: עיין בטבלת החומרים לפרטים על החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

  1. הכנת בעלי חיים
    1. האכילו 12 עכברי BALB/c נקבות בנות תשעה שבועות ו-12 עכברי NOD/Ltj נקבות בנות תשעה שבועות באופן אדפטיבי למשך שבוע אחד.
    2. השתמש בטבלת מספרים אקראית כדי להקצות באופן שווה 12 עכברי BALB/c נקבות בנות תשעה שבועות לקבוצת הביקורת הריקה ולקבוצת PM2.5. באופן דומה, חלקו באופן שווה 12 עכברי NOD/Ltj נקבות בנות תשעה שבועות לקבוצת pSS ולקבוצת pSS-PM2.5.
  2. הכנת תרחיף החלקיקים 2.5 (PM2.5)
    הערה: PM2.5 יכול לגרום להתרחשות והתפתחות של LUAD הקשור לדלקת במודלעכבר 21. עכברי BALB/c ועכברי NOD/Ltj הושרו על ידי PM2.5 לפתח שינויים הקשורים לדלקת. על פי השיטה שתוארה על ידי Piao et al.22, ריכוז תרחיף PM2.5 הוכן ב-1 מ"ג/מ"ל.
    1. שקלו את ממברנות סיבי הקוורץ PM2.5, חתכו אותן לחתיכות של 2 ס"מ × 2 ס"מ, וטבלו אותן בכוס המכילה כמות מתאימה של מים נטולי יונים.
    2. אטמו את הכוס והפכו אותה לסוניקטור אמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בכל פעם. חזור על תהליך זה 3 פעמים עד שהחלקיקים מומסים לחלוטין.
    3. מסננים את הנוזל בכוס דרך 16 שכבות של גזה רפואית סטרילית, ואז סוחטים את כל הלחות שנותרה מהגזה.
    4. מניחים את הפילטר על צלחת שטוחה ומקפיאים אותו לקוביות קרח במקפיא של -20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השתמש במכשיר ייבוש בהקפאה (-52 מעלות צלזיוס, 0.1 מבר, 48 שעות) כדי לייבש את גושי הקרח של הסינון ולאסוף את חלקיקי האבקה.
    5. ממיסים היטב את חלקיקי האבקה במי מלח להכנת תרחיף PM2.5 בריכוז של 1 מ"ג/מ"ל. יוצקים את תרחיף PM2.5 לבקבוק זכוכית, מניחים אותו במעקר בלחץ גבוה ומפעילים לחץ וטמפרטורה גבוהים (15 דקות ב-121 מעלות צלזיוס, 15 psi) לעיקור.
    6. בצע תסיסה קולית (200 וואט, 10 שניות תסיסה, 10 שניות מנוחה, למשך 3 מחזורים). לאחר הטיפול יש לאחסן במקרר של 4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
  3. הקמת מודל העכבר PM2.5
    הערה: קבוצת PM2.5 וקבוצת pSS-PM2.5 קיבלו תרחיף PM2.5 בטפטוף קנה הנשימה אחת ל-3 ימים למשך 28 ימים, כאשר כל מנה הייתה 0.1 מ"ל. קבוצת הביקורת הריקה וקבוצת ה-pSS קיבלו תמיסת מלח פיזיולוגית בטפטוף קנה הנשימה אחת ל-3 ימים למשך 28 ימים, כאשר כל מנה הייתה 0.1 מ"ל.
    1. יש להזריק לעכבר תערובת קטמין (100 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג). אשר את מישור ההרדמה הכירורגי על ידי בדיקת חוסר תגובה לצביטה בבוהן והקפדה על הרפיית שרירים מלאה. עקוב באופן רציף אחר רפלקסים, נשימה ותגובה כוללת כדי להבטיח הרדמה נאותה לאורך כל ההליך עד להשלמת כל השלבים.
    2. מקם את העכבר על מסנן בעלי החיים הקטנים כשבטנו פונה כלפי מעלה, ראשו מורם וזנבו מונמך בזווית של 45°. השתמש בחוט דק כדי לולאה סביב החותכות העליונות של העכבר, משוך אותן כלפי מעלה, ואבטח את החוט על בורג על מחזיק החיה, מה שמבטיח חשיפה מלאה של חלל הפה של העכבר.
    3. פתחו את מנורת האור הקר והאירו את האור על עור צוואר העכבר. השתמש במלקחיים כדי לשלוף את לשון העכבר, וחשוף את הגלוטיס במלואו. שימו לב בתוך חלל הפה של העכבר בנקודת אור חוזרת ונפתחת, המציינת את מיקום פתח דרכי הנשימה של העכבר.
    4. הכנס את המחט השוכנת הוורידית 18 גרם לקנה הנשימה של העכבר, משוך החוצה את ליבת המחט, הנח את חוט הכותנה בקצה החיצוני של המחט השוכנת הוורידית, ואשר הצלחה בעת התבוננות בחוט הכותנה הנע עם תנועות החזה של העכבר.
    5. שאפו 0.2 מ"ל אוויר תחילה באמצעות מזרק של 1 מ"ל, ואז שאפו 0.1 מ"ל של מתלה PM2.5, ולאחר מכן שאפו עוד 0.2 מ"ל אוויר. הזריקו את התערובת דרך המחט השוכנת הוורידית 18 גרם לקנה הנשימה.
    6. משוך החוצה את המחט השוכנת הוורידית 18 G. אבטח את מחזיק החיה זקוף וסובב אותו עם כיוון השעון ונגד כיוון השעון 30 פעמים כדי לפזר באופן שווה את מתלה ה-PM2.5 בריאות העכבר. לאחר מכן, האריכו את צוואר העכבר ישר והניחו אותו על צדו כדי למנוע חנק.
  4. אוסף דגימות
    הערה: אסוף דגימות ביוםה-29 של הניסוי לצורך ניתוחים של ביולוגיה מולקולרית לאחר מכן.
    1. בדוק את החיבור של מערכת המתת החסד והפעל את מתח הבקר. פתח את שסתום הצילינדר של פחמן דו חמצני (CO2).
      הערה: אין למלא מראש את תא המתת החסד לפני הכנסת בעלי החיים פנימה.
    2. הכניסו את העכברים לתא והחדירו CO2 ב-30%-70% מנפח החדר לדקה. חשוף את העכברים ל-CO2 למשך 5 דקות, וודא שהם חסרי תנועה, לא נושמים ויש להם אישונים מורחבים. כבה את שסתום צילינדר CO2 והתבונן במשך 5 דקות נוספות כדי לאשר את המוות.
    3. הנח את העכבר המורדם במצב שכיבה על לוח חיתוך נקי. חשוף את קנה הנשימה, הלב והריאות.
    4. השתמש במספריים ובמלקחיים כדי להסיר את העור והשרירים המכסים את אזורי הגחון, בית החזה והצוואר. השתמש במספריים ובמלקחיים כדי לבצע חתכים בשולי הצלעות משני צידי חלל החזה כדי לחשוף את חלל בית החזה המכיל את הלב והריאות. לאחר מכן, חותכים את עצם הבריח כדי ליצור פתח רחב מספיק כדי לבחון היטב את אונות הריאה השמאלית והימנית.
    5. כרתו את שרירי הצוואר המשתרעים מעצם החזה והצלעות ועד הלסת. הכנס מספריים מתחת לקצה הקדמי של הצלעות ובצע חתכים משני הצדדים כדי להסיר את החלק הגרמי המכסה את קנה הנשימה.
    6. אחוז בקנה הנשימה ליד הלסת בעזרת מלקחיים ובצע חתך רוחבי שלם באמצעות מספריים המונחים מעל המלקחיים.
    7. משוך בעדינות את קנה הנשימה בעזרת מלקחיים, חותך את חיבורי רקמת הגחון במספריים עד להסרת כל רקמת בית החזה מהגוף.
    8. הניחו את הריאות שטוחות על שולחן העבודה. שטפו את שאריות פני רקמת הריאה במי מלח, ייבשו בנייר פילטר, הכניסו לתוך צינורות קריו-טיוב ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  5. תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת (qPCR)
    1. טחנו את רקמת הריאה לאבקה באמצעות מכתש המכיל חנקן נוזלי.
    2. שקלו 20 מ"ג של רקמת קרקע באמצעות איזון מדויק, שלבו אותה עם 750 מיקרוליטר של Buffer RL בצינור צנטריפוגה, ערבבו היטב באמצעות מערבל מערבולת, ותנו לה לעמוד בטמפרטורת החדר (RT) למשך 3 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה ב-14,000 x גרם למשך 5 דקות ב-RT ואספו את הסופרנטנט.
    3. הנח את עמודת המיני של מסנן ה-DNA הגנומי (gDNA) לתוך צינור איסוף של 2 מ"ל. העבירו את הסופרנטנט לעמודת המיני של מסנן ה-gDNA ולצנטריפוגה ב-14,000 x g למשך 2 דקות ב-RT.
    4. השלך את עמודת המיני של מסנן gDNA. הוסף נפח שווה של 70% אתנול למסנן וערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 5 פעמים.
    5. הנח את עמוד המיני RNA לתוך צינור איסוף של 2 מ"ל. העבירו 750 מיקרוליטר מהתערובת לעמודת המיני RNA ולצנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך דקה אחת ב-RT.
    6. השלך את המסנן והנח את עמודת המיני RNA בחזרה לצינור האיסוף של 2 מ"ל. הוסף 500 μL של Buffer RW1 לעמודת המיני RNA ולצנטריפוגה ב-12,000 x g למשך דקה אחת ב-RT.
    7. השלך את המסנן והנח את עמודת המיני RNA בחזרה לצינור האיסוף של 2 מ"ל. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר RW2 לעמודת המיני RNA. צנטריפוגה בעוצמה של 12,000 x גרם למשך דקה אחת ב-RT. חזור על שלב זה פעם נוספת.
    8. השלך את המסנן והנח את עמודת המיני RNA בחזרה לצינור האיסוף של 2 מ"ל. צנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 2 דקות ב-RT.
    9. העבירו את עמודת המיני RNA לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל, הוסיפו 100 מיקרוליטר מים נטולי RNase למרכז קרום העמוד, ודגרו ב-RT למשך 2 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך דקה אחת ב-RT. השליכו את עמודת ה-RNA המיני ואחסנו את תמיסת ה-RNA ב-80 מעלות צלזיוס.
    10. קח 2 מיקרוליטר מתמיסת ה-RNA ומדוד אותה באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop בהתאם למדריך הציוד כדי לקבוע את ריכוזו ואיכותו.
      הערה: המחקר בחר יחסים של 260/280 ו-260/230 לבקרת איכות RNA.
    11. הכן את תמיסת ה-RNA על ידי הוספה רציפה של הרכיבים הבאים לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה: 1 מיקרוגרם של RNA כולל, 4 מיקרוליטר של MgCl2 (25 מ"מ), 2 מיקרוליטר של מאגר 10x שעתוק הפוך, 2 מיקרוליטר של תערובת dNTP (10 מ"מ), 0.5 מיקרוליטר של מעכב ריבונוקלאז רקומביננטי, 15 יחידות של טרנסקריפטאז הפוך, 0.5 מיקרוגרם של פריימר אוליגו(dT)15 , ולהוסיף מים ללא נוקלאז ל-20 מיקרוליטר. מערבבים את התכולה בעדינות כדי לאסוף את כל הנוזלים בתחתית הצינור.
      הערה: יש להכין פתרונות קוקטיילים כדי להבטיח סינתזת cDNA עקבית יותר וכימות RNA.
    12. תמלול הפוך של תמיסת ה-RNA של 20 מיקרוליטר ל-cDNA על ידי דגירה ב-42 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן קירורו ל-4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן אחסון ב-20 מעלות צלזיוס.
    13. שלב וערבב היטב 6.4 מיקרוליטר של מים מזוקקים, 10 מיקרוליטר של תערובת מאסטר PCR בזמן אמת של SYBR Green, 2 מיקרוליטר של תמיסת ה-cDNA המתקבלת, 0.8 מיקרוליטר של פריימר קדימה (10 מיקרומטר) ו-0.8 מיקרוליטר של פריימר הפוך (10 מיקרומטר) (טבלה 1) להכנת מערכת התגובה.
    14. הפעל את התגובה במכשיר ה-PCR כדי לקבל את ערכי סף המחזור (CT) עבור גני היעד וגני הייחוס.
      1. הגדר את הדנטורציה הראשונית ל-95 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות בתחילת כל מחזור PCR.
      2. במהלך מחזורי ה-PCR, בצע דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, חישול ב-60 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, איסוף נתונים במהלך שלב ההארכה. בצע בסך הכל 40 מחזורי PCR.
      3. לאחר השלמת מחזורי ה-PCR, בצע ניתוח עקומת התכה באופן אוטומטי באמצעות מכשיר ה-PCR.
        הערה: אם עקומת ההיתוך מציגה צורת שיא כפולה או לא סדירה, הדבר מצביע על כך שייתכן שיש בעיה בניסוי.
    15. קבע את רמות הביטוי היחסיות של כל גן יעד באמצעות שיטת 2-ΔΔCT, ולאחר מכן ניתוח סטטיסטי נוסף. השתמש ברשימת הנוסחאות הבאה עבור פעולת השירות 2-ΔΔCT:
      ΔCT (בדיקה) = CT (מטרה, בדיקה) - CT (רפרנס, בדיקה)
      ΔCT (כיול) = CT (מטרה, כיול) - CT (ref, כיול)
      ΔΔCT = ΔCT (בדיקה) -ΔCT (כיול)
      2-ΔΔCT = שינוי קיפול בביטוי גנים

שם הגןרצף (5′ עד 3′)
עכבר CCNA2 קדימהCCCAGAAGTAGCAGAGTGTG
עכבר CCNA2 הפוךTTGTCCCGTGGTAGAG
עכבר ASPM קדימהCTTATTCAGGCTATGTGGAGGA
עכבר ASPM הפוךCCAGGCTTGAATCTTGCAG
עכבר CCNB2 קדימהTTGAAATTTGAGTTGGGTCGAC
עכבר CCNB2 הפוךCTGTTCAACATCAACCTCCC
עכבר NUSAP1 קדימהCTCCCTCAAGTACAGTGACC
עכבר NUSAP1 הפוךTTTAACAACTTGGTTGCCCTC
עכבר CEP55 קדימהCCGCCAGAATATGCAGCATCAAC
עכבר CEP55 הפוךAGTGGGAATGGCTGCTCTGTGA

טבלה 1: רצפים ראשוניים עבור PCR כמותי בזמן אמת.

  1. בדיקת אימונוסורבנט מקושרת לאנזים (ELISA)
    הערה: על פי ההוראות של ערכת ELISA, יש לאזן את ערכת ELISA ל-RT, להכין מאגר כביסה ולדלל את התקן. יש לדלל 90 מיקרוליטר של נוגדן ביוטיניל מרוכז עם 8910 מיקרוליטר של חוצץ דילול נוגדנים ביוטיניליים להכנת תמיסת עבודה של נוגדנים ביוטיניים (1:100) מראש. באופן דומה, יש לדלל 90 מיקרוליטר של מצומד אנזים מרוכז עם 8910 מיקרוליטר של מאגר דילול מצומד אנזים כדי להכין תמיסת עבודה מצומדת אנזים (1:100) מראש.
    1. טוחנים את רקמת הריאה לאבקה באמצעות מכתש המכיל חנקן נוזלי.
    2. שקלו 50 מ"ג של רקמת ריאה באמצעות איזון מדויק, שלבו אותה עם 1 מ"ל PBS בצינור טחינה, וטחנו אותה היטב על קרח.
    3. צנטריפוגה את התערובת ב-4 מעלות צלזיוס, 3000 x גרם למשך 5 דקות, ואוספים את הסופרנטנט כדגימה.
    4. הנח 100 מיקרוליטר של דגימה/תקן של ריכוזים שונים לבארות המתאימות של לוחית ELISA, כסה את בארות התגובה בסרט איטום דבק ודגירה בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.
    5. השתמש במכונת כביסה אוטומטית כדי לשטוף את צלחת ELISA 4 פעמים, תוך הזרקת 350 מיקרוליטר של מאגר כביסה בכל פעם עם מרווח של 30 שניות בין הזרקה לשאיפה.
    6. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת עבודה של נוגדנים ביוטיניים לכל באר, אטום את הבארות בסרט איטום דביק ודגירה בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. לאחר מכן, שטפו את צלחת ELISA 4 פעמים בעקבות ההליך שתואר קודם לכן.
    7. הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת עבודה מצומדת אנזים לכל באר, אטום את הבארות בסרט איטום דבק ודגירה בחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטפו את צלחת ELISA 4 פעמים בעקבות ההליך שתואר קודם לכן.
    8. הוסף 100 מיקרוליטר של חומר כרומוגני לבאר, הגן מפני אור ודגר באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-20 דקות. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת עצירה לבאר, ערבב היטב ומיד מדוד את הצפיפות האופטית בערכי 450 ננומטר (OD450).
      הערה: פיפטה בעלת 8 תעלות משמשת להוספת תמיסת העבודה של נוגדן ביוטיניל, תמיסת עבודה מצומדת אנזים ותמיסת עצירה, המאפשרת להשלים את התוספת במהירות ולהימנע משגיאות פוטנציאליות.
    9. צור עקומה סטנדרטית באמצעות תוכנת CurveExpert (http:// curveexpert.webhop.net/) כדי לחשב את ריכוז חומרי המטרה בכל באר דגימה.
  2. כתמים מערביים
    1. הכן את תמיסת בדיקת הרדיו-אימונו-משקעים (RIPA) על ידי ערבוב מאגר ליזה של RIPA, פניל-מתאן סולפוניל פלואוריד (PMSF) ומעכב פוספטאז ביחס של 100:1:1 והנח אותו על קרח.
    2. טוחנים את רקמות הריאה לאבקה באמצעות מכתש המכיל חנקן נוזלי.
    3. שקלו 20 מ"ג של רקמת ריאה במדויק באמצעות איזון מדויק והוסיפו אותה ל-250 מיקרוליטר של התמיסה המעורבת של RIPA.
    4. דגרו את התערובת על קרח למשך 20 דקות, ואז צנטריפוגה אותה ב-12,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, ואספו את הסופרנטנט כדגימה.
    5. הכן את תמיסת העבודה BCA על ידי ערבוב ריאגנט A ומגיב B מערכת BCA ביחס של 50:1.
      1. לדלל את התקן להכנת תמיסות סטנדרטיות מדוללות בריכוזים של 0, 0.025, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 ו-0.5 מ"ג/מ"ל. הוסף 20 מיקרוליטר מכל תמיסה סטנדרטית ודגימה לבארות נפרדות של צלחת של 96 בארות ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      2. מדוד את הספיגה ב-490 ננומטר באמצעות קורא המיקרו-פלטות. התאם את העקומה הסטנדרטית באמצעות הריכוזים והספיגה של התמיסות הסטנדרטיות, וחשב את ריכוז הדגימה23. התאם את ריכוזי הדגימה לאותה רמה באמצעות התמיסה המעורבת של RIPA.
    6. מערבבים את סופרנטנט החלבון עם מאגר טעינה פי 5 ביחס של 4:1 בצינור צנטריפוגה. מרתיחים באמבט מתכת למשך 5 דקות, ואז צנטריפוגה בחום של 12,000 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ואוספים את הסופרנטנט.
    7. בצע הפרדת חלבונים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE) והעביר את החלבונים על קרום פלואוריד פוליווינילידן (PVDF) באופן חשמלי. חסום את קרום ה-PVDF עם חלב דל שומן 5% ב-RT למשך שעה.
    8. לדגור את קרום ה-PVDF עם נוגדן ראשוני (מדולל 1:1000) ב-4 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם TBST למשך 10 דקות כל אחת, ולאחר מכן לדגור עם נוגדן משני (מדולל 1:5000) ב-RT למשך שעתיים.
    9. זיהוי רצועות המטרה באמצעות מערכת בדיקה חיסונית אלקטרוכימילומינסנציה אוטומטית לחלוטין וביצוע ניתוח כמותי באמצעות התוכנה המובנית.
  3. ניתוח סטטיסטי
    1. השתמש בתוכנה מתאימה לניתוח סטטיסטי.
    2. להציג נתוני ניסוי כממוצע ± סטיית תקן.
    3. קבע מובהקות באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA).
    4. קחו בחשבון את P < 0.05 כמובהקות סטטיסטית.

תוצאות

בסך הכל זוהו 3290 DEGs מתוך 23348 גנים ב-GSE84884 (pSS), כולל 2659 גנים מווסתים ו-631 גנים מווסתים (איור 1A). עבור GSE51092 (pSS), זוהו בסך הכל 3290 DEGs מ-11409 הגנים, כולל 667 גנים מווסתים ו-587 גנים מווסתים (איור 1B). מסד הנתונים של GeneCards השיג 102 DEGs הקשורים ל-pSS בשחלות, וציון המתא...

Discussion

למרות ש- pSS נחשבת למחלה המאופיינת בעיקר בפלישה של בלוטות אקסוקריניות, לא ניתן להתעלם מהנזק של בלוטות חוץ24. הריאות מייצגות איבר מטרה ל-pSS, ומעורבות ריאות היא ביטוי חוץ-בלוטי שכיח של pSS, בדרך כלל כרוך בחדירה לימפוציטית של רירית הסימפונות ואינטרסטיציום ריאתי

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מימון המחקר הקליני של בית החולים הלאומי ברמה גבוהה (2023-NHLHCRF-BQ-01) ופרויקט הנוער של בית החולים לידידות סין-יפן (No.2020-1-QN-8).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3-Color Prestained Protein MarkerEpizymeWJ103Western Blot
Antibody Dilution BufferEpizymePS119Western Blot
BCA Protein Quantification KitEpizymeZJ101Western Blot
Cytoscape 3.7.1 softwareNational Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health (NIH)Version 3.7.1.Open-source software for biological network analysis and visualization
ECL Luminous FluidEpizymeSQ203Western Blot
Electrophoresis BufferEpizymePS105SWestern Blot
GraphPad Prism 10.0GraphPadVersion 10.0Data analysis
HRP-conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H+L) (AS014)abclonalAS014Western Blot
JAK2 AntibodyCell Signaling Technology3230TWestern Blot
Mouse IL-1β ELISA KitBeijing 4A Biotech Co., LtdCME0015ELISA
Mouse IL-6 ELISA KitBeijing 4A Biotech Co., LtdCME0006ELISA
Phosphatase Inhibitor Cocktail (100×)EpizymeGRF102Western Blot
Phospho-JAK2 (Tyr1007/1008) AntibodyCell Signaling Technology3776SWestern Blot
Phospho-STAT3 (Tyr705) AntibodyCell Signaling Technology9145SWestern Blot
Protease Inhibitor Cocktail (100×)EpizymeGRF101Western Blot
Protein Free Rapid Blocking Buffer (5×)EpizymePS108Western Blot
PVDF membraneMilliporeIPVH00010Western Blot
R softwareR Foundation for Statistical ComputingNot ApplicableStatistical analysis software and programming language used for data analysis, visualization, and machine learning applications
Radio Immunoprecipitation AssayEpizymePC101Western Blot
Reverse Transcription SystemPromegaA3500PCR
SDS-PAGEEpizymeLK303Western Blot
SDS-PAGE Protein Loading Buffer (5×)EpizymeLT103Western Blot
STAT3 AntibodyCell Signaling Technology9139SWestern Blot
SYBR Green Realtime PCR Master MixTOYOBOQPK-201PCR
TBST (10×)EpizymePS103Western Blot
Western Blot Transfer Buffer (10×)EpizymePS109Western Blot
β-Actin AntibodyabclonalAC026Western Blot

References

  1. Thorlacius, G. E., Bjork, A., Wahren-Herlenius, M. Genetics and epigenetics of primary sjogren syndrome: Implications for future therapies. Nat Rev Rheumatol. 19 (5), 288-306 (2023).
  2. Bjordal, O., Norheim, K. B., Rodahl, E., Jonsson, R., Omdal, R. Primary Sjogren's syndrome and the eye. Surv Ophthalmol. 65 (2), 119-132 (2020).
  3. Zhong, H., et al. Hyperglobulinemia predicts increased risk of mortality in primary Sjogren's syndrome: Based on a Chinese multicentre registry. Mod Rheumatol. 34 (1), 137-143 (2023).
  4. Lin, W., et al. Interstitial lung disease in primary Sjogren's syndrome. BMC Pulm Med. 22 (1), 73 (2022).
  5. Aiyegbusi, O., et al. Renal disease in primary Sjogren's syndrome. Rheumatol Ther. 8 (1), 63-80 (2021).
  6. Liampas, A., et al. Primary sjogren syndrome-related peripheral neuropathy: A systematic review and meta-analysis. Eur J Neurol. 30 (1), 255-265 (2023).
  7. Wu, J., et al. Clinical and laboratory features of primary Sjogren's syndrome complicated with mild to severe thrombocytopenia. Ann Transl Med. 10 (6), 300 (2022).
  8. Zhong, H., et al. Primary Sjogren's syndrome is associated with increased risk of malignancies besides lymphoma: A systematic review and meta-analysis. Autoimmun Rev. 21 (5), 103084 (2022).
  9. Goulabchand, R., et al. Cancer incidence in primary Sjogren's syndrome: Data from the French hospitalization database. Autoimmun Rev. 20 (12), 102987 (2021).
  10. Witkowski Durand Viel, P., et al. Chronological interplay, clinical features, and treatments among patients with cancer and primary Sjogren's syndrome. Cancer Immunol Immunother. 72 (12), 4309-4322 (2023).
  11. Xu, Y., et al. The prevalence and clinical characteristics of primary Sjogren's syndrome patients with lung cancer: An analysis of ten cases in China and literature review. Thorac Cancer. 6 (4), 475-479 (2015).
  12. Shi, L., Du, X., Li, J., Zhang, G. Bioinformatics and systems biology approach to identify the pathogenetic link between psoriasis and cardiovascular disease. Clin Cosmet Investig Dermatol. 16, 2283-2295 (2023).
  13. Xu, R., Ma, L. L., Cui, S., Chen, L., Xu, H. Bioinformatics and systems biology approach to identify the pathogenetic link between heart failure and sarcopenia. Arq Bras Cardiol. 120 (10), e20220874 (2023).
  14. Lv, Y., et al. Bioinformatics and systems biology approach to identify the pathogenetic link of long COVID and myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue syndrome. Front Immunol. 13, 952987 (2022).
  15. Barrett, T., et al. Ncbi geo: Archive for functional genomics data sets--update. Nucleic Acids Res. 41 (database issue), D991-D995 (2013).
  16. Stelzer, G., et al. The GeneCards suite: From gene data mining to disease genome sequence analyses. Curr Protoc Bioinformatics. 54, 1.30.1-1.30.33 (2016).
  17. Liu, S., et al. Three differential expression analysis methods for RNA sequencing: limma, EdgeR, DESeq2. J Vis Exp. 175, e62528 (2021).
  18. Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nat Commun. 10 (1), 1523 (2019).
  19. Szklarczyk, D., et al. The string database in 2023: Protein-protein association networks and functional enrichment analyses for any sequenced genome of interest. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D638-D646 (2023).
  20. Shannon, P., et al. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  21. Hill, W., et al. Lung adenocarcinoma promotion by air pollutants. Nature. 616 (7955), 159-167 (2023).
  22. Piao, C. H., et al. PM2.5 exposure regulates th1/th2/th17 cytokine production through NF-κβ signaling in combined allergic rhinitis and asthma syndrome. Int Immunopharmacol. 119, 110254 (2023).
  23. Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume protein concentration determination using the nanodrop 2000c spectrophotometer. J Vis Exp. 33, e1610 (2009).
  24. Luo, J., et al. Distinct clinical phenotypes of primary Sjogren's syndrome differ by onset age: A retrospective study of 742 cases and review of the literature. Clin Exp Rheumatol. 40 (12), 2373-2380 (2022).
  25. Luppi, F., et al. Lung complications of Sjogren syndrome. Eur Respir Rev. 29 (157), (2020).
  26. Berardicurti, O., et al. Interstitial lung disease and pulmonary damage in primary Sjogren's syndrome: A systematic review and meta-analysis. J Clin Med. 12 (7), 2586 (2023).
  27. Roca, F., et al. Interstitial lung disease in primary Sjogren's syndrome. Autoimmun Rev. 16 (1), 48-54 (2017).
  28. Fisher, D. A., et al. Diagnosis and treatment of lung cancer in the setting of interstitial lung disease. Radiol Clin North Am. 60 (6), 993-1002 (2022).
  29. Okudela, K., et al. Implications of thyroid transcription factor-1 gene methylation in carcinogenesis of interstitial pneumonia-related non-terminal respiratory unit lung adenocarcinoma. Int J Clin Exp Pathol. 15 (3), 120-130 (2022).
  30. Sekine, A., et al. Disease activity of lung cancer at the time of acute exacerbation of interstitial lung disease during cytotoxic chemotherapy. Thorac Cancer. 13 (17), 2443-2449 (2022).
  31. Glaviano, A., et al. PI3K/AKT/mTOR signaling transduction pathway and targeted therapies in cancer. Mol Cancer. 22 (1), 138 (2023).
  32. Ediriweera, M. K., Tennekoon, K. H., Samarakoon, S. R. Role of the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in ovarian cancer: Biological and therapeutic significance. Semin Cancer Biol. 59, 147-160 (2019).
  33. Hoxhaj, G., Manning, B. D. The PI3K-AKT network at the interface of oncogenic signalling and cancer metabolism. Nat Rev Cancer. 20 (2), 74-88 (2020).
  34. Liu, R., et al. PI3K/AKT pathway as a key link modulates the multidrug resistance of cancers. Cell Death Dis. 11 (9), 797 (2020).
  35. Manogaran, P., Beeraka, N. M., Paulraj, R. S., Sathiyachandran, P., Thammaiappa, M. Impediment of cancer by dietary plant-derived alkaloids through oxidative stress: Implications of PI3K/AKT pathway in apoptosis, autophagy, and ferroptosis. Curr Top Med Chem. 23 (10), 860-877 (2023).
  36. Acosta-Martinez, M., Cabail, M. Z. The PI3K/AKT pathway in meta-inflammation. Int J Mol Sci. 23 (23), 15330 (2022).
  37. Chen, G. Y., et al. Prediction of Rhizoma Drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 5233462 (2021).
  38. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of Rhizoma Drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κβ and PI3K/AKT pathways. Evid Based Complement Alternat Med. 2021, 6634837 (2021).
  39. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of Rhizoma Drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Des Devel Ther. 16, 1743-1766 (2022).
  40. Yao, C., Narumiya, S. Prostaglandin-cytokine crosstalk in chronic inflammation. Br J Pharmacol. 176 (3), 337-354 (2019).
  41. Liu, P., et al. NOD-like receptor signaling in inflammation-associated cancers: From functions to targeted therapies. Phytomedicine. 64, 152925 (2019).
  42. Damasceno, L. E. A., et al. PKM2 promotes Th17 cell differentiation and autoimmune inflammation by fine-tuning stat3 activation. J Exp Med. 217 (10), e20190613 (2020).
  43. Banerjee, S., Biehl, A., Gadina, M., Hasni, S., Schwartz, D. M. JAK-STAT signaling as a target for inflammatory and autoimmune diseases: Current and future prospects. Drugs. 77 (5), 521-546 (2017).
  44. Jiramongkol, Y., Lam, E. W. FOXO transcription factor family in cancer and metastasis. Cancer Metastasis Rev. 39 (3), 681-709 (2020).
  45. Tong, X., et al. Targeting cell death pathways for cancer therapy: Recent developments in necroptosis, pyroptosis, ferroptosis, and cuproptosis research. J Hematol Oncol. 15 (1), 174 (2022).
  46. Ou, H. L., et al. Cellular senescence in cancer: From mechanisms to detection. Mol Oncol. 15 (10), 2634-2671 (2021).
  47. Felten, R., et al. Interleukin 6 receptor inhibition in primary Sjogren syndrome: A multicentre double-blind randomised placebo-controlled trial. Ann Rheum Dis. 80 (3), 329-338 (2021).
  48. Bardsen, K., et al. Interleukin-1-related activity and hypocretin-1 in cerebrospinal fluid contribute to fatigue in primary Sjogren's syndrome. J Neuroinflammation. 16 (1), 102 (2019).
  49. Barrera, M. J., et al. Tofacitinib counteracts il-6 overexpression induced by deficient autophagy: Implications in Sjogren's syndrome. Rheumatology (Oxford). 60 (4), 1951-1962 (2021).
  50. Liu, H., Zhou, Q., Xu, X., Du, Y., Wu, J. ASPM and TROAP gene expression as potential malignant tumor markers. Ann Transl Med. 10 (10), 586 (2022).
  51. Qian, X., et al. CCNB2 overexpression is a poor prognostic biomarker in Chinese NSCLC patients. Biomed Pharmacother. 74, 222-227 (2015).
  52. Mo, M. L., et al. Use of serum circulating CCNB2 in cancer surveillance. Int J Biol Markers. 25 (4), 236-242 (2010).
  53. Li, L., et al. NuSAP is degraded by APC/C-Cdh1 and its overexpression results in mitotic arrest dependent of its microtubules' affinity. Cell Signal. 19 (10), 2046-2055 (2007).
  54. Fabbro, M., et al. Cdk1/Erk2- and Plk1-dependent phosphorylation of a centrosome protein, cep55, is required for its recruitment to midbody and cytokinesis. Dev Cell. 9 (4), 477-488 (2005).
  55. Jeffery, J., Sinha, D., Srihari, S., Kalimutho, M., Khanna, K. K. Beyond cytokinesis: The emerging roles of CEP55 in tumorigenesis. Oncogene. 35 (6), 683-690 (2016).
  56. Feng, Z., et al. Overexpression of abnormal spindle-like microcephaly-associated (ASPM) increases tumor aggressiveness and predicts poor outcome in patients with lung adenocarcinoma. Transl Cancer Res. 10 (2), 983-997 (2021).
  57. Zheng, H., et al. Comprehensive pan-cancer analysis reveals NuSAP1 is a novel predictive biomarker for prognosis and immunotherapy response. Int J Biol Sci. 19 (14), 4689-4708 (2023).
  58. Verstappen, G. M., Pringle, S., Bootsma, H., Kroese, F. G. M. Epithelial-immune cell interplay in primary sjogren syndrome salivary gland pathogenesis. Nat Rev Rheumatol. 17 (6), 333-348 (2021).
  59. El Rayes, T., et al. Lung inflammation promotes metastasis through neutrophil protease-mediated degradation of Tsp-1. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (52), 16000-16005 (2015).
  60. Zhao, L., et al. PM2.5 and serum metabolome and insulin resistance, potential mediation by the gut microbiome: A population-based panel study of older adults in china. Environ Health Perspect. 130 (2), 27007 (2022).
  61. Li, J., et al. PM2.5 exposure perturbs lung microbiome and its metabolic profile in mice. Sci Total Environ. 721, 137432 (2020).
  62. Liao, J. H., et al. Network pharmacology-based strategy to investigate the mechanisms of artemisinin in treating primary sjogren's syndrome. BMC Immunol. 25 (1), 16 (2024).
  63. Hu, Q., et al. JAK/STAT pathway: Extracellular signals, diseases, immunity, and therapeutic regimens. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1110765 (2023).
  64. Xue, C., et al. Evolving cognition of the JAK-STAT signaling pathway: Autoimmune disorders and cancer. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 204 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

KEGGGOJAK2 STAT3PM2 5QPCRELISAWestern Blotting

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved