Fuente: Natalia Martin¹, Andrew J. Van Alst¹, Rhiannon M. LeVeque¹, y Victor J. DiRita^1
1 Departamento de Microbiología y Genética Molecular de la Universidad Estatal de Michigan

Las bacterias tienen la capacidad de intercambiar material genético (ácido desoxirribonucleico, ADN) en un proceso conocido como transferencia de genes horizontal. La incorporación de ADN exógeno proporciona un mecanismo mediante el cual las bacterias pueden adquirir nuevos rasgos genéticos que les permiten adaptarse a las condiciones ambientales cambiantes, como la presencia de antibióticos o anticuerpos (1) o moléculas que se encuentran en hábitats naturales (2). Existen tres mecanismos de transferencia génica horizontal: transformación, transducción y conjugación (3). Aquí nos centraremos en la transformación, la capacidad de las bacterias para tomar ADN libre del medio ambiente. En el laboratorio, el proceso de transformación consta de cuatro pasos generales: 1) Preparación de células competentes, 2) Incubación de células competentes con ADN, 3) Recuperación de células y 4) Placado de las células para el crecimiento de los transformadores (Figura 1).

Figura 1: Pasos generales del proceso de transformación. El proceso de transformación tiene cuatro pasos generales: 1) Preparación de células competentes, 2) Incubación con ADN, 3) Recuperación de las células y 4) Células de chapado para el crecimiento de los transformadores.

Para que se produzca la transformación, las bacterias receptoras deben estar en un estado conocido como competencia. Algunas bacterias tienen la capacidad de llegar a ser naturalmente competentes en respuesta a ciertas condiciones ambientales. Sin embargo, muchas otras bacterias no se vuelven competentes naturalmente, o las condiciones para este proceso son aún desconocidas. La capacidad de introducir ADN en bacterias tiene una gama de aplicaciones de investigación: generar múltiples copias de una molécula de ADN de interés, para expresar una gran cantidad de proteínas, como un componente en los procedimientos de clonación, y otros. Debido al valor de la transformación a la biología molecular, existen varios protocolos destinados a hacer que las células sean artificialmente competentes cuando se desconocen las condiciones de competencia natural. Se utilizan dos métodos principales para preparar células artificialmente competentes: 1) a través del tratamiento químico de las células y 2) la exposición de las células a pulsos eléctricos (electroporación). El primero utiliza diferentes productos químicos dependiendo del procedimiento para crear atracción entre el ADN y la superficie celular, mientras que el segundo utiliza campos eléctricos para generar poros en la membrana celular bacteriana a través de la cual pueden entrar las moléculas de ADN. El enfoque más eficiente para la competencia química es la incubación con cationes divalentes, sobre todo calcio (Ca²⁺) (4,5) Competencia inducida por calcio es el procedimiento que se describirá aquí (6). Este método se utiliza principalmente para la transformación de bacterias Gram-negativas, y ese será el foco de este protocolo.

El procedimiento de transformación química implica una serie de pasos en los que las células están expuestas a cationes para inducir la competencia química. Estos pasos son seguidos posteriormente por un cambio de temperatura - choque de calor - que favorece la absorción de ADN extraño por la célula competente (7). Los sobres de las células bacterianas se cargan negativamente. En bacterias Gram-negativas como Escherichia coli, la membrana externa se carga negativamente debido a la presencia de lipopolisacárido (LPS) (8). Esto resulta en la repulsión de las moléculas de ADN cargadas negativamente de manera similar. En la inducción de competencia química, los iones de calcio cargados positivamente neutralizan esta repulsión de carga permitiendo la absorción del ADN en la superficie celular (9). El tratamiento del calcio y la incubación con ADN se realizan sobre hielo. Posteriormente, se realiza una incubación a temperaturas más altas (42oC), el choque de calor. Este desequilibrio de temperatura favorece aún más la aceptación del ADN. Las células bacterianas deben estar en la fase de crecimiento exponencial medio para soportar el tratamiento de choque térmico; en otras etapas de crecimiento las células bacterianas son demasiado sensibles al calor, lo que resulta en una pérdida de viabilidad que disminuye significativamente la eficiencia de transformación.

Diferentes fuentes de ADN se pueden utilizar para la transformación. Típicamente, plásmidos, pequeñas moléculas circulares de ADN de doble cadena, se utilizan para la transformación en la mayoría de los procedimientos de laboratorio en E. coli. Para que los plásmidos se mantengan en la célula bacteriana después de la transformación, deben contener un origen de replicación. Esto permite que se repliquen en la célula bacteriana independientemente del cromosoma bacteriano. No todas las células bacterianas se transforman durante el procedimiento de transformación. Por lo tanto, la transformación produce una mezcla de células transformadas y células no transformadas. Para distinguir entre estas dos poblaciones, se utiliza un método de selección para identificar las celdas que han adquirido el plásmido. Los plásmidos suelen contener marcadores seleccionables, que son genes que codifican un rasgo que confiere una ventaja para el crecimiento (es decir, resistencia a un antibiótico o químico o rescate de una auxotrofia de crecimiento). Después de la transformación, las células bacterianas se chapan en medios selectivos, lo que sólo permite el crecimiento de las células transformadas. En el caso de las células transformadas con un plásmido que confiere resistencia a un antibiótico dado, los medios selectivos serán medios de crecimiento que contengan ese antibiótico. Se pueden utilizar varios métodos diferentes para confirmar que las colonias cultivadas en los medios selectivos son transformadores (es decir, han incorporado el plásmido). Por ejemplo, los plásmidos pueden recuperarse de estas células utilizando métodos de preparación de plásmidos (10) y digeridos para confirmar el tamaño del plásmido. Alternativamente, la PCR de colonia se puede utilizar para confirmar la presencia del plásmido de interés (11).

El objetivo de este experimento es preparar las células químicamente competentes de E. coli DH5, utilizando una adaptación del procedimiento de cloruro de calcio (12), y transformarlas con el plásmido pUC19 para determinar la eficiencia de transformación. La cepa de E. coli DH5 es una cepa comúnmente utilizada en aplicaciones de biología molecular. Debido a su genotipo, específicamente el recA1 y endA1, esta cepa permite una mayor estabilidad de la plaquita y mejorar la calidad del ADN plásmido en preparaciones posteriores. Dado que la eficiencia de transformación disminuye con el aumento del tamaño del ADN, el plásmido pUC19 se utilizó en este protocolo debido a su pequeño tamaño (2686 bp) (ver https://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/standard_cloning_vectors.html para un vectores). pUC19 confiere resistencia a la ampicilina y, por lo tanto, este fue el antibiótico utilizado para la selección.

Este protocolo describe la preparación y transformación de E. coli DH5 competente utilizando una adaptación del procedimiento de cloruro de calcio (12).

1. Configuración

1. Equipo
   • Espectrofotómetro
   • Centrífuga Sorval (o equivalente)
   • Centrífuga de sobremesa
   • Bloque de calor o baño de agua
   • Agitador orbital
   • Incubadora estacionaria
   • Bandeja de fundición de ge

Aunque TE depende de muchos factores, las preparaciones celulares competentes no comerciales, como esta, normalmente producen de 10⁶ a 10⁷ transformadores por microgramo de plásmido. Por lo tanto, esta preparación, con un TE de 2,46 x 10⁸ cfu/g, produjo un TE mucho más allá del rango esperado. Existen protocolos adicionales para fabricar celdas supercompetentes cuando se requieren mayores eficiencias de transformación para una aplicación determinada ...

La transformación es un método potente para introducir ADN exógeno en células bacterianas que es clave para muchas aplicaciones de biología molecular en el laboratorio. Además, desempeña un papel importante en la naturaleza al permitir que las células bacterianas intercambien material genético que podría resultar en una mayor variación genética y permitir la adquisición de diferentes rasgos beneficiosos para la supervivencia bajo una amplia gama de condiciones. Muchas cepas bacterianas codifican los genes ne...

1. Croucher, N. J. et al. Rapid pneumococcal evolution in response to clinical interventions. Science. 331 (6016):430-434. (2011)
2. Borgeaud, S. et al. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer. Science. 347(6217):63-67. (2015)
3. Burmeister, A. R. Horizontal Gene Transfer. Evol Med Public Health. 2015 (1):193-194. (2015)
4. Weston A, Brown MG, Perkins HR, Saunders JR, Humphreys GO. Transformation of Escherichia coli with plasmid deoxyribonucleic acid: calcium-induced binding of deoxyribonucleic acid to whole cells and to isolated membrane fractions. J Bacteriol. 145 (2):780-7. (1981)
5. Dagert M, Ehrlich SD. Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells. Gene. 6 (1):23-8. (1979)
6. Asif A, Mohsin H, Tanvir R, and Rehman Y. Revisiting the Mechanisms Involved in Calcium Chloride Induced Bacterial Transformation. Front Microbiol. 8:2169. (2017)
7. Panja S, Aich P, Jana B, Basu T. How does plasmid DNA penetrate cell membranes in artificial transformation process of Escherichia coli? Mol Membr Biol. 25 (5):411-22. (2008)
8. Silhavy, TJ, Kahne D, Walker S. The Bacterial Cell Envelope. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5): a000414. (2010)
9. Panja S, Aich P, Jana B, Basu T. (2008) Plasmid DNA binds to the core oligosaccharide domain of LPS molecules of E. coli cell surface in the CaCl2-mediated transformation process. Biomacromolecules. 9 (9):2501-9.
10. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. JoVE, Cambridge, MA. (2018)
11. Bergkessel M and Guthrie C. Colony PCR. Methods in Enzymology. 529: 299-309. (2013)
12. Sambrook J and Russell DW. Molecular Cloning A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.Protocol 25 (1.116-118). (2001)
13. Wirth R, Friesenegger A, Fiedler S. Transformation of various species of gram-negative bacteria belonging to 11 different genera by electroporation. Molecular & General Genetics. 216 (1): 175-7. (1989)