アフリカツメガエルの卵母細胞で発現イオンチャネルのパッチクランプ記録

要約

これは、アフリカツメガエル卵母細胞からパッチクランプ記録の紹介を目的としています。それは、卵黄膜の除去、gigaohmシール（gigaseal）の形成、および外部のアウトトポロジへのパッチの任意の変換をカバーしています。

要約

ザクマンとネーアー^1、2による開発以来、パッチクランプ、細胞内の単一または複数のイオンチャネルの電気生理学的測定のための極めて有用な手法として確立されています。この手法は、両方のそれらのネイティブ環境でのイオンチャネルに適用され、そのようなアフリカツメガエル、アフリカツメガエルから採取した卵母細胞として異種細胞で発現することができます。ここで、我々は、アフリカツメガエルの卵母細胞からパッチクランプ記録の十分に確立された技法を説明します。この手法は、個々に個体数（macropatch）または（シングルチャンネル記録）のいずれかで表されるイオンチャネルの特性を測定するために使用されます。私たちは、卵母細胞の準備とシールの世代の品質を最大化するテクニックに焦点を当てる。すべての要因が最適で、この手法は90％以上成功したシールの生成の確率を与える。プロセスは、彼または彼女は最も重要な見つけるの要因に基づいてすべての研究者によって異なって最適化、そして私たちの手で最高の成功につながる持ってアプローチを提示することができます。

プロトコル

パート1：卵黄膜を除去する

1. 鉗子のセットを2つ準備します。我々は1つのセットが若干ファイルで削ったされている5号鉗子を、好む。また7"パスツールピペットをトリミングし、火災、研磨によってガラスの転送ピペットを準備。
2. 推奨：滑りから卵母細胞を防止するために、グリッドのサークル（1 mmの正方形）をカットと60mmペトリ皿の底に接着剤。使用の間に清潔に保つ場合は、この料理は、無期限に再利用することができます。
3. 解剖顕微鏡下で高浸透液（レシピを参照）と場所と途中でペトリ皿を埋める。
4. 皿に洗練されたパスツールピペットや場所とのインキュベーション溶液から1月3日アフリカツメガエルの卵母細胞を取り外します。
5. 15秒待ってから - セルのための2分を縮小するために開始する。長い時間が剥離し、細胞が容易になります。短い時間では、パッチ適用のための健康な細胞につながる。
6. 細胞が収縮するように、卵黄膜は、セルの上に透明層としてかろうじて目に見えるようになるに開始されます。剥離のための健康な細胞を（渦巻きまたは欠陥のない）]を選択します。
7. 鉗子の一組で、静かに形質膜にダメージを与えることなく、卵黄膜を把握する。他に、同じ場所の近くで持ち、ゆっくりと離れて明確な膜を引き裂き、細胞の自由。
8. パスツールピペットで、慎重に録音室にセルを移動する。細胞は、卵黄の除去後に壊れやすいとなることに注意してください。

パート2：Gigaseal世代

1. 生理食塩水で記録ピペットを埋める。ピペット容量を最小限に抑えるために、電極ワイヤとの良好な電気的接触を行うソリューションの最小量を使用してください。
2. ピペット数回は、泡が浮くと電極ワイヤの上にスライドできるようにするフリック。
   満たされたピペットに圧力を適用する。これは、口からかペットショップから水槽のポンプを使用して行えます。この圧力は、液体の界面とセルへの移動を横切るようにピペットをきれいに保つことが重要です。
3. チャンバー内の卵母細胞を見つけると、セルの端に鋭く焦点を当てる。
4. バス、中央のセルの上（ピントの）先端からピペットで。これを最小限に抑え、時間は、シールの世代の前にお風呂で過ごした。
5. セルの隣の鋭い焦点にピペットをドロップダウン。近い（〜50ミクロン）にそれをもたらす。あなたは、ソリューションの小さな歪みが、背圧によってピペットから押し出されるはずです。
6. パッチクランプのソフトウェアを使用して、ピペットの抵抗を確認してください（私たちの目標はMΩ約3-4である）と、オフセット電圧を使用して電流をゼロにする。
7. 視覚的に抵抗を監視したり、周波数の抵抗に比例するトーンを生成するオーディオモニタを使用しながら、ピペットで正圧で、細胞に向かって徐々にヒントを移動します。先端が細胞に触れ始めると、抵抗が増加します。
8. 突然、かつ慎重に肯定からほぼ同じ絶対値の負圧に切り替える。抵抗は、形成をシールする増やす必要があります。
9. 時間の大半は、シールの形成は、数秒以内に行われます。時には30〜60秒が必要です。
10. 抵抗値が1GΩになると、圧力がニュートラルに解放することができます。今すぐ上のセルパッチを持っている。インサイドアウトのパッチの場合は、速やかに細胞から引き離します。外アウトの場合は、以下を参照してください。

第5部：外アウトトポロジ（オプション）

1. すぐにgigaseal、破裂膜を達成した後。これは、鋭い吸引で行う、しかし、我々は1ミリ秒の1 Vのパルスを好むことができる。抵抗は、初期のピペットの抵抗よりも少しにドロップする必要があります。
2. 離れてゆっくりとスムーズに細胞からピペットを移動します。あなたは、ピペットで細胞のプルのセクションを参照してください。突然、数秒で、セルが跳ね返るだろうと抵抗がすぐにと同時にGΩsに返す必要があります。
3. これで、外部のアウト設定のパッチを持っている。どんな付属のイオンチャネルのectodomainsはお風呂に公開されます。

パート6：予測される結果

一般的に、より高い抵抗シールが好ましく、より長い寿命です。 10GΩは、高品質のシールのよいガイドラインになります。我々の経験では、この品質のシールを得ることのチャンスが特に多くの要因、細胞やピペットの品質によって異なります。パッチの取得率は健康な細胞、きれいなピペット、および経験豊富な研究者で95％以上にすることができます。これらのパッチは、何分間も続くとシングルチャネルの録音を含む、アフリカツメガエルの卵母細胞で発現するイオンチャネル、任意の電気生理学的研究に適している可能性があります。

ディスカッション

ここで説明していない電気生理学的記録の多くのパラメータがあります。リグのセットアップ、システムのノイズ管理、チャネルの発現、および記録のプロトコルはすべての良い実験結果にも重要です。

我々の経験では、これらは信頼性の高いシールを形成するための最も重要なパラメータです：風呂に入るときに、高品質の卵母細胞は、（別名、"はがれ"）を迅速卵黄膜を除去し、ホコリか?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Patch Clamp Amplifier & Software	Instrument	HEKA Instruments	EPC-10	Or other similar device (e.g. HEKA EPC-9 or Axopatch 200B)
No. 5 forceps (two pairs)	Tool	Fine Science Tools
Oocyte shrinking solution	Reagent			Ingredient In mMN-methyl-D-glucamine 220HEPES 10MgCl2 1EGTA 10Aspartic Acid 220KCl 2pH to 7.4 w/ N-methyl-D-glucamine
woven mesh	800 um	Spectrum Labs	146481