Fonte: Christopher P. Corbo¹, Jonathan F. Blaize¹, Elizabeth Suter^1
1 Dipartimento di Scienze Biologiche, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 10301

Le cellule procariotiche sono in grado di abitare quasi ogni ambiente su questo pianeta. Come regno, possiedono una grande diversità metabolica, che consente loro di utilizzare un'ampia varietà di molecole per la generazione di energia (1). Pertanto, quando si coltivano questi organismi in laboratorio, tutte le molecole necessarie e specifiche necessarie per produrre energia devono essere fornite nei mezzi di crescita. Mentre alcuni organismi sono metabolicamente diversi, altri sono in grado di sopravvivere in ambienti estremi come alte o basse temperature, pH alcalino e acido, ambienti ridotti o privi di ossigeno o ambienti contenenti sale elevato (2,3,4). Definiti "estremofili", questi organismi spesso richiedono questi ambienti intensi per proliferare. Quando gli scienziati cercano di coltivare tali organismi, i componenti dei media e le eventuali condizioni ambientali specifiche devono essere presi in considerazione per coltivare con successo gli organismi di interesse.

Gli scienziati sono in grado di coltivare organismi coltivabili in laboratorio perché comprendono i requisiti specifici di cui quelle specie hanno bisogno per crescere. Tuttavia, gli organismi coltivabili rappresentano meno dell'1% delle specie stimate sul pianeta (5). Gli organismi che abbiamo rilevato mediante sequenziamento genico ma che non sono in grado di crescere in laboratorio sono considerati incoltibili (6). In questo momento, non sappiamo abbastanza sul metabolismo e sulle condizioni di crescita di questi organismi per replicare il loro ambiente in laboratorio.

Gli organismi meticolosi si trovano da qualche parte tra i primi due. Questi organismi sono coltivabili, ma richiedono condizioni di crescita molto specifiche, come componenti specifici dei mezzi di crescita e / o condizioni di crescita specifiche. Due esempi di tali generi sono Neisseria sp. e Haemophilus sp., entrambi i quali richiedono globuli rossi parzialmente scomposti (noto anche come agar al cioccolato), nonché fattori di crescita specifici e un ambiente ricco di anidride carbonica (7). Senza tutti i componenti specifici richiesti, questi organismi non cresceranno affatto. Spesso, anche con tutte le loro esigenze, questi organismi crescono male.

A differenza delle cellule eucariotiche, che sono in grado di crescere solo in un ambiente aerobico o contenente ossigeno, le cellule procariotiche sono in grado di crescere anaerobamente utilizzando diverse vie di fermentazione per generare ampia energia (8). Altri procarioti preferiscono un ambiente microaerofilo, o a ridotto ossigeno, o anche un ambiente capnofilo o ad alta anidride carbonica (9). Questi organismi sono più difficili da arricchire, poiché l'atmosfera deve essere alterata. Gli scienziati che lavorano frequentemente con organismi sensibili a un ambiente ossigenato normalmente lavorano in una camera anaerobica e in un incubatore, dove un gas pesante e inerte come l'argon viene pompato per spostare l'ossigeno (10). Altri fanno uso di sistemi di pacchetti di gas sigillati convenzionalmente disponibili che utilizzano acqua per generare idrogeno e anidride carbonica, insieme a un catalizzatore come il palladio per rimuovere tutto l'ossigeno atmosferico. Questi kit disponibili in commercio possono creare una qualsiasi delle condizioni atmosferiche sopra menzionate (10).

Sia che si coltivi un agente patogeno per determinare una potenziale infezione o che si cerchi di identificare una specifica specie di batteri presenti in un ambiente naturale, esiste un problema. Nessuna specie batterica abita un habitat. I batteri vivono come comunità multicellulari ovunque, dalla pelle degli esseri umani agli oceani del nostro pianeta (11). Quando si tenta di isolare una specie di batteri, gli scienziati devono lavorare per escludere i numerosi altri organismi che abitano anche l'area isolata. Per questo motivo, i mezzi di crescita arricchiti per i batteri spesso svolgono due funzioni. Il primo è quello di rendere i media selettivi. Un agente selettivo impedirà ad alcune specie di crescere, pur non inibendo e spesso anche promuovendo altre a crescere (12). La seconda funzione degli ingredienti dei media può essere quella di lavorare come agenti differenziali. Tali agenti consentono l'identificazione di una particolare caratteristica biochimica di un organismo isolato. Accoppiando diversi mezzi selettivi e differenziali insieme a condizioni di crescita appropriate, scienziati e diagnostici sono in grado di identificare la presenza di specifiche specie batteriche da un particolare isolato.

Un esempio di mezzo selettivo e differenziale che aiuta nell'identificazione è nel caso dell'organismo clinicamente significativo Staphylococcus aureus. Questo organismo è tipicamente coltivato su mannitolo sale agar. Questo mezzo non solo seleziona solo gli organismi che possono vivere in un ambiente ad alto contenuto di sale, che includono alcuni gram positivi come lo Staphylococcus, ma inibisce anche tutti gli organismi sensibili al sale. Lo zucchero di mannitolo è il componente differenziale di questo mezzo. Di tutte le specie di Staphylococcus clinicamente significative, solo S. aureus è in grado di fermentare il mannitolo. Questa reazione di fermentazione produce acido come sottoprodotto che fa ingiallire l'indicatore rosso metile rosso nel mezzo. Altre specie di Staphylococcus (come lo Staphylococcus epidermidis)sebbene in grado di crescere, lasceranno i media di colore rosso.

Questo esercizio di laboratorio dimostra una corretta tecnica asettica, nonché una corretta inoculazione dei mezzi di crescita dal brodo. Introduce inoltre la crescita di organismi contaminanti comuni sui mezzi di arricchimento, l'uso di un sistema di coltura anaerobica a pacchetto di gas per batteri anaerobici e l'uso di diversi mezzi selettivi e differenziali per l'identificazione presuntiva di batteri gram positivi e gram-negativi.

1. Preparazione

1. Prima di iniziare, lavarsi accuratamente le mani e indossare guanti di dimensioni adeguate.
2. Sterilizzare la superficie di lavoro con ipoclorito di sodio al 5% (candeggina) e asciugare accuratamente.
3. Posizionare un anello di inoculazione in un pallone Erlenmeyer vuoto da 120 ml in modo che non tocchi il piano di lavoro.

2. Mezzi di crescita e culture

1. Raccogli quattro piatti di Mannitol Salt Agar (MSA

Mannitolo Sale Agar (MSA): Questo mezzo è selettivo per gli organismi gram positivi che sono in grado di sopravvivere nel 6,5% di cloruro di sodio. Gli organismi gram-negativi Escherichia coli e Proteus vulgaris non dovrebbero essere in grado di crescere su questo mezzo a causa dell'alta concentrazione di sale. S. epidermidis e S. aureus dovrebbero essere in grado di crescere. Il mezzo è differenziale tra i due perché il S. aureu...

Diverse specie batteriche sono in grado di crescere in ambienti diversi e sono in grado di utilizzare diverse fonti di carbonio come un modo per generare energia. Quando si lavora con queste colture in laboratorio, è importante conoscere i componenti dei mezzi di crescita con cui si lavora e abbinare i mezzi di crescita alle specie batteriche. Scienziati e diagnostici possono anche sfruttare le diverse reazioni biochimiche come un modo per isolare specie diverse dalle altre e come un modo per distinguere e identificare .

1. Fernandez, L. A. Exploring prokaryotic diversity: there are other molecular worlds. Molecular Microbiology, 55 (1), 5-15 (2005).
2. Grattieri, M., Suvira, M., Hasan, K., & Minteer, S. D. Halotolerant extremophile bacteria from the Great Salt Lake for recycling pollutants in microbial fuel cells. Journal of Power Sources, 356, 310-318 (2017).
3. Wendt-Potthoff K. & Koschorreck, M. Functional Groups and Activities of Bacteria in a Highly Acidic Volcanic Mountain Stream and Lake in Patagonia, Argentina. Microbial Ecology, 1, 92 (2002).
4. Lee, L. S., Goh, K. M., Chan, C. S., Annie Tan, G. Y., Yin, W.-F., Chong, C. S., & Chan, K.-G. Microbial diversity of thermophiles with biomass deconstruction potential in a foliage-rich hot spring. Microbiology Open, 7 (6), e00615 (2018)
5. Ito, T., Sekizuka, T., Kishi, N., Yamashita, A., & Kuroda, M. Conventional culture methods with commercially available media unveil the presence of novel culturable bacteria. Gut Microbes, 10 (1), 77-91. (2019)
6. Vartoukian, S. R., Palmer, R. M., & Wade, W. G. Strategies for culture of "unculturable" bacteria. FEMS Microbiology Letters, 309 (1), 1-7. (2010)
7. Harris, T. M., Rumaseb, A., Beissbarth, J., Barzi, F., Leach, A. J., & Smith-Vaughan, H. C. Culture of non-typeable Haemophilus influenzae from the nasopharynx: Not all media are equal. Journal of Microbiological Methods, 137, 3-5. (2017)
8. Wang, Y.-Y., Ai, P., Hu, C.-X., & Zhang, Y.-L. Effects of various pretreatment methods of anaerobic mixed microflora on biohydrogen production and the fermentation pathway of glucose. International Journal of Hydrogen Energy, 36 (1), 390-396. (2011)
9. Pascual, A., Basco, L. K., Baret, E., Amalvict, R., Travers, D., Rogier, C., & Pradines, B. Use of the atmospheric generators for capnophilic bacteria Genbag-CO₂ for the evaluation of in vitro Plasmodium falciparum susceptibility to standard anti-malarial drugs. Malaria Journal, 10, 8 (2011).
10. Summanen, P., McTeague, M., Väisänen, M.-L., Strong, C., & Finegold, S. Comparison of Recovery of Anaerobic Bacteria Using the Anoxomat®, Anaerobic Chamber, and GasPak®Jar Systems. Anaerobe, 5, 5-9. (1999)
11. de la Fuente-Núñez, C., Reffuveille, F., Fernández, L., & Hancock, R. E. Bacterial biofilm development as a multicellular adaptation: antibiotic resistance and new therapeutic strategies. Current Opinion in Microbiology, 16, 580-589. (2013)
12. Possé, B., De Zutter, L., Heyndrickx, M., & Herman, L. Novel differential and confirmation plating media for Shiga toxin-producing Escherichia coli serotypes O26, O103, O111, O145 and sorbitol-positive and -negative O157. FEMS Microbiology Letters, 282 (1), 124-131. (2008)