Parche de grabación Clamp de canales iónicos expresados ​​en ovocitos de Xenopus

Resumen

Esta pretende ser una introducción a la revisión de la grabación de la abrazadera ovocitos de Xenopus laevis. Cubre la eliminación vitelina membrana, la formación de un sello gigaohm (gigaseal), y la conversión opcional de la revisión a la topología de fuera-out.

Resumen

Desde su desarrollo por Sakmann Neher y ^{1, 2,} el patch clamp se ha establecido como una técnica muy útil para la medición electrofisiológica de los canales de iones únicos o múltiples en las células. Esta técnica se puede aplicar a los canales de iones, tanto en su ambiente nativo y se expresa en células heterólogas, tales como oocitos recolectados de la rana de uñas africana, Xenopus laevis. Aquí se describe la técnica bien establecida de la grabación de patch clamp de los ovocitos de Xenopus. Esta técnica se utiliza para medir las propiedades de los canales iónicos, expresados ​​en las poblaciones (macropatch) o de forma individual (un solo canal de grabación). Nos centramos en las técnicas para maximizar la calidad de la preparación de los ovocitos y la generación de sello. Con todos los factores optimizado, esta técnica da una probabilidad de éxito en la generación de sello 90 por ciento. El proceso puede ser optimizado de manera diferente por cada investigador sobre la base de los factores que él o ella encuentra más importante, y se presenta el enfoque que han llevado al éxito más grande en nuestras manos.

Protocolo

Parte 1: Extracción de la membrana vitelina

1. Prepare dos juegos de pinzas. Preferimos No. 5 pinzas, donde ha sido un conjunto ligeramente afilado con una lima. También preparan una pipeta de transferencia de cristal por el recorte y pulido fuego-a 7 "pipeta Pasteur.
2. Recomendado: Para evitar que los oocitos de deslizamiento, cortar un círculo de rejilla (1 plazas mm) y pegamento en la parte inferior de una placa de Petri de 60 mm. Este plato se puede reutilizar indefinidamente si se mantienen limpias entre los usos.
3. Llene la caja de Petri hasta la mitad con una solución hiperosmótico (ver receta) y de lugar en un microscopio de disección.
4. Quitar 1-3 ovocitos de Xenopus de su solución de incubación con una pipeta Pasteur pulida y colocar en el plato.
5. Espere 15 segundos - 2 minutos para que las células comienzan a contraerse. Ya veces hacen que las células más fáciles de pelar, menor tiempo de llevar a las células sanas del parche.
6. A medida que la célula se contrae, la membrana vitelina que comienzan a ser apenas visible como una capa transparente sobre la celda. Seleccione una célula sana (sin espirales o defectos) para pelar.
7. Con un par de pinzas, pellizque suavemente la membrana vitelina, sin dañar la membrana plasmática. Con el otro, captar cerca del mismo lugar y suavemente romper la membrana clara separación y libre de la célula.
8. Con la pipeta Pasteur, cuidadosamente el movimiento de la célula a la cámara de grabación. Tenga en cuenta que la celda será frágil después de la eliminación vitelino.

Parte 2: generación Gigaseal

1. Llenar una pipeta de grabación con solución salina. Use el volumen mínimo de solución que hace buen contacto eléctrico con el cable del electrodo con el fin de minimizar la capacitancia pipeta.
2. Flick varias veces la pipeta para permitir que las burbujas para flotar y deslizarse sobre el alambre del electrodo.
   Aplique presión a la pipeta llena. Esto se puede hacer por vía oral o con una bomba de acuario de una tienda de mascotas. Esta presión es fundamental para mantener la pipeta limpia a su paso por la interfase líquido y se mueve a la celda.
3. Buscar el ovocito en la cámara y enfocar bien en el borde de la célula.
4. Con la pipeta de la bañera, el centro de la punta (fuera de foco) por encima de la celda. Esto minimiza el tiempo gastado en el baño antes de la generación del sello.
5. Caída de la pipeta hacia abajo sobre el tapete junto a la celda. Lo pongo en las proximidades (~ 50 micrones). Usted debe ver una pequeña distorsión de la solución empujado fuera de la pipeta por la presión de la espalda.
6. Usando el software de patch clamp, comprobar la resistencia de la pipeta (nuestra meta es de aproximadamente 3.4 MW) y el cero actual con la tensión de offset.
7. Con una presión positiva en la pipeta, mover la punta lentamente hacia la célula, mientras que el control de la resistencia visualmente o mediante un monitor de audio que genera un tono cuya frecuencia es proporcional a la resistencia. Como la punta empieza a tocar el celular, la resistencia aumentará.
8. De pronto, suavemente pero con cambiar de positivo a la presión negativa de aproximadamente el mismo valor absoluto. La resistencia debe aumentar para sellar la formación.
9. La mayoría de las veces, la formación de sello se produce en cuestión de segundos, en ocasiones 30-60 segundos son necesarios.
10. Una vez que la resistencia se encuentra en 1GΩ, la presión puede ser liberado a la posición neutral. Ahora tiene un parche en las células. De un parche de adentro hacia fuera, se alejan de la célula con rapidez. Por fuera, fuera, ver a continuación.

Parte 5: Fuera de salida topología (opcional)

1. Inmediatamente después de lograr una ruptura gigaseal, la membrana. Esto se puede hacer con la succión fuerte, pero nosotros preferimos un 1 V pulso de 1 ms. La resistencia debe caer a poco más de la resistencia inicial de la pipeta.
2. Mueva la pipeta fuera de la celda lenta y suavemente. Usted debe ver una sección de la atracción de células con la pipeta. De repente, y en unos pocos segundos, la célula se ajustará hacia atrás y la resistencia debe de inmediato y al mismo tiempo volver a GΩs.
3. Ahora tiene un parche en la configuración exterior de salida. El ectodomains de los canales de iones se incluye expuestos a la bañera.

Parte 6: Resultados esperados

Generalmente, cuanto mayor resistencia a las focas son preferibles y vivieron más tiempo. 10 GΩ es una buena guía de alta calidad de los sellos. En nuestra experiencia, las posibilidades de conseguir los sellos de esta calidad varía con muchos factores, sobre todo de células y una pipeta de calidad. Las tasas de adquisición de parches pueden ser más del 95% con las células sanas, pipetas limpias, y un investigador experimentado. Estas manchas pueden durar muchos minutos y son adecuados para cualquier estudio electrofisiológico de los canales iónicos expresados ​​en ovocitos de Xenopus, incluyendo grabaciones de un solo canal.

Discusión

Hay muchos parámetros de registro electrofisiológico no se discute aquí. Configuración de plataforma, sistema de gestión de ruido, la expresión de los canales y protocolos de registro son también fundamentales para un buen resultado experimental.

En nuestra experiencia, estos son los parámetros más importantes para la formación de sellos fiables: los ovocitos de alta calidad, la eliminación de la membrana vitelina rápidamente (también conocido como "peeling"), usar pipetas de nueva tira protegidos del polvo, p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Patch Clamp Amplifier & Software	Instrument	HEKA Instruments	EPC-10	Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B)
No. 5 forceps (two pairs)	Tool	Fine Science Tools
Oocyte shrinking solution	Reagent			Ingredient In mMN-methyl-D-glucamine 220HEPES 10MgCl2 1EGTA 10Aspartic Acid 220KCl 2pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine
woven mesh	800 um	Spectrum Labs	146481