Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones 2 R15 GM061539-02 (a BAS), 2 R15 NS40425-03 (a JEL), MH 66179 (con el Dr. Gary Banquero de la Oregon Health &amp; Science University / OHSU) y P30 NS061800 (Dr. Sue Aicher de OHSU). Damos las gracias a Barbara Smoody para una amplia compatibilidad con la cultura de las neuronas del hipocampo, y los Dres. Brian Long y James Abney para una lectura crítica de este manuscrito.

1. Preparación de la muestra <ol><li> Preparar ADN que codifica una quimera fotoconvertible o fotoactivable dirigido a DCVs, usando técnicas de biología molecular convencionales. Nota: Una posibilidad es ADN que codifica un activador tisular del plasminógeno-Dendra2 quimera (tPA-Dendra2). Dendra2 es una proteína fotoconvertible que cambia de verde a roja de emisión tras la exposición a la luz ultravioleta 12. </li><li> Las neuronas del hipocampo Cultura en alto rendimiento # 1.5 cubreobjetos de ~ 5-10 días, siguiendo protocolos estándar 13. </li><li> Transfectar el desarrollo de las neuronas del hipocampo usando un reactivo lípido catiónico. Nota: la infección mediada por virus es más eficaz para las neuronas maduras. Este enfoque alternativo ha sido descrito en detalle en otra parte 14. <ol><li> Preparar un tubo de 1,5 ml que contiene 1 ~ g de ADN y 250 l de medio mínimo esencial (MEM) y un segundo tubo de 1,5 ml que contiene 4 l de reactivo lípido catiónico y 250 ldel MEM. </li><li> Incubar las soluciones durante 5 min. </li><li> Combinar las dos soluciones y se incuba la mezcla resultante durante 30 minutos adicionales. </li><li> Durante la incubación, preparar un plato que contiene varios ml de medio de cultivo se calentó hasta 37 º C. </li><li> Transferir suavemente cubreobjetos que contienen las neuronas para el plato que contiene medio de tibia y agregue la mezcla de transfección. </li><li> Incline el plato suavemente y luego se coloca en una incubadora a 37 ° C durante 90 min. </li><li> Neuronas volver a su &quot;plato de casa&quot; y esperar unos 12 a 18 h. </li></ol></li><li> Fijar las células durante 45 min en paraformaldehído al 4% / 4% de sacarosa en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) se calentó a 37 ° C. Nota: En los experimentos de palma, es importante para lograr una buena conservación de la ultraestructura, y los protocolos de fijación de formaldehído estándar utilizados para la tinción de inmunofluorescencia típicamente no son suficientes 15. Una razón importante para la mala conservación estructural es insuficiente ftiempo ixation porque la fijación de formaldehído implica la formación de aductos y la reticulación de proteínas, y el último proceso es bastante lento 16. Un 45 min de fijación ayuda a mitigar este problema sin pérdida inducida overfixation-detectable de la fluorescencia. </li><li> Lave la funda se desliza ~ 10 veces con PBS filtrada. Nota: Esto reduce los contaminantes fluorescentes. Muestras de la imagen de forma relativamente rápida después de la fijación. En las células intermedias se almacenan a 4 ° C en PBS filtrada en un recipiente a prueba de luz. </li><li> Cubreobjetos de montaje que contienen las neuronas en una cámara en PBS filtrada. Nota: La muestra se debe montar en un medio acuoso, como PBS, con índice de refracción menor que el del vidrio, para poner en práctica la reflexión interna total de fluorescencia (TIRF) basado en la iluminación. Iluminación basada en TIRF es muy útil porque sólo fluoróforos de deslizamiento proximal de la cubierta se excitan, y hay una gran caída asociado en la fluorescencia de fondo 17. </li></ol> 2. Adquisición de imágenes &lt;/ P&gt; <ol><li> Encienda el sistema de imágenes de super-resolución. <ol><li> Encienda la lámpara de arco. </li><li> Da la vuelta al &quot;sistema / PC&quot; y cambia &quot;componentes&quot; (en el interruptor remoto de potencia) en &quot;on&quot;. </li><li> Encienda el ordenador (después de la estación de la tableta / el acoplamiento de control del microscopio se enciende). Nota: La estación base se puede utilizar para controlar y supervisar muchos atributos de la óptica y trayectoria de la luz, en particular la elección del objetivo y el enfoque. </li><li> Haga doble clic en el icono del programa y elegir la opción &quot;sistema de arranque&quot; en el diálogo de inicio de sesión. </li></ol></li><li> Examine la muestra. <ol><li> Abra la parte frontal y los paneles de acceso superior en el gabinete de seguridad del láser. </li><li> Incline el brazo de luz transmitida para acceder a la etapa y los objetivos. </li><li> Poner aceite en la alfa Plan-Apochromat 100X apertura numérica / NC = 1,46 (TIRF) objetivo. Nota: Un objetivo 63X de alta NA se puede utilizar en lugar de la 100X. </li><li> Montar la muestra en el escenario, y elevar ªe objetivo hacia la muestra. </li><li> Vigilar la posición de la lente usando la función XYZ de la estación de acoplamiento. Pare cuando el objetivo se encuentra en el estadio de béisbol de enfoque (por ejemplo, z ~ 2.50 mm). </li><li> Cerrar completamente los paneles de acceso. Nota: Para activar la seguridad del láser. </li><li> Afinar el enfoque utilizando los oculares y los botones de la ficha de localizar. Nota: La pestaña localizar proporciona acceso a los botones que producen la iluminación basado en lámpara de arco y facilita la observación directa de la muestra con los oculares. Del mismo modo, la pestaña adquisición proporciona acceso a las herramientas que producen la iluminación basado en láser y facilita la captura de imágenes por la cámara. <ol><li> Vaya a la pestaña de localizar, elegir la opción &quot;Trans On.&quot; </li><li> Haga clic en el símbolo de la expansión ocular. Nota: Esto nos lleva a un esquema de la trayectoria de la luz. Atribuciones de la trayectoria de la luz se pueden modificar haciendo clic izquierdo iconos correspondientes en el esquema o mediante el uso de la pantalla táctil en la estación de acoplamiento. Por ejemplo, un filtroAdecuado para ver emisiones de Dendra2 puede ser elegido mediante el icono revólver reflector. </li><li> Mire por los oculares, y llevar a las células en el enfoque utilizando la estación de acoplamiento como guía. Nota: La muestra será muy poco poblada con células fluorescentes debido a las neuronas del hipocampo son difíciles de transfectar, y por lo tanto puede ser un poco difícil enfocar con la iluminación reflejada. Si este es el caso, utilice iluminación transmitida y la lectura z de la estación de acoplamiento como guía. </li><li> Cambia la luz &quot;Off&quot; después de enfocar. </li></ol></li></ol></li><li> Identificar una célula que es bastante brillante, exhibe fluorescencia punteada, y tiene una morfología clásica que es indicativo de la buena salud. <ol><li> Elija la luz reflejada y la adecuada filtro para visualizar la emisión verde de Dendra2. </li><li> Busque en la hoja de la cubierta para las células que expresan quimeras Dendra2 usando luz de excitación de baja intensidad. </li></ol></li><li> Cambie a la ACQpestaña uisition. <ol><li> Utilice la opción &quot;gerente experimento&quot; para cargar una configuración adquisición PALMA que está diseñado apropiadamente o modificarse fácilmente. Nota: Si no existe tal experimento, el diseño de una configuración experimental empezando con la siguiente configuración como guía: deslizadores potencia del láser: 405 nm (~ 0,01% para un láser mW 50); 488 nm (~ 3% para un láser de 100 mW); 561 nm (~ 40% para un láser de 100 mW); Tiempo de exposición: ~ 50 ms; Ganancia de la cámara: ~ 200; Adquisición Multidimensional: series de tiempo (ciclos = 30.000, intervalo = 0); Pistas: 488 nm con epi-iluminación, y 561 nm con una iluminación a base de TIRF (ver paso 2.5.1); Objetivo: 100X (NA = 1,46); Deslizador ángulo TIRF: ángulo de incidencia ~ 67-72 °; Pixel Tamaño: 100 nm; Campo de visión: TIRF (las opciones alternativas producen intensidades de láser más altos y se utilizan para fluoróforos que son más difíciles de blanquear). </li><li> Haz clic en &quot;Sí&quot; cuando aparezca un menú emergente con una consulta sobre el cambio en los láseres. </li></ol></li><li> Traiga la imagende la célula en el foco en el plano de la cámara. <ol><li> Elija la pista láser epi-iluminación 488 nm. Nota: Las pistas son configuraciones de haz utilizados durante la exploración. Aquí, nombres de las pistas están determinadas por la longitud de onda de excitación que produce la emisión que se pasa a la cámara. Por ejemplo, la pista de 561 nm utiliza tanto el 405 y 561 líneas de láser nm, pero el cubo de filtro pasa única emisión de photoconverted Dendra2 excitado por 561 nm de luz a la cámara. </li><li> Enfoque la imagen de la célula de la cámara con el botón de la adquisición de &quot;continuo&quot;. </li></ol></li><li> Se recoge una imagen de campo amplio convencional. <ol><li> Utilice el botón &quot;Snap&quot;. </li><li> Guardar la imagen, vaya al menú &quot;Archivo&quot; y seleccionando &quot;Guardar / Guardar como.&quot; </li></ol></li><li> Configurar la iluminación basada en TIRF. <ol><li> Elija la pista 488 y cambiar a &quot;TIRF&quot; utilizando el botón EPI / TIRF. </li><li> Elija adquisición &quot;continuo&quot;. </li><li> Ajuste tque TIRF-basado deslizador iluminación. Nota: TIRF se logra cuando hay un repentino oscurecimiento de fondo y la muestra se puede enfocar en un plano 18. Si nuevas características se ponen de manifiesto a través de enfoque hasta dentro de la muestra, el ángulo de incidencia es demasiado baja porque en TIRF sólo hay un plano de enfoque. </li><li> Vuelva a comprobar el ángulo TIRF usando la pista 561 con el láser de 405 nm &quot;off&quot;. </li><li> Gire el láser 405 nm de nuevo &quot;on&quot; antes de iniciar un experimento PALMA. </li></ol></li><li> Recopilar datos de palma. <ol><li> Haga clic en &quot;iniciar el experimento.&quot; Nota: Si lo desea, abra la pestaña &quot;opciones de procesamiento en línea&quot;, y marca &quot;PALMA línea de procesamiento&quot; y &quot;Fit gauss2D&quot; (antes de comenzar el experimento) para monitorizar la imagen PALMA reconstruida durante la recolección de datos en bruto. Esto facilitará la evaluación de la calidad de los datos y por lo tanto el valor de continuar el proceso de recopilación de datos relativamente mucho tiempo. </li><li> Visualmentemonitorear fotoconversión. </li><li> Aumentar la intensidad del láser de 405 nm (photoconverting) cuando disminuye fotoconversión Dendra2 (por lo general después de la adquisición de ~ 10,000 imágenes en bruto). </li><li> Continuar el experimento si los aumentos fotoconversión. De lo contrario, deje el experimento (sin pérdida de datos) pulsando el botón de paso actual &quot;stop&quot;. </li><li> Guarde las imágenes en la recogida de datos se ha completado (después de ~ 15 min). </li></ol></li></ol> 3. Procesamiento de imágenes, visualización y análisis <ol><li> En ausencia de tratamiento, procesa imágenes RAW en línea que se han guardado en el disco. <ol><li> Haga clic en la ficha Control, abra la ficha de método y seleccione &quot;Palm&quot;. </li><li> Elija &quot;PALMA&quot; de nuevo a partir de los cuatro sub-opciones. </li><li> Ir al menú de archivo, abrir y ver el archivo de su interés, y pulsa &quot;seleccionar&quot;. </li><li> Haga clic en &quot;Aplicar&quot;. Nota: Esto iniciará pico / pico hallazgo fluoróforo y localización con opti defectoons. Si es necesario, los picos también se pueden agrupar mediante la ficha &quot;PAL-Group&quot;. Agrupación asigna picos que aparecen en varias tramas consecutivas a una sola molécula de si las coordenadas de pico son suficientemente similares. Además, los datos se pueden corregir para la deriva de la muestra usando la opción de alineación deriva basado en modelo de software. </li></ol></li><li> Filtrar los componentes mal localizados y mal comprendidas en la muestra de datos pico-localizada. <ol><li> Deseche fluoróforos con precisiones de localización, σ,&gt; 35 nm con la función &quot;PAL-filtro&quot;. </li><li> Deseche fluoróforos en las zonas donde la distancia media entre picos, d, es demasiado grande para resolver las vesículas de diámetro, D. <ol><li> Extraer la precisión de localización media, σ, a partir del histograma de precisión de localización. </li><li> Calcula un valor máximo aceptable para d basado en σ, y la criteron Shannon-Nyquist 19, que se recoge en la resolución de aproximación 20 R = D =[(2.35σ) 2 + (2d) 2] 1/2. </li><li> Establecer el umbral de la función &quot;Eliminar valores atípicos PALM&quot; para eliminar picos rodeados de menos de πD 2 / (4d 2) vecinos dentro de un círculo de radio D / 2. </li></ol></li><li> Convertir los datos PALMA procesado una imagen de la palma con la función &quot;PAL-Rendering&quot; en; vea la Figura 1. </li><li> Cuantificar tamaños y separaciones seleccionando la función &quot;Perfil&quot;. <ol><li> Compruebe la línea asociada y opciones de tabla, y trace una línea a lo largo de la dirección deseada en la imagen. </li><li> Cuantificar diámetros determinando anchos llenos a la mitad la intensidad máxima. </li><li> Cuantificar las separaciones mediante la determinación de pico a pico de separaciones de perfiles de intensidad. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

PALMA y técnicas de microscopía de fluorescencia de super-resolución relacionados han surgido recientemente como un valioso complemento de las formas más establecidas de la microscopía óptica y microscopía electrónica (EM) 22-24. Los atributos positivos de la palma incluyen la preparación de muestras relativamente simple y mínima perturbación de la muestra. En principio, Palm también se puede utilizar para estudiar las células de vida. Probablemente el principal atributo negativo de palma es la a...

Un número de procesos celulares dependen de tráfico de vesículas mediada precisa y eficiente de biomoléculas a destinos subcelulares específicos. Un ejemplo destacado es la asamblea sináptica, que está precedida por oscilado largo la entrega, mediada por vesículas sinápticas de los constituyentes de los sitios de la biogénesis del soma neuronal potencialmente distales sitios pre y postsinápticos 1. La microscopia de fluorescencia es un método poderoso y popular de estudiar el tráfico de vesículas. Fortalezas de la técnica son su sensibilidad, especificidad, y la compatibilidad con imágenes en vivo 2. Por desgracia, hasta hace relativamente poco, la técnica ha sufrido de una gran debilidad, la resolución de difracción limitada 2, lo que dificulta los estudios de estructuras con dimensiones menores que ~ 250 nm. Recientemente, la resolución lateral en microscopía de fluorescencia superó la barrera de difracción con la introducción de super-resolución de fluorescencia millastécnicas de microscopía, como la palma 3. La resolución lateral de PALMA, decenas de nanómetros, es ideal para el estudio de las vesículas, que tienen dimensiones que suelen oscilar entre ~ 50-250 nm 4. Por lo tanto, es ahora posible usar la fluorescencia, con sus puntos fuertes miríada, para aclarar un espectro de atributos previamente inaccesibles de vesículas, incluyendo algunos aspectos de su tráfico a sitios subcelulares específicos. PALMA no es trivial de implementar, y estrategias de éxito a menudo se debe adaptar al tipo de sistema en estudio. Aquí se describe cómo implementar estudios de palma de estructuras vesiculares, y se demuestra la eficacia de nuestro enfoque para el caso de DCVs en las neuronas del hipocampo. En particular, utilizamos PALMA hacer frente a la hipótesis de que la trata de DCVs de sinapsis en las neuronas del hipocampo está mediada por grupos DCV 5-8. Tráfico Cluster mediada por vesículas de las sinapsis en el desarrollo de neurons es una posibilidad intrigante, ya que puede facilitar la estabilización sináptica rápida y montaje de 9,10. Los defensores de la trata agrupada de DCVs citan el gran tamaño aparente de puntos lagrimales fluorescente extrasynaptic albergar carga DCV exógena como la evidencia que soporta clustering 6. Sin embargo, estos puntos lagrimales aparecen en las imágenes generadas usando técnicas de microscopía de fluorescencia de difracción limitada, que no se adaptan a efectos de tamaño distintivas derivados de difracción de los derivados de la agrupación. Para resolver este problema, hemos recogido la fluorescencia de campo amplio convencional y las imágenes palma de las neuronas del hipocampo expresan quimeras dirigidos a DCVs. El análisis de estas imágenes reveló que&gt; 92% de los racimos DCV extrasinápticos putativos en imágenes convencionales se resuelven como 80 nm (DCV tamaño individual) 11 puntos lagrimales en imágenes PALMA. Por lo tanto, estos datos invalidan en gran medida la hipótesis de la agrupación como se aplica a DCVs en el desarrollo de hippocaneuronas Mpal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1105">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Zeiss PALM</td>
			<td style="width:169px;">Carl Zeiss, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Elyra PS.1</td>
			<td style="width:572px;">With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:245px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:169px;">Life Technoligies</td>
			<td style="width:119px;">11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Minimum Essential Medium</td>
			<td style="width:169px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:169px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:169px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">19208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sucrose</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S-8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">growth glass coverslips 18mm 1.5D</td>
			<td style="width:169px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC0059095</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of neuronal dense-core vesicles

<html> La detección de la fluorescencia proporciona la base para muchas de las técnicas de microscopía ampliamente utilizados y rápido avance de empleados en las aplicaciones biológicas y médicas modernas. Fortalezas de la fluorescencia son su sensibilidad, especificidad, y la compatibilidad con imágenes en vivo. Desafortunadamente, las formas convencionales de microscopía de fluorescencia sufren de una debilidad importante, la resolución de difracción limitada en el plano de la imagen, lo que dificulta los estudios de estructuras con dimensiones menores que ~ 250 nm. Recientemente, esta limitación ha sido superada con la introducción de técnicas de microscopía de fluorescencia de super-resolución, como la microscopía de localización fotoactivado (PALM). A diferencia de sus contrapartes convencionales, PALM puede producir imágenes con una resolución lateral de decenas de nanómetros. Por lo tanto, es ahora posible usar la fluorescencia, con sus puntos fuertes miríada, para aclarar un espectro de atributos previamente inaccesibles de estructura celular y organización. _content &quot;&gt; Lamentablemente, PALM no es trivial de implementar, y estrategias de éxito a menudo se debe adaptar al tipo de sistema en estudio. En este artículo, mostramos cómo implementar estudios PALM solo color de estructuras vesiculares en neuronas cultivadas, fijos. PALMA es ideal para el estudio de las vesículas, que tienen dimensiones que suelen oscilar entre ~ 50-250 nm. Pasos clave en nuestro enfoque de incluir el etiquetado de las neuronas con fotoconvertible (verde a rojo) quimeras de la carga de la vesícula, la recogida de imágenes en bruto escasamente muestreados con un sistema de microscopia de super-resolución, y el procesamiento de las imágenes en bruto para producir una imagen de alta resolución PALMA. También demuestran la eficacia de nuestro enfoque mediante la presentación de imágenes excepcionalmente bien resueltas de vesículas de núcleo denso (DCVS) en las neuronas del hipocampo en cultivo, lo que refuta la hipótesis de que la trata de extrasynaptic DCVs está mediada en gran parte por grupos DCV.

La figura 1 muestra un producto final de formación de imágenes y el procesamiento. En esta imagen PALMA, coordenadas laterales de fluoróforos localizados se muestran utilizando el modo de visualización centroide, y la imagen de super-resolución del DCV asociados se muestra usando el modo de visualización de Gauss. Figura 2A muestra widefield análoga e imágenes palma de la soma y los procesos proximales de un niño de ocho días en las neuron...

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Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Se describe cómo implementar la localización microscopía fotoactivado (PALM) basado en estudios de vesículas en las neuronas cultivadas, fijos. Los componentes clave de nuestro protocolo de etiquetado incluyen vesículas con quimeras fotoconvertible, recogiendo imágenes crudas escasamente muestreados con un sistema de microscopia de super-resolución, y el procesamiento de las imágenes en bruto para producir una imagen de super-resolución.

Super-resolución de imagen de Neuronales vesículas de núcleo denso

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

super-resolution-imaging-of-neuronal-dense-core-vesicles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.6K vistas.  Lewis & Clark College.  Se describe cómo implementar la localización microscopía fotoactivado (PALM) basado en estudios de vesículas en las neuronas cultivadas, fijos. Los componentes clave de nuestro protocolo de etiquetado incluyen vesículas con quimeras fotoconvertible, recogiendo imágenes crudas escasamente muestreados con un sistema de microscopia de super-resolución, y el procesamiento de las imágenes en bruto para producir una imagen de super-resolución. 

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In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Investigación

Neurociencias

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

En vivo de imágenes de Dauer-específica neuronal Remodelación en C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

La incubación prolongado de aguda neuronal de tejidos para la Sección de Electrofisiología y calcio de imágenes

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

Analizando dendríticas morfología en las columnas y capas

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and neurodegenerative disease across species. Although these neurotoxic challenges have long been considered to be cell-intrinsic, considerable evidence now supports that misfolded human disease proteins originating in one neuron can appear in neighboring cells, a phenomenon proposed to promote pathology spread in human neurodegenerative disease.
C. elegans adult neurons that express aggregating proteins can extrude large (~4 &#181;m) membrane-surrounded vesicles that can include the aggregated protein, mitochondria, and lysosomes. These large vesicles are called &#8220;exophers&#8221; and are distinct from exosomes (which are about 100x smaller and have different biogenesis). Throwing out cellular debris in exophers may occur by a conserved mechanism that constitutes a fundamental, but formerly unrecognized, branch of neuronal proteostasis and mitochondrial quality control, relevant to processes by which aggregates spread in human neurodegenerative diseases.
While exophers have been mostly studied in animals that express high copy transgenic mCherry within touch neurons, these protocols are equally useful in the study of exophergenesis using fluorescently tagged organelles or other proteins of interest in various classes of neurons.
Described here are the physical features of C. elegans exophers, strategies for their detection, identification criteria, optimal timing for quantitation, and animal growth protocols that control for stresses that can modulate exopher production levels. Together, details of protocols outlined here should serve to establish a standard for quantitative analysis of exophers across laboratories. This document seeks to serve as a resource in the field for laboratories seeking to elaborate molecular mechanisms by which exophers are produced and by which exophers are reacted to by neighboring and distant cells.

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

This protocol describes approaches for detection and quantitation of large aggregate and/or organelle extrusions (~4 &#181;m) produced by C. elegans cells in the form of membrane-bound exophers. We describe strains, growth conditions, scoring criteria, timing, and microscopy considerations needed to facilitate dissection of this debris expulsion mechanism.

Enfoques cuantitativos para la puntuación in vivo de la extrusión de agregados neuronales y organelle en vesículas de exoféro grandes en C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. Imaging studies are widely used to investigate their function and plasticity in physiological and pathological conditions. Because of their size and structure, localization studies of proteins require high-resolution imaging techniques. In this protocol, we describe a procedure to study in primary neurons the co-localization of target proteins with synaptic markers at a super-resolution level using structured illumination microscopy (SIM). SIM is a patterned-light illumination technique that doubles the spatial resolution of wide-field microscopy, reaching a detail of around 100 nm. The protocol indicates the required controls and settings for robust co-localization studies and an overview of the statistical methods to analyze the imaging data properly.

This protocol shows how to employ super-resolution microscopy to study protein co-localization in primary neuronal cultures.

Imágenes de Superresoridad para estudiar la co-localización de proteínas y marcadores sinápticos en neuronas primarias

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

Preparación de Drosophila melanogaster adulto para imágenes cerebrales completas durante las respuestas de comportamiento y estímulos

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the different ROS, hydrogen peroxide (H2O2) is best characterized with respect to roles in cellular signaling. H2O2 has been implicated during the development in several species. For example, a transient increase in H2O2 has been detected in zebrafish embryos during the first days following fertilization. Furthermore, depleting an important cellular H2O2 source, NADPH oxidase (NOX), impairs nervous system development such as the differentiation, axonal growth, and guidance of retinal ganglion cells (RGCs) both in&#160;vivo and in vitro. Here, we describe a method for imaging intracellular H2O2 levels in cultured zebrafish neurons and whole larvae during development using the genetically encoded H2O2-specific biosensor, roGFP2-Orp1. This probe can be transiently or stably expressed in zebrafish larvae. Furthermore, the ratiometric readout diminishes the probability of detecting artifacts due to differential gene expression or volume effects. First, we demonstrate how to isolate and culture RGCs derived from zebrafish embryos that transiently express roGFP2-Orp1. Then, we use whole larvae to monitor H2O2 levels at the tissue level. The sensor has been validated by the addition of H2O2. Additionally, this methodology could be used to measure H2O2 levels in specific cell types and tissues by generating transgenic animals with tissue-specific biosensor expression. As zebrafish facilitate genetic and developmental manipulations, the approach demonstrated here could serve as a pipeline to test the role of H2O2 during neuronal and general embryonic development in vertebrates.

This protocol describes the use of a genetically encoded hydrogen peroxide (H2O2)-biosensor in cultured zebrafish neurons and larvae for assessing the physiological signaling roles of H2O2 during nervous system development. It can be applied to different cell types and modified with experimental treatments to study reactive oxygen species (ROS) in general development.

Ros imágenes de células vivas durante el desarrollo neuronal

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.