1. Inyección de nanopartículas y recolección de órganos

1. Inyecte nanopartículas en un ratón anestesiado por vía intravenosa para permitir la orientación pasiva.
2. En los momentos deseados, es decir, 1, 4 y 8 semanas, después de la inyección, humanmente eutanasia a los ratones de acuerdo con las directrices de la Asociación Médica Veterinaria Estadounidense (AVMA).
3. Abra la cavidad corporal y retire quirúrgicamente los órganos de interés. Coloque los órganos en una formalina tamponada al 10% de fosfato en un recipiente de polipropileno hasta la preparación de la muestra.

2. Preparación de muestras de tejido

1. Utilice fórceps para transferir el tejido del ratón del fijador a la solución salina tamponada de fosfato (PBS). Mece la muestra durante 30 minutos, reemplazando el PBS cada 10 min.
2. Retire el tejido y séquelo con un kimwipe. A continuación, colóquelo en un molde de plástico que contenga un compuesto de temperatura de corte óptimo (OCT). Conservar a -80oC durante la noche.
3. Al día siguiente, transfiera la muestra al criostato y ajuste la temperatura a -23 oC.
4. Etiqueta los portaobjetos con el tipo de órgano y el tamaño de las nanopartículas, y colócalos en un estante en el criostato.
5. Cubra el mandril de criostato con OCT y coloque la muestra en la parte superior. Baje el émbolo del extractor sobre la muestra y deje que se equilibre durante 3-5 min.
6. Monte el mandril en el soporte de la muestra y oriente para que la cuchilla pueda cortar directamente a través de la muestra congelada. Acerque la muestra a la cuchilla para que esté rugosa. Ajuste el espesor a 30 m y corte varias secciones hasta que se produzca una rebanada cortada uniformemente.
7. Cambie a la cara fina reduciendo el espesor de la sección a 7-8 m. Recoja una sección en rodajas presionando una diapositiva de vidrio etiquetada en la rebanada. Coloque dos diapositivas en cada diapositiva y guárdelas en un portaobjetos. Dejar secar a temperatura ambiente.
8. Una vez secas, deshidratar las muestras sumergiendo la portaobjetos en etanol al 50% durante 3 min para eliminar los PTU. A continuación, transfiera el bastidor al 80% de etanol durante 3 minutos antes de colocar el bastidor en una proporción de 1:1 de metanol frío a acetona durante 10 minutos a -20 oC.
9. Retire la portaobjetos y escurra el exceso de disolvente en una toalla de papel. Después de 20-30 minutos, coloque las diapositivas en una caja de diapositivas y guárdelas en un congelador a -20 oC hasta la toma de imágenes.

3. Imágenes de alta resolución utilizando SEM y EDS

1. Prepare la muestra como se describe en "Imágenes SEM de muestras biológicas." A continuación, cargue la muestra en el SEM.
2. Encienda el SEM y ajuste la distancia de trabajo a alrededor de 5 mm y la tensión de aceleración y la corriente de haz a 25 keV, que normalmente sería demasiado alta para una muestra biológica. Sin embargo, la muestra está recubierta para la conductividad y la protección.
3. Inicie la toma de imágenes y haga zoom a alrededor de 1.000-2.000X de aumento para ver las estructuras que contendrían las nanopartículas. Tenga en cuenta que sin la detección de dispersión posterior (BSD) no se puede distinguir por debajo de una cierta profundidad.
4. Inserte el BSD bajo los mismos parámetros y mueva la etapa en la dirección z a la misma distancia de trabajo que antes.
5. Comience a tomar imágenes en torno al mismo aumento y compruebe que puede ver un alto contraste en presencia de nanopartículas. Guarde las imágenes.
6. Utilice diferentes configuraciones BSD (donde las cargas en el detector se alinean) para elegir la que muestra el contraste más alto para las nanopartículas.
7. Acercar en un área de alto contraste que muestra una nanopartícula o grupo de nanopartículas.
8. Abra la^2a cámara de la cámara y observe mientras inserta el EDS en el sistema pulsando el botón hacia abajo del accesorio SEM. Una vez que el EDS esté cerca pero no toque el BSD o el cañón, suelte el botón.
9. Abra el programa azteca en el ordenador EDS (todavía en la estación de trabajo) y adquiera una imagen del SEM. Utilice el método "punto y disparo" para hacer clic en un área muy densa en contraste y nanopartículas.
10. El EDS mostrará el espectro de rayos X característicos a partir de ese punto. Busque los picos de bario y titanio que se identificarán en el gráfico. Esto confirma que lo que está viendo son de hecho las nanopartículas y no cualquier tipo de contaminación.
11. Vuelva a la muestra y utilice el software Atlas para mapear los bordes del órgano en la diapositiva. Seleccione el protocolo "Organ" para crear una imagen de mosaico del área y déjela funcionar (esto puede tardar unas horas como máximo).
12. Una vez que el software cree y cose la imagen compuesta, expórtela como un archivo Tif.
13. Abra el archivo Tif en ImageJ, un software de código abierto, y ajuste los valores de umbral de contraste para resaltar las áreas de contraste muy alto (es decir, las nanopartículas). Utilice funciones integradas para cuantificar el volumen de nanopartículas utilizando el tamaño de píxel definido en el protocolo Organ (debe ser de alrededor de 100 nm).
14. Mientras que este procedimiento se refiere sólo a la muestra de 1 semana del pulmón del ratón, este procedimiento se repite con las muestras de otras semanas y otros órganos para compilar un gráfico que muestra la distribución.
15. Después de calcular la biodistribución de cada órgano para cada semana, los gráficos de biodistribución mostrarán los cambios en la biodistribución y la concentración de nanopartículas en el transcurso de las 8 semanas. Estos muestran la concentración máxima y también proporcionan información sobre cuánto tiempo tardan las nanopartículas en borrarse del órgano.