Fuente: Christopher P. Corbo¹, Jonathan F. Blaize¹, Elizabeth Suter^1
1 Departamento de Ciencias Biológicas, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 10301

Las células procaquerías son capaces de habitar casi todos los ambientes de este planeta. Como reino, poseen una gran diversidad metabólica, lo que les permite utilizar una amplia variedad de moléculas para la generación de energía (1). Por lo tanto, al cultivar estos organismos en el laboratorio, todas las moléculas necesarias y específicas necesarias para hacer energía deben ser proporcionadas en los medios de crecimiento. Mientras que algunos organismos son metabólicamente diversos, otros son capaces de sobrevivir en ambientes extremos como altas o bajas temperaturas, pH alcalino y ácido, ambientes reducidos o ausentes de oxígeno, o ambientes que contienen alta sal (2,3,4). Llamados "extremofílicos", estos organismos a menudo requieren que estos ambientes intensos proliferen. Cuando los científicos buscan cultivar estos organismos, los componentes de los medios de comunicación, así como las condiciones ambientales específicas, deben tenerse en cuenta para cultivar con éxito los organismos de interés.

Los científicos son capaces de cultivar organismos cultivables en el laboratorio porque entienden los requisitos específicos que esas especies necesitan para crecer. Sin embargo, los organismos culturables representan menos del 1% de las especies que se estima que están en el planeta (5). Los organismos que hemos detectado por secuenciación genética pero que no son capaces de crecer en el laboratorio se consideran inculturables (6). En este momento, no sabemos lo suficiente sobre el metabolismo y las condiciones de crecimiento de estos organismos para replicar su entorno en el laboratorio.

Los organismos fastidiosos se encuentran en algún lugar entre los dos primeros. Estos organismos son culturables, pero requieren condiciones de crecimiento muy específicas, como componentes específicos de los medios de crecimiento y/o condiciones de crecimiento específicas. Dos ejemplos de estos géneros son Neisseria sp. y Haemophilus sp., que requieren glóbulos rojos parcialmente descompuestos (también conocidos como agar de chocolate), así como factores de crecimiento específicos y un entorno rico en dióxido de carbono (7). Sin todos los componentes específicos necesarios, estos organismos no crecerán en absoluto. A menudo, incluso con todos sus requisitos, estos organismos crecen mal.

A diferencia de las células eucariotas, que sólo son capaces de crecer en un ambiente aeróbico, u oxígeno que contiene, las células procasinoticas son capaces de crecer anaeróbicamente utilizando varias vías de fermentación para generar una amplia energía (8). Otros prokaryotes prefieren un ambiente microaerofílico, o de oxígeno reducido, o incluso un ambiente conofílico, o de dióxido de carbono alto (9). Estos organismos son más difíciles de enriquecer, ya que la atmósfera debe ser alterada. Los científicos que trabajan con frecuencia con organismos sensibles a un entorno oxigenado normalmente trabajarían en una cámara anaeróbica e incubadora, donde un gas pesado e inerte como el argón se bombea para desplazar el oxígeno (10). Otros hacen uso de sistemas de paquetes de gas sellados disponibles convencionalmente que utilizan agua para generar hidrógeno y dióxido de carbono, junto con un catalizador como el paladio para eliminar todo el oxígeno atmosférico. Estos kits disponibles comercialmente pueden crear cualquiera de las condiciones atmosféricas antes mencionadas (10).

Ya sea cultivando un patógeno para determinar una posible infección o buscando identificar una especie específica de bacterias presentes en un entorno natural, existe un problema. Ninguna especie bacteriana habita en un hábitat. Las bacterias viven como comunidades multicelulares en todas partes, desde la piel de los seres humanos hasta los océanos de nuestro planeta (11). Al intentar aislar una especie de bacteria, los científicos deben trabajar para excluir los numerosos otros organismos que también habitan el área aislada. Por esta razón, los medios de crecimiento enriquecidos para las bacterias a menudo llevan a cabo dos funciones. La primera es hacer que los medios sean selectivos. Un agente selectivo evitará que algunas especies crezcan, sin inhibir y a menudo incluso promover áotras para crecer (12). La segunda función de los ingredientes de los medios de comunicación puede ser trabajar como agentes diferenciales. Estos agentes permiten la identificación de una característica bioquímica particular de un organismo aislado. Al emparejar varios medios selectivos y diferenciales diferentes junto con condiciones de crecimiento adecuadas, los científicos y diagnósticos son capaces de identificar la presencia de especies bacterianas específicas de un aislado particular.

Un ejemplo de un medio selectivo y diferencial que ayuda a la identificación es en el caso del organismo clínicamente significativo Staphylococcus aureus. Este organismo se cultiva típicamente en agar sal de manitol. Este medio no sólo selecciona para sólo los organismos que pueden vivir en un ambiente de alta sal, que incluyen algunos gram positivos como Staphylococcus,sino que también inhibe cualquier organismo sensible a la sal. El azúcar de manitol es el componente diferencial de este medio. De todas las especies clínicamente significativas de Staphylococcus, sólo S. aureus es capaz de fermentar manitol. Esta reacción de fermentación produce ácido como subproducto que hace que el indicador rojo metilo rojo en los medios se vuelva amarillo. Otras especies de Staphylococcus (como Staphylococcus epidermidis)aunque capaces de crecer, dejarán los medios de color rojo.

Este ejercicio de laboratorio demuestra una técnica aséptica adecuada, así como la inoculación adecuada de los medios de crecimiento del caldo. También introduce el crecimiento de organismos contaminantes comunes en medios de enriquecimiento, el uso de un sistema de cultivo anaeróbico de paquete de gas para bacterias anaeróbicas, y el uso de diferentes medios selectivos y diferenciales para la identificación presunta de gramos bacterias positivas y gramnegativas.

1. Preparación

1. Antes de comenzar, lávese bien las manos y ponte guantes de tamaño adecuado.
2. Esterilice la superficie de trabajo con 5% de hipoclorito sódico (blanqueador) y seque bien.
3. Coloque un lazo de inoculación en un matraz Erlenmeyer vacío de 120 ml para que no toque la parte superior del banco mientras trabaja.

2. Medios de crecimiento y culturas

1. Reúne cuatro platos de agar sal mannitol (MSA), agar azul de e

Agar sal mannitol (MSA): Este medio es selectivo para organismos gram positivos que son capaces de sobrevivir en 6.5% cloruro de sodio. Los organismos gramnegativos Escherichia coli y Proteus vulgaris no deben ser capaces de crecer en este medio debido a la alta concentración de sal. S. epidermidis y S. aureus deben ser capaces de crecer. El medio es diferencial entre los dos porque el S. aureus es capaz de fermentar el manito.

Diferentes especies bacterianas son capaces de crecer en diferentes ambientes y son capaces de utilizar diferentes fuentes de carbono como una forma de generar energía. Cuando se trabaja con estos como cultivos en el laboratorio, es importante conocer los componentes de los medios de crecimiento con los que se trabaja y hacer coincidir los medios de crecimiento con las especies bacterianas. Los científicos y diagnósticos también pueden explotar las diferentes reacciones bioquímicas como una forma de aislar diferente...

1. Fernandez, L. A. Exploring prokaryotic diversity: there are other molecular worlds. Molecular Microbiology, 55 (1), 5-15 (2005).
2. Grattieri, M., Suvira, M., Hasan, K., & Minteer, S. D. Halotolerant extremophile bacteria from the Great Salt Lake for recycling pollutants in microbial fuel cells. Journal of Power Sources, 356, 310-318 (2017).
3. Wendt-Potthoff K. & Koschorreck, M. Functional Groups and Activities of Bacteria in a Highly Acidic Volcanic Mountain Stream and Lake in Patagonia, Argentina. Microbial Ecology, 1, 92 (2002).
4. Lee, L. S., Goh, K. M., Chan, C. S., Annie Tan, G. Y., Yin, W.-F., Chong, C. S., & Chan, K.-G. Microbial diversity of thermophiles with biomass deconstruction potential in a foliage-rich hot spring. Microbiology Open, 7 (6), e00615 (2018)
5. Ito, T., Sekizuka, T., Kishi, N., Yamashita, A., & Kuroda, M. Conventional culture methods with commercially available media unveil the presence of novel culturable bacteria. Gut Microbes, 10 (1), 77-91. (2019)
6. Vartoukian, S. R., Palmer, R. M., & Wade, W. G. Strategies for culture of "unculturable" bacteria. FEMS Microbiology Letters, 309 (1), 1-7. (2010)
7. Harris, T. M., Rumaseb, A., Beissbarth, J., Barzi, F., Leach, A. J., & Smith-Vaughan, H. C. Culture of non-typeable Haemophilus influenzae from the nasopharynx: Not all media are equal. Journal of Microbiological Methods, 137, 3-5. (2017)
8. Wang, Y.-Y., Ai, P., Hu, C.-X., & Zhang, Y.-L. Effects of various pretreatment methods of anaerobic mixed microflora on biohydrogen production and the fermentation pathway of glucose. International Journal of Hydrogen Energy, 36 (1), 390-396. (2011)
9. Pascual, A., Basco, L. K., Baret, E., Amalvict, R., Travers, D., Rogier, C., & Pradines, B. Use of the atmospheric generators for capnophilic bacteria Genbag-CO₂ for the evaluation of in vitro Plasmodium falciparum susceptibility to standard anti-malarial drugs. Malaria Journal, 10, 8 (2011).
10. Summanen, P., McTeague, M., Väisänen, M.-L., Strong, C., & Finegold, S. Comparison of Recovery of Anaerobic Bacteria Using the Anoxomat®, Anaerobic Chamber, and GasPak®Jar Systems. Anaerobe, 5, 5-9. (1999)
11. de la Fuente-Núñez, C., Reffuveille, F., Fernández, L., & Hancock, R. E. Bacterial biofilm development as a multicellular adaptation: antibiotic resistance and new therapeutic strategies. Current Opinion in Microbiology, 16, 580-589. (2013)
12. Possé, B., De Zutter, L., Heyndrickx, M., & Herman, L. Novel differential and confirmation plating media for Shiga toxin-producing Escherichia coli serotypes O26, O103, O111, O145 and sorbitol-positive and -negative O157. FEMS Microbiology Letters, 282 (1), 124-131. (2008)