Damos las gracias a Harald Hutter y Decker Helena por su cuidadosa lectura de este manuscrito. También agradecemos a Reg Sidhu de Leica Microsystems por su experiencia técnica. Esta investigación fue apoyada por el Nacional de Ciencias e Ingeniería del Consejo de Canadá, el Premio # 327100-06, y de la Simon Fraser Facultad Universitaria de Ciencias.

Parte 1: La transfección de las neuronas con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) Instalación del equipo: Las neuronas del hipocampo de rata o ratón se cultivaron de acuerdo con Kaech y Banker, 2006 [4]. La densidad celular típico utilizado para transfecciones es de 250.000 cells/6-cm plato. Reactivos y equipos necesarios son 50 mM de ácido quinurénico, titular regular de tubo de laboratorio, un enfriador de sobremesa (el mejor para mantener fríos los reactivos Lipofectamine), Reactivo Lipofectamine, MEM, tubos de microcentrífuga, micropipetters y pinzas estériles. Procedimiento: <ol><li> Para cada etiqueta de transfección dos tubos de 1,5 ml, una para contener el ADN del plásmido, que contiene un reactivo de transfección. Las incubaciones siguiente puede proceder a temperatura ambiente. <ol><li> Combine 1,0 mg de ADN de plásmido con 100 l MEM en un tubo (sin extras de ningún tipo; MEM no tiene por qué ser la temperatura del pH equilibrado). </li><li> Combine 6,0 l con 100 Lipofectamine MEM l en el tubo de 1,5 mL otros. <ol><li> No se requieren ajustes para transfecciones dobles son requeridos a pesar de que la Lipofectamine: relación de ADN se reduce a la mitad en estos casos. La relación de Lipofectamine: El ADN es todavía dentro de la propuesta del fabricante. Lo mejor es probar 0,5-1,0 mg por cada plásmido para la expresión óptima. </li><li> Para preservar la vida útil del reactivo Lipofectamine, hay que sacar de la nevera durante el menor tiempo posible y se coloca en una nevera portátil de sobremesa, cuando no esté en uso. Tiempo total del refrigerador debe mantenerse al mínimo. </li></ol></li></ol></li><li> Incubar los tubos durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> La transferencia de la solución de ADN en el MEM en el tubo de lípidos, y mezcle suavemente con una pipeta, a continuación, se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Después de 25 minutos, antes de mover de un tirón cubreobjetos, se añaden 60 l de 50 mM de ácido quinurénico para minimizar el daño excitoxic al plato de las neuronas cultivadas. <ol><li> Cubreobjetos con cuidado voltear los pies de arriba abajo, usando pinzas esterilizadas, y arreglar lo que no se superpongan. Tenga cuidado de no raspar la superficie de las neuronas del cubreobjetos recubiertos o la superficie de las células de revestimiento, de la antena. </li></ol></li><li> Tome aproximadamente 0,5 mL de medio de la antena de 6 cm y mezcle suavemente con el ADN en el tubo, la transferencia de la solución de ADN de vuelta a la fuente que gotea de manera uniforme sobre la superficie del medio. </li><li> No remolino, pero deslice suavemente plato de ida y vuelta en una dirección, y luego se detiene y repite en la dirección perpendicular a distribuir uniformemente los complejos ADN-Lipofectamine. Incubar durante 90 minutos en el incubador de cultivo de tejidos (37 ° C CO, 5% 2). </li><li> Cubreobjetos voltear los pies, boca abajo, y arreglar lo que no se superpongan. Permitir la expresión de proceder durante el tiempo deseado, por lo general durante la noche a 48 horas. </li></ol> Parte 2: imágenes en vivo de la GFP-etiquetados denso núcleo de vesículas en cultivos de neuronas del hipocampo Instalación del equipo: <ol><li> Imágenes de células vivas requiere un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara CCD, se utiliza un microscopio Leica DMI 6000B invertido equipado con la variable de Leica, una lámpara fluorescente. También se requiere una cámara de imágenes con el controlador de temperatura y un calentador de objetivo. Usamos la Warner Instrumentos RC-21BR modificado para un cubreobjetos de 18 mm, además de un calentador de la plataforma (cat. # PH2) y el controlador de temperatura (cat. # TC324B). La cámara no contiene los puertos abiertos, una modificación que se pueden incluir en el pedido de la cámara. Un calentador objetivo es muy recomendable para ayudar a mantener la temperatura del cubreobjetos y minimizar los cambios de enfoque, debido a las fluctuaciones de temperatura. Las imágenes se adquieren con un Hamamatsu Orca-ER con Metamorph (Molecular Devices) de software, incluyendo el &#39;streaming&#39; modo de adquisición de drop-in. Nota-No utilizamos una cámara climática que encierra todo el microscopio. Esto además es caro y no es necesario para la proyección de imagen a corto plazo se describe aquí. </li><li> Otros equipos y reactivos son recién preparados medio de imágenes en vivo (1X Hanks con Ca 2 + y Mg 2 +, glucosa 0,6%, y HEPES 10 mM), más de 18 mm cubreobjetos de vidrio, pinzas estériles, pinzas sin esterilizar, Kimwipes, grasa de vacío , y una jeringuilla (sin aguja, o con modificación de grueso calibre de aguja) con el que aplicar grasa. </li></ol> Procedimiento: <ol><li> Prepare un nuevo medio de imágenes en vivo (1X Hanks con Ca 2 + y Mg 2 +, glucosa 0,6%, y HEPES 10 mM). Por lo general 50mls preparar a la vez y se almacenan a 4 º C cuando no estén en uso. Lo mejor es preparar lo suficiente para no más de una semana a la vez. Ml aproximadamente 5-10 se utilizan por plato de las neuronas. </li><li> Inicio microscopio, cámara, lámparas fluorescentes, y el software de adquisición de imágenes. También a su vez en el poder a la plataforma de la cámara y calentadores objetivo. </li><li> Preparar el imaginarg cámara. <ol><li> La cámara de Warner incluye una ranura de teflón para el montaje de cubreobjetos. Para facilitar la manipulación, la etiqueta de un lado de la inserción &quot;de arriba&quot; con un marcador permanente. </li><li> Aplicar un anillo de grasa en el surco que rodea el agujero en el lado de la cámara con la etiqueta &quot;top&quot;. Evite el uso de exceso, ya que entrarán en la cámara y reducir el área observable. </li><li> Con unas pinzas, coloque un paño limpio y sin usar de 18 cm cubreobjetos a la &quot;top&quot; de la cámara, presione suavemente el cubreobjetos en sus bordes para crear un sello hermético en la hundida de la cámara. </li><li> A su vez la cámara y aplicar más de un anillo similar de grasa a la ranura en el lado opuesto (inferior) de la cámara. </li><li> Coloque el preparado de cámara inferior hacia arriba-en la tapa de un tubo de 50 ml, que es un soporte de cámara ideal. </li><li> Añadir 750 l de medio de imágenes de la cámara. Esta es una cantidad excesiva, pero la grasa debe evitar que el medio se extienda y el exceso de ayudar a prevenir burbujas de ser atrapados cuando el cubreobjetos células cubiertas se aplica. </li><li> Mantener la cámara preparada en la incubadora de cultivo de tejidos hasta que se necesite. Incubación prolongada, aproximadamente 1 hora se debe evitar como medio de imágenes se evaporará y el cambio en la composición. </li></ol></li><li> Realizar el montaje final y la cámara de imágenes de células vivas. <ol><li> Mueve la cámara preparada y un plato de cubreobjetos transfectadas de la incubadora a la campana de cultivo de tejidos. </li><li> El conjunto de la cámara final debe realizarse con rapidez para garantizar que las células permanecen inmersos en el medio y en 37 ° C de forma continua. </li><li> Usando una pinza estéril, retirar con cuidado un portaobjetos de la antena transfectadas, tocar el borde del cubreobjetos a un Kimwipe para arrastrar medio de cultivo. </li><li> Coloque el cubreobjetos neurona boca abajo en la cámara preparada. Tocar un lado del cubreobjetos a la grasa primero y aplique presión alrededor de los bordes para que el cubreobjetos planos sin burbujas de captura. Medio de imágenes exceso se derrame como se esperaba. </li><li> Limpie el exceso de medio de imágenes, pero tenga cuidado de no rozar con los cubreobjetos de su posición. </li><li> Mueve la cámara del calentador de la plataforma pre-calentado y sujetar la cámara en su lugar. </li><li> La transferencia de la cámara a la escena. </li><li> Para reducir photobleaching y photoxicity, ajustar la luz a la cantidad mínima de intensidad necesaria para encontrar las células transfectadas. </li><li> Encontrar una célula de interés con un objetivo de aumento del petróleo baja (40X). Es beneficioso para mantenerse dentro de un patrón de búsqueda planificada para asegurar una cobertura máxima cubreobjetos y evitar adquisiciones redundantes imagen, a la izquierda, por ejemplo, la parte superior de cubreobjetos, escaneo de arriba a abajo de trabajo a la derecha. </li><li> Cambiar a un objetivo de aumento del petróleo (60-100x) una vez al campo deseado ha sido localizado. </li><li> Use la &quot;adquisición stream&quot; o función similar de su software de imagen para grabar un video de la dinámica de la proteína fluorescente marcado. </li><li> Toma una imagen de fase y cualquier otra imagen que acompaña (GFP soluble, por ejemplo) para su posterior análisis y presentación. </li><li> Guardar todas las imágenes antes de explorar el cubre más y la grabación del video a continuación. </li><li> Típicamente 3-5 videos de un cubreobjetos se considera correcta. Fototoxicidad y salud de las células en general debe tener en cuenta que el transporte se reduce en las células dañadas. Salud de las células pueden ser monitoreados mediante observación con microscopio de fase. Normalmente, las grabaciones se llevan a cabo durante aproximadamente 30 minutos por tapar. </li></ol></li></ol> Parte 3: Resultados del representante: Observaciones en vivo de imágenes de células normalmente consisten en videos (también conocido como &quot;pilas&quot; de las imágenes) que muestran el movimiento de los orgánulos marcados con fluorescencia en el campo de visión (fig. 1A). Que acompañan a cada vídeo son a menudo el apoyo a las imágenes que ilustran la orientación del campo de vista con respecto al cuerpo celular, el nivel de expresión de la proteína y / o la salud de la célula. Vídeos de transporte pueden ser sometidos a un análisis cuantitativo de la transformación de kymographs (fig. 1B). Kymographs son imágenes que ilustran el movimiento de partículas mediante la yuxtaposición de líneas de barrido que se representa cada punto del tiempo por una columna en el quimógrafo. La figura 2 muestra cómo dos partículas que se mueven en dirección opuesta se representan en un quimógrafo. Un análisis más detallado de kymographs puede proporcionar información sobre el flujo de partículas, la velocidad, la longitud de ejecución, las inversiones, y las partículas fijas. <img src="/files/ftp_upload/1144/fig1.jpg" alt="" /> Figura 1. Representante en vivo Observaciones celular de imágenes. (A) los fotogramas seleccionados de un vídeo de mCherry etiquetados con activador tisular del plasminógeno (TPA) de transporte. Las partículas individuales se mueven en la anterógrada (flechas verdes) y retrógrada (flechas rojas) se indican las instrucciones. (B) ilustra Kymographs TPA-mCherry movimiento en elaxón. Las líneas horizontales en kymographs representan objetos fijos, mientras que las líneas diagonales representan orgánulos alejarse de (pendiente positiva) o hacia (pendiente negativa) del cuerpo celular. Las largas flechas verdes y rojas muestran las carreras correspondientes a las partículas en (A). Cambios en el transporte debido a que el reactivo despolimerización de microtúbulos, nocodazole, también se ilustra con un quimógrafo. Tenga en cuenta la reducción de los orgánulos en movimiento por la ausencia de líneas en diagonal.

<ol>
	<li>Kulic, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubule+movement+in+bidirectional+organelle+transport.">The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).</li><li>Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+change+in+the+selective+translocation+of+the+Kinesin-1+motor+domain+marks+the+initial+specification+of+the+axon.">A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon.</a> Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).</li><li>Barkus, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+Axonal+Kinesin-3+Motor+for+Fast+Anterograde+Vesicle+Transport+that+Facilitates+Retrograde+Transport+of+Neuropeptides.">Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li></ol>

Imágenes de células vivas es una técnica difícil, pero de gran alcance para la observación directa de transporte de orgánulos en las neuronas cultivadas. Pueden surgir dificultades aguas arriba del procedimiento con la salud neuronal pobres debido a las complicaciones cultura. Por lo tanto, la salud celular (para ejemplos, ver ref. 4) deben ser evaluados antes y después de la transfección mediante la observación de los cubreobjetos, mientras que en medio de crecimiento con un cultivo de tejidos microscopio de l...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?ID=1144">Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons</a>. There was an error in the author's name. The author name was corrected to include a middle initial as follows:

David M. Kwinter, Michael A. Silverman

instead of:

David Kwinter, Michael Silverman.

A correction to author names has been made for article Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mediatech</td>
<td>10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-027</td>
<td>Transfection reagent</td>
</tr>
<tr>
<td>10X Hanks with Ca2+ and Mg2+</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>14185-052</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>
<tr>
<td>1M HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco/Invitrogen</td>
<td>15630-130</td>
<td>Live-imaging medium</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

live imaging of dense-core vesicles in primary cultured hippocampal neurons

La observación y la caracterización dinámica de los procesos celulares pueden dar información importante sobre la actividad celular que no se puede obtener a partir de imágenes estáticas. Vital sondas fluorescentes, especialmente proteína fluorescente verde (GFP) ha revolucionado la biología celular derivada de la capacidad de etiqueta específica compartimentos intracelulares y las estructuras celulares. Por ejemplo, la imagen en vivo de las buenas prácticas agrarias (y sus variantes espectral) quimeras han permitido un análisis dinámico del citoesqueleto, orgánulos de transporte, y la dinámica de la membrana en una multitud de organismos y tipos de células [1-3]. A pesar de imagen en vivo se ha convertido en frecuente, este enfoque también plantea muchos problemas técnicos, sobre todo en primaria neuronas cultivadas. Uno de ellos es la expresión de las buenas prácticas agrarias de etiquetado proteínas en las neuronas post-mitóticas, y el otro es la capacidad de capturar imágenes fluorescentes y reducir al mínimo la fototoxicidad, photobleaching, y mantener la salud celular en general. Aquí les ofrecemos un protocolo que describe un método de transfección basado en lípidos que produce una tasa de transfección relativamente baja (~ 0,5%), sin embargo, es ideal para la proyección de imagen de las neuronas totalmente polarizada. Una baja tasa de transfección es esencial para que los axones y las dendritas solo puede ser caracterizado en cuanto a su orientación hacia el cuerpo celular para confirmar la direccionalidad del transporte, es decir, anterógrada v. retrógrada. Nuestro enfoque de la imagen de las neuronas que expresan GFP se basa en un estándar de campo amplio microscopio de fluorescencia equipado con una cámara CCD, software de captura de imágenes, y una cámara de imágenes calientes. Hemos fotografiado una amplia variedad de organelos o estructuras, por ejemplo, denso núcleo de las vesículas, los conos de la mitocondria, el crecimiento y la actina sin ningún tipo de óptica o requisitos especiales de excitación que no sea una fuente de luz fluorescente. Además, espectralmente diferentes, las proteínas de la etiqueta fluorescente, por ejemplo, las buenas prácticas agrarias y de las proteínas dsRed con etiquetas, se puede visualizar al mismo tiempo cerca de caracterizar el transporte co-u otros eventos celulares coordinada. El enfoque de imagen se describe aquí es flexible para una variedad de aplicaciones de imagen y pueden ser adoptadas por un laboratorio de un costo relativamente bajo un microscopio siempre está disponible.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons at JoVE.com

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Imágenes de células vivas es de particular utilidad en el estudio de la dinámica del tráfico de orgánulos. A continuación se describe un protocolo para obtener imágenes en vivo de alta densidad de núcleo vesículas en las neuronas cultivadas con amplio campo de la microscopía de fluorescencia. Este protocolo es flexible y puede adaptarse a los orgánulos de imagen como las mitocondrias, endosomas, y peroxisomas.

Imágenes en vivo del denso núcleo de vesículas en la Primaria neuronas del hipocampo cultivadas

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

live-imaging-dense-core-vesicles-primary-cultured-hippocampal

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K vistas.  Simon Fraser University. Imágenes de células vivas es de particular utilidad en el estudio de la dinámica del tráfico de orgánulos. A continuación se describe un protocolo para obtener imágenes en vivo de alta densidad de núcleo vesículas en las neuronas cultivadas con amplio campo de la microscopía de fluorescencia. Este protocolo es flexible y puede adaptarse a los orgánulos de imagen como las mitocondrias, endosomas, y peroxisomas.

Video: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

Gene-gun Transfección de las neuronas del hipocampo

Investigación

Biología

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and memory. Primary hippocampal cell culturing allows neuroscientists to examine the activity and properties of neurons at the individual cell and single synapse level. In this video, we will demonstrate how to isolate and grow primary hippocampal cells from newborn rats. The hippocampus may be isolated from each newborn animal in as short as 2 to 3 minutes, and the cultures can be maintained for up to two weeks. We will also briefly demonstrate how to use these hippocampal neurons for ratiometric calcium imaging. While this protocol describes the process for the hippocampus, with little to no modification, it can be applied to other regions of the brain.

The dissection and growth of cells from an individual brain area facilitates investigation of cellular and physiological parameters. We describe a method for primary cell culturing that produces neuron-enriched cultures in a serum-free environment.

Cultivo primario de neuronas del hipocampo de ratas recién nacidas P0

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

Mediada por adenovirus eliminación de moléculas de señalización genética en cultivos de fibroblastos de embriones de ratón primaria

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D de imágenes de la agregación de proteínas en células vivas

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

Orgánulos Transporte en Cultivadas<em&gt; Drosophila</em&gt; Celdas: S2 Línea Celular y neuronas primarias.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

Visualización de G3BP estrés gránulos Dinámica en Pilas en directo

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single procedure. Due to advances in microscope technology it is relatively easy to capture live cell images for the purpose of investigating cellular events in real time with minimal concern regarding phototoxicity to the cells. This protocol describes how to take live cell timelapse images of primary rat neonatal cardiomyocytes using a confocal spinning disk microscope following lentiviral and adenoviral transduction to modulate properties of the cell. The application of two different types of viruses makes it easier to achieve an appropriate transduction rate and expression levels for two different genes. Well focused live cell images can be obtained using the microscope&#8217;s autofocus system, which maintains stable focus for long time periods. Applying this method, the functions of exogenously engineered proteins expressed in cultured primary cells can be analyzed. Additionally, this system can be used to examine the functions of genes through the use of siRNAs as well as of chemical modulators.

This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.

Imágenes de células vivas de primarias de rata neonatal cardiomiocitos Siguiendo Adenoviral y lentiviral transducción Usando Confocal Spinning disco Microscopía

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...