Name: low-density primary hippocampal neuron culture
Uploaded: 2017-04-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 46 s
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Este trabajo fue apoyado por CIHR RP-142209 a TJS.

Todos los experimentos y protocolos que utilizan animales de laboratorio fueron aprobados por el comité de ética animal de la Universidad de Manitoba y se ajustaban a las directrices del Consejo Canadiense de los Animales. 1. Preparación de instrumentos, tampones y soluciones <ol><li> Esterilizar en autoclave todos los equipos de la disección, pipetas Pasteur de vidrio, puntas de pipeta, aparato de filtro, y agua desionizada. </li><li> Preparar un 20% (w / v; 1,1 M) solución madre de glucosa en agua desionizada y se filtro a esterilizar. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Preparar una solución de piruvato de sodio 100 mM en agua desionizada y el filtro a esterilizar. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Preparar solución salina equilibrada de calcio y de magnesio libre Hank (CMF-HBSS) haciendo una solución de 10% HBSS (10x), HEPES 10 mM, y 100 U / ml de penicilina-estreptomicina en agua desionizada. Almacenar a 4 ° C durante no más de 1 a 2 meses. </li><li> Preparar 10 mg / ml de desoxirribonucleasa I (ADNasa) en CMF-HBSS,y luego filtrar-esterilizar y almacenar a -20 ° C. </li><li> Preparar medio glial haciendo una solución de glucosa 30 mM (a partir de la solución estéril), 95 U / ml de penicilina-estreptomicina, y 10-15% de suero de crecimiento bovina (BGS) en medio esencial mínimo (MEM). NOTA: Como se indica en el protocolo, una solución de 5% BGS se puede utilizar si es necesario para frenar la proliferación celular. Suero de Caballo se puede utilizar en lugar de BGS, pero tenga en cuenta que cada lote debe ser probado antes de su uso debido a la variación inter-lote. Almacenar la solución preparada a 4 ° C durante no más de 1 a 2 meses. Aunque muchos laboratorios utilizan FBS, se observó consistentemente que el crecimiento glial en BGS es tan robusto como en FBS. BGS se deriva de suero de ternera fetal que se complementa con componentes químicamente definidos. Además, BGS es sustancialmente más económico que FBS. </li><li> Preparar el crecimiento de neuronas y medio de mantenimiento (neurobasal-B27, NBG) haciendo una solución de 1x B27 suplemento y 0,5 mM de L-glutamina en 500 ml de Neurobasal Medium. Almacenar a 4 ° C durante no más de 1 a 2 meses. L-glutamina puede estar sustituido con GlutaMAX, que ha sido sugerido para ser más estable en el medio de crecimiento. </li><li> Preparar la neurona medio de siembra al hacer una solución de glucosa 30 mM (a partir de la solución estéril), piruvato de sodio 1 mM (a partir de la solución estéril), y 10% BGS en MEM. Almacenar a 4 ° C durante no más de 1 a 2 meses. </li><li> Preparar una solución de citarabina 1 mM (Ara-C) y el filtro a esterilizar. Alícuota en porciones de 1 ml y almacenar a -20 ° C. </li><li> Preparar una solución de mM APV 100 en NaOH esterilizada-filtro de 100 mN. Almacenar a -20 ° C. </li><li> Disolver 1 mg / ml de poli-L-lisina en tampón de borato, pH 8,5 (50 mM de ácido bórico y bórax 12 mM) y el filtro a esterilizar. Alícuota y almacenar a -20 ° C. En lugar de poli-L-lisina, se puede usar poli-L-ornitina que puede ser menos tóxico para las células. </li></ol> 2. Glia Cultura Preparación <ol><li> Preparar cultivo celular astroglia cortical <ol><li&gt; Obtener crías de rata dentro de las 24 horas siguientes al nacimiento. Coloque los cachorros en el hielo para anestesiar a ellos. </li><li> Pulverizar las crías con 70% de etanol y decapitar a ellos. </li><li> Colocar las cabezas en un plato de 100 mm en el hielo que contiene 15 ml CMF-HBSS. </li><li> Diseccionar cada cerebro cortando el cuero cabelludo, abrir el cráneo, cortando el tronco cerebral, y luego transferir el cerebro a 60 mm placas de Petri en el hielo que contenía 3 ml CMF-HBSS. </li><li> Separar los hemisferios cerebrales del hipocampo y luego tira lejos las meninges que rodean ellos. Ejercer precaución adecuada para asegurar la contaminación mínima a partir de fibroblastos meníngeos. fibroblastos meníngeos en la cultura puede competir con la glía para el crecimiento y ser perjudiciales para la salud de las neuronas. Recoge todas las hemisferios cerebrales en un 60 mm placa de Petri en el hielo que contiene 5 ml CMF-HBSS. </li><li> Eliminar la CMF-HBSS y luego picar el tejido cortical recogido tan finamente como sea posible usando resorte-tijeras-micro disección. </li><li> Añadir suficiente CMF-HBSS para la chuletatejido ped. Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio, transferir las piezas de tejido a un tubo de 15 ml. Llevar el volumen total a 12 ml mediante la adición de CMF-HBSS. </li><li> Añadir 1,5 ml de cada uno de 2,5% de tripsina y 10 mg / ml de solución de DNasa. Incubar la mezcla resultante a 37 ° C en un baño de agua durante 12 min. </li><li> Se tritura el tejido 10-15 veces usando una pipeta Pasteur de vidrio, y más en incubar en un baño de agua a 37 ° durante 3 min. </li><li> Filtrar el sobrenadante a través de papel de la lente o de una malla de filtro en un tubo de 50 ml que contenía 5 ml de BGS. Esto se hace para eliminar trozos de tejido no disociado. Alternativamente, utilizar tamices de células disponibles comercialmente. </li><li> Añadir 13,5 ml de CMF-HBSS y 1,5 ml de 2,5% de tripsina al tubo que contiene las piezas de tejido restantes y además incubar a 37 ° C en un baño de agua durante 10 min adicionales. </li><li> Se tritura el tejido restante una vez más, y luego filtrar la suspensión de nuevo en el tubo de 50 ml que contiene el filtrado inicial. A continuación, enjuagar la lepapel ns con 3 ml de BGS. El volumen final debe ser de aproximadamente 38 ml. </li><li> Centrifugar la suspensión que contiene las células gliales disociadas durante 6 min a 130 x g. deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio. Asegúrese de que las células sedimentadas en el fondo no se vean perturbadas. La parte inferior de la pastilla aparece ligeramente rojizo que contienen componentes de la sangre. </li><li> Transferencia de las células gliales en 1 ml de medio glial en un tubo nuevo, teniendo cuidado de no perturbar la porción rojizo de la pastilla. </li><li> Añadir hasta 2 ml de medio glial por pup para resuspender el combinado disociarse células gliales. Por ejemplo, se utilizaron si 10 crías, y después el volumen total resuspensión fuera 20 ml. </li><li> Preparar matraz de cultivo de uno 75 cm 2 de células por cachorro. Añadir 18 ml de medio de glial pre-calentado a cada matraz. </li><li> Transferencia de 2 ml de suspensión celular a cada matraz y se incuban en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Después de un día, reemplazar con 20 ml glial medio. En esta etapa, el cultivo es una mezcla de glial y otros tipos de células no deseadas. </li><li> Cuatro días después de sembrar las células, agitar vigorosamente los matraces para desalojar las células no de astrocitos. Para ello, enjuagar los matraces una vez con CMF-HBSS, y luego añadir 10 ml fresco CMF-HBSS a cada matraz. Agitar vigorosamente los matraces de 5-10 veces, y luego aspirar fuera de la CMF-HBSS. Enjuague dos veces con CMF-HBSS y, a continuación añadir 20 ml de medio de glial. NOTA: Este paso es crucial para asegurar la eliminación de tipos de células no objetivo, y no debe dar lugar a la pérdida de los astrocitos deseados. </li><li> Reemplazar con medio glial fresco dos veces a la semana hasta que las células son confluentes (Figura 1). </li></ol></li><li> glía congelación <ol><li> Una vez que son confluentes las culturas, aspirar fuera el medio y lavar la monocapa de células con 10 ml de CMF-HBSS. </li><li> Añadir 10 ml de 0,25% de tripsina / EDTA a cada matraz y se incuba a 37 ° C durante 3 min. </li><li> matraces golpear suavemente para desalojar las células. Añadir 1 ml BGS to cada matraz y la transferencia de las suspensiones de células en tubos de 15 ml. </li><li> Centrifugar los tubos a 130 xg durante 6 min. Descartar el sobrenadante resultante. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 2 ml de medio de glial. </li><li> Preparar el medio de congelación glial (dimetilsulfóxido 1-parte y 4 partes BGS). Añadir 0,5 ml de esta solución a cada uno de 4 viales criogénicos por matraz. </li><li> Transferir 0,5 ml de suspensión celular a cada vial, y a continuación, congelar las células lentamente mediante la colocación de los viales en un recipiente aislado en un congelador C -80 ° durante la noche. Después de un día, la transferencia de los viales a un congelador de nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo. </li></ol></li><li> Chapado revivió glía <ol><li> glía Plate 1-2 semanas antes del día de la cultura de las neuronas. </li><li> Preparar un ml tubo 50 con 10 ml calentó medio glial. </li><li> Descongelar 1 vial congelado de la glía en un baño de agua a 37 ° durante 2-3 min. </li><li> Transferir el contenido del vial en el tubo de 50 ml que contiene 10 ml de medio de glial. </li><li> centrifuge el tubo durante 5 minutos a 130 xg y aspirar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el precipitado en 20 ml de medio de glial. </li><li> Añadir 3 ml de medio de glial fresco a cada una de las placas de cultivo (60 mm), y luego transferir 1 mL de la suspensión celular a cada plato. Incubar los cultivos en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Alimentar las células dos veces a la semana. Si la densidad celular alcanza% de confluencia 50 mucho antes de la cultura día neurona, cambiar a medio glial que contiene 5% BGS para ralentizar la tasa de crecimiento glial. La confluencia deseada de la monocapa glial para la cultura neurona es 50% - 70%. </li><li> Reemplazar el medio glial con medio NBG (6 ml / placa) 1-2 días antes de la cultura neurona. </li></ol></li></ol> 3. Coverslip Preparación <ol><li> Limpieza y Preparación de perlas de parafina <ol><li> Sumergir cubreobjetos en ácido nítrico concentrado (70% peso / peso; PRECAUCIÓN: altamente corrosivo) y someter a ultrasonidos ellos durante 30 min a temperatura ambiente. Otros laboratorios han found que es beneficioso para incubar los cubreobjetos en ácido nítrico al 70% en bastidores de cerámica durante 12-24 h a temperatura ambiente en su lugar. </li><li> desechar cuidadosamente el ácido nítrico en una campana de humos química designada de acuerdo a las directrices institucionales. Lavar los cubreobjetos 3-5 veces con agua desionizada. </li><li> Sumergir los cubreobjetos en agua desionizada y someter a ultrasonidos de nuevo durante 30 min (omitir si siguiendo el método alternativo). </li><li> Eliminar el agua desionizada y enjuagar los cubreobjetos otras tres veces. </li><li> Sumergir los cubreobjetos en 50 ml de agua desionizada y esterilizarlas en autoclave. Alternativamente, esterilizar los cubreobjetos a 225 ° C en un horno durante 6 h. Si se utiliza este enfoque alternativo, vaya al paso 3.1.9. </li><li> Una vez tratada en autoclave, transferir los cubreobjetos a una campana de flujo laminar estéril para los pasos siguientes. </li><li> Eliminar el agua desionizada y enjuague con 20-30 ml de etanol al 100%. </li><li> Añadir 20-30 ml de etanol al 100% y transferir los cubreobjetos y seetanol a una placa de Petri de 100 mm. </li><li> Use pinzas romas para transferir cubreobjetos de 60 mm placas de Petri, 4-5 cubreobjetos por placa, y luego permitir que se seque al aire apoyándose los cubreobjetos contra el borde del plato. Una vez que el etanol se ha evaporado, sentar las cubreobjetos plana en la superficie. </li><li> Transferir 10 g de parafina a una botella de vidrio resistente al calor adecuado. Derretir la parafina y mantenerla a aproximadamente 150-200 ° C sobre una placa caliente durante al menos 1 h. La temperatura ideal a la que la parafina se debe calentar puede tomar algunos ajustes. temperaturas no ideales puede conducir a la dificultad para producir el tamaño correcto de las perlas de parafina. El período de espera después de la fusión ayuda a asegurar una temperatura constante durante todo el líquido. </li><li> Sumergir una pipeta Pasteur en la parafina, y luego rápidamente tocarlo para tres puntos cerca del borde de cada cubreobjetos (cada punto es aproximadamente de 120 ° de separación). Las gotas se solidifican en perlas de aproximadamente 0,3-0,5 mm de alto y 1,0-2,0 mm de diameter y funcionará para proporcionar un espacio entre las neuronas en el cubreobjetos y la monocapa glial a continuación (Figura 2). </li><li> Esterilizar los platos bajo luz UV durante 30 min, y luego cubrir con papel de aluminio y se almacena a temperatura ambiente. cubreobjetos preparados pueden ser almacenados y utilizados hasta por un mes. perlas de parafina se debe permitir que se adhieran a los cubreobjetos durante al menos una semana antes de su uso. Esto evitará que la parafina se desprenda durante los pasos restantes del protocolo. </li></ol></li><li> Los cubreobjetos de recubrimiento con poli-L-lisina <ol><li> Obtener placas de Petri que contienen cubreobjetos previamente preparadas con las perlas de parafina. </li><li> Añadir 200! L de poli-L-lisina en tampón de borato a la superficie de cada cubreobjetos y dejar que la solución se asiente en los cubreobjetos durante la noche, cubierto, a temperatura ambiente. Escudo la misma superficie que aquella en la que están situadas las perlas de parafina. Tenga en cuenta que si se limpian adecuadamente, la poli-L-lisina debe propagarse fácilmentepara cubrir la superficie del cubreobjetos. </li><li> Después de un día, lavar los cubreobjetos dos veces por remojo en agua desionizada estéril para 2 h cada vez. Después del lavado final, reemplazar el agua con 4 ml de medio de chapado neuronal por plato. Tenga en cuenta que es importante que la superficie de los cubreobjetos no permitir que se seque después de haber sido revestido con poli-L-lisina. </li><li> Colocar las cápsulas que contienen cubreobjetos-en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. Los cubreobjetos recubiertos deben incubarse durante al menos 24 h antes de la cultura neurona. Esto se hace para preparar el medio para el cultivo de neuronas. </li></ol></li></ol> 4. La disección del hipocampo y neuronas Plating <ol><li> Obtener una rata preñada (día embrionario 18-19, medido desde el día del descubrimiento tapón vaginal) y la eutanasia por decapitación isoflurano anestesiados u otro método aprobado. </li><li> Pulverizar la parte inferior de la rata con 70% de etanol, y luego hacer una incisión de la región púbica throuf al extremo de la cavidad abdominal. Para evitar la contaminación, tener cuidado de cortar sólo a través de la piel en este paso. </li><li> Enjuagar los instrumentos de disección de nuevo con 70% de etanol, y luego se corta a través de la pared abdominal para exponer el útero. Retire los dos cuernos uterinos y colocarlos en un 100 mm placa de Petri estéril. </li><li> Realizar los pasos restantes en una campana de flujo laminar. Retire la membrana uterina que rodea a los fetos. Decapitar a ellos y colocar las cabezas en una placa de Petri de 100 mm que contiene 20 ml CMF-HBSS. </li><li> Diseccionar el cerebro e inmediatamente colocarlos en un 60 mm placa de Petri que contiene 2 ml CMF-HBSS en hielo. Recoger sólo 2-3 cerebros por placa para permitir espacio suficiente para el paso siguiente. </li><li> Bajo un microscopio de disección tira lejos las meninges de la línea media de los hemisferios cerebrales, y luego diseccionar los hipocampos y colocarlos en un 60 mm placa de Petri que contiene 4,5 ml CMF-HBSS. Tenga en cuenta que el hipocampo puede ser distinguido como una estruc forma de media lunatura en la superficie medial del hemisferio cortical, y es fácil de eliminar, ya que está bordeado lateralmente por un ventrículo. </li><li> Transferir el tejido del hipocampo recogido y CMF-HBSS a un tubo de 15 ml. Añadir 0,5 ml de 2,5% de tripsina, y luego se incuba a 37 ° C durante 10 min. La papaína se puede utilizar en lugar de la tripsina, ya que es más suave y puede aumentar el rendimiento. </li><li> eliminar suavemente la solución de tripsina por pipeta Pasteur, dejando el tejido del hipocampo no alterados en la parte inferior del tubo. </li><li> Lavar suavemente el tejido dos veces con 5 ml CMF-HBSS mientras que la incubación a 37 ° C durante 5 min. Después del segundo lavado, llevar el volumen total a al menos 5 ml mediante la adición de un volumen suficiente de CMF-HBSS al tejido. Si hay hipocampos de más de 10 crías, hasta 8 ml CMF-HBSS se puede añadir. </li><li> Preparar dos variantes de pipetas pulida al fuego para la disociación del tejido. La punta de una variante es del diámetro normal de la pipeta, pero con bordes smoothened pulida al fuego. La otra varihormiga es uno con el diámetro de la punta reducido a la mitad. Brevemente exponer la punta de una pipeta Pasteur de vidrio en diagonal a una fuente de llama, y ​​luego examinar las puntas de las pipetas. <ol><li> Repita este paso hasta que el borde de la punta había sido smoothened o el diámetro se ha reducido. Es importante practicar para encontrar el diámetro ideal para asegurar que el tejido se disocia para producir células individuales sin dañar estas células. </li></ol></li><li> Se tritura el tejido del hipocampo primero por cerca de 10 pases a través de una pipeta Pasteur de vidrio normal, de bordes lisos, y luego un adicional de 5 a 10 pases a través de la pipeta con el diámetro reducido. El objetivo es obtener una solución homogénea de células sin o con muy pocos grumos de tejido. </li><li> Determinar la densidad de células usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Típicamente, se obtienen 0,8 a 1,0 millones de células por pup cuando se combinan hipocampos de los dos hemisferios. </li><li> Transferir un volumen suficiente de la suspensión de células a platosque contiene cubreobjetos de poli-L-lisina en 4 ml medio de siembra para obtener una densidad de placas de 300.000 células por placa de 60 mm. La densidad de las células puede variar de 100.000 a 500.000, dependiendo del experimento previsto. </li><li> Después de 3-4 h, transferir los cubreobjetos con las neuronas unidos a platos que contienen células gliales en medio NBG. Esto debe hacerse de tal manera que el lado en el que se sembraron las neuronas se enfrenta hacia abajo hacia la capa de células glial. Añadir un total de 4-5 cubreobjetos por placa de células gliales. </li><li> Dos o tres días después de la siembra, añadir la solución de Ara-C a una concentración final de 5 mM por placa para detener el crecimiento glial. </li><li> Alimentar a las células una vez a la semana mediante la sustitución de 2 ml de la vieja medio con 2,5 ml de medio fresco en cada alimentación. El medio extra añadido es para compensar la evaporación con el tiempo, y sólo una parte del medio se cambia para garantizar acondicionado coherente del medio por las células gliales. Estos cultivos son típicamente sanos durante al menos un mes (La Figura 3). la supervivencia neuronal se puede mejorar mediante la adición de APV al medio de cultivo a una concentración final de 100? M. APV es un antagonista del receptor NMDA y promueve la supervivencia mediante la reducción de la excitotoxicidad del glutamato. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Mientras que el método &quot;sandwich&quot; de las neuronas que el cultivo haya sido bien descrito en otras partes 2, 11, hay varios pasos a lo largo del protocolo que son muy difíciles de describir en texto por sí solo, que puede conducir a la frustración para los investigadores que desean adoptarlo. El método se puede dividir en tres grandes flujos de trabajo: cultura glial, preparación cubreobjetos y cultivo de neuronas y de...

El cerebro está organizado en intrincadas redes de neuronas. La contribución de las neuronas individuales a la actividad de red y la función cerebral puede ser estudiada por la alteración selectiva de su composición molecular y perturbación de sus propiedades fisiológicas. La manipulación genética y química de las neuronas individuales es posiblemente más fácil en neuronas cultivadas que en el tejido del cerebro intacto, sin el estorbo de la heterogeneidad y complejidad celular de este último. Las neuronas en cultivo desarrollan axonal bien definido y cenadores dendríticas y forman extensas conexiones sinápticas entre sí. Mientras que la cultura de las neuronas de animales adultos o de otras regiones del sistema nervioso es posible, cultivos de hipocampo embrionarias son frecuentemente preferidos debido a su población celular piramidal definida y una densidad relativamente baja glial 1, 2. Las neuronas del hipocampo cultivadas a baja densidad en cultivo son particularmente AMEnable al estudio de la localización subcelular, el tráfico de proteínas, la polaridad neuronal y desarrollo de sinapsis. Las neuronas en cultivo también se han empleado ampliamente en el estudio de los procesos moleculares en la plasticidad sináptica 3, 4, 5, 6. Preparaciones de cultivos de neuronas de ratones con deleciones genéticas globales que no sobreviven después del nacimiento han sido especialmente útil en el estudio de funciones celulares y sinápticas de ciertos genes 7. Al igual que en el cerebro, las neuronas del hipocampo en cultivo dependen de soporte trófico de las células gliales. Esto complica su cultura, y ha llevado al desarrollo de varios métodos diferentes de los que se toma este apoyo. Un método comúnmente utilizado implica chapado neuronas directamente sobre una monocapa de células gliales 8, o permitiendo que las células gliales contaminantes de la hipp adquiridotejido ocampal a proliferar y formar una monocapa debajo de las neuronas 9. Si bien este método ha encontrado cierto éxito, la impureza de la cultura neuronal resultante es desventajoso para los experimentos de imagen. Otro método utilizado comúnmente de la cultura neurona es dejar de salida del alimentador glial capa por completo, y en lugar de proporcionar soporte trófico en la forma de un medio de crecimiento definido 10. A continuación, se describe el método de &quot;banquero&quot; de la cultura de la neurona 2, 11 &quot;sándwich&quot; o. Este método consiste en placas las neuronas del hipocampo en cubreobjetos de vidrio, que luego son suspendidos sobre una monocapa de células gliales separadas por perlas de cera de parafina. Esto facilita cultivo a largo plazo de una población homogénea de neuronas sin contaminar glia permitiendo al mismo tiempo soporte trófico de la monocapa glial subyacente. Cuando las neuronas son mayores de edad o nivel de madurez suficiente,los cubreobjetos neurona puede ser volteado de salida del plato glial y se usan en formación de imágenes o ensayos funcionales.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Dissection Instruments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Spring Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5650</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecting Spring Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5605</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps (#5)</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps (#PP)</td><td>Roboz</td><td>RS-4950</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tissue Preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (2.5%)</td><td>Gibco</td><td>15-090-046</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>Swinnex Filter Holder, 25&amp;nbsp;mm</td><td>EMD Millipore</td><td>SX0002500</td><td>Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave</td></tr><tr><td>Isoflorane</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td>CP0406V2</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>Grade 105 Lens Cleaning Tissue</td><td>GE Healthcare</td><td>2105-841</td><td>Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave</td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipettes with cotton filter</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x)</td><td>Gibco</td><td>14-185-052</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipettes</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Butane bunsen burner</td><td>Wall-Lenk Mfg. Co.</td><td>Model 65</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tissue Culture&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish (100 mm)</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish (60 mm)</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended.</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>Gibco</td><td>11-095-080</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21-103-049</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25-030-081</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium</td></tr><tr><td>Culture Dish (60 mm)</td><td>Corning, Inc</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Culture Flasks (75 cm^2)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>Cytarabine (Ara-C)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3350000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Growth Serum (BGS)</td><td>HyClone</td><td>SH3054103</td><td>Heat-inactivation is recommended before use.</td></tr><tr><td>B27 Supplement (50x)</td><td>Gibco</td><td>17-504-044</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic Vials</td><td>VWR</td><td>89094-806</td><td></td></tr><tr><td>DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Coverslip Preparation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium tetraborate decahydrate (borax)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine Hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>Histoplast Paraffin Wax</td><td>Fisher</td><td>22-900-700</td><td></td></tr><tr><td>Gravity Convection Oven</td><td>VWR</td><td>89511-404</td><td>Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol</td></tr><tr><td>Ultrasonic Bath (Sonicator)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15337400</td><td></td></tr><tr><td>Nitric Acid</td><td>Anachemia</td><td>62786-460</td><td></td></tr><tr><td>Ceramic Staining Racks</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td>Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Glaswarenfabrik Karl Hecht&amp;nbsp;GmbH</td><td>1001/18</td><td>Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Miscellaneous&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile Syringe Filters</td><td>VWR</td><td>28145-477</td><td>Used with BD syringe for filter-sterilization</td></tr><tr><td>Syringe&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>302832</td><td>Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization</td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-460-16Q</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td><td>ThermoScientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td><td>ThermoScientific</td><td>339652</td><td></td></tr></tbody></table>

low-density primary hippocampal neuron culture

La capacidad para sondar la estructura y fisiología de las células nerviosas individuales en cultivo es crucial para el estudio de la neurobiología, y permite la flexibilidad en la manipulación genética y química de las células individuales o redes definidas. Tal facilidad de manipulación es más sencilla en el sistema de cultivo reducido en comparación con el tejido cerebral intacta. Aunque existen muchos métodos para el aislamiento y crecimiento de estas neuronas primarias, cada uno tiene sus propias limitaciones. Este protocolo describe un método para el cultivo de baja densidad y de roedores de alta pureza neuronas del hipocampo embrionarias en cubreobjetos de vidrio, que luego son suspendidos sobre una monocapa de células gliales. Esta &#39;cultura sándwich&#39; permite el crecimiento exclusiva a largo plazo de una población de neuronas permitiendo al mismo tiempo soporte trófico de la monocapa glial subyacente. Cuando las neuronas son de edad suficiente o nivel de madurez, los cubreobjetos neurona puede ser volteado de salida del plato glial y se usan en formación de imágenes o ensayos funcionales. Las neuronas grown por este método normalmente sobrevivir durante varias semanas y desarrollar amplias pérgolas, conexiones sinápticas, y propiedades de la red.

En este método &quot;sandwich&quot; de cultivo de células de nervio primario, las neuronas del hipocampo (Figura 3) crecen en una cama de células gliales (Figura 1) separadas por perlas de parafina (Figura 2). Esto asegura que las neuronas crezcan selectivamente en cubreobjetos de vidrio con la contaminación de células glial mínima, pero reciben soporte trófico adecuada de la glía que crecen en la placa de cultivo tisular. Típic...

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Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Este artículo describe el protocolo para el cultivo de baja densidad de neuronas del hipocampo primarias que crecen en cubreobjetos de vidrio invertida sobre una monocapa glial. Las capas de neuronas y de la glía están separados por perlas de cera de parafina. Las neuronas cultivadas por este método son adecuados para formación de imágenes ópticas de alta resolución y ensayos funcionales.

Baja densidad primaria del hipocampo Neurona Cultura

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

low-density-primary-hippocampal-neuron-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.5K vistas.  University of Manitoba.  Este artículo describe el protocolo para el cultivo de baja densidad de neuronas del hipocampo primarias que crecen en cubreobjetos de vidrio invertida sobre una monocapa glial. Las capas de neuronas y de la glía están separados por perlas de cera de parafina. Las neuronas cultivadas por este método son adecuados para formación de imágenes ópticas de alta resolución y ensayos funcionales. 

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Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection y cultivos primarios de neuronas del hipocampo de embriones de ratón y corticales

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Investigación

Neurociencias

Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and memory. Primary hippocampal cell culturing allows neuroscientists to examine the activity and properties of neurons at the individual cell and single synapse level. In this video, we will demonstrate how to isolate and grow primary hippocampal cells from newborn rats. The hippocampus may be isolated from each newborn animal in as short as 2 to 3 minutes, and the cultures can be maintained for up to two weeks. We will also briefly demonstrate how to use these hippocampal neurons for ratiometric calcium imaging. While this protocol describes the process for the hippocampus, with little to no modification, it can be applied to other regions of the brain.

The dissection and growth of cells from an individual brain area facilitates investigation of cellular and physiological parameters. We describe a method for primary cell culturing that produces neuron-enriched cultures in a serum-free environment.

Cultivo primario de neuronas del hipocampo de ratas recién nacidas P0

The physiological properties of hippocampal neurons are commonly investigated, especially because of the involvement of the hippocampus in learning and ...

Biología

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Aislamiento y cultivo de neuronas del hipocampo de ratones prenatales

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Sex Stratified Neuronal Cultures to Study Ischemic Cell Death Pathways

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms responsible for those differences remain unclear. Primary disassociated embryonic neuronal culture provides a simplified experimental model with which to investigate the neuronal cell signaling involved in cell death as a result of ischemia or disease; however, most neuronal cultures used in research today are mixed sex. Researchers can and do test the effects of sex steroid treatment in mixed sex neuronal cultures in models of neuronal injury and disease, but accumulating evidence suggests that the female brain responds to androgens, estrogens, and progesterone differently than the male brain. Furthermore, neonate male and female rodents respond differently to ischemic injury, with males experiencing greater injury following cerebral ischemia than females. Thus, mixed sex neuronal cultures might obscure and confound the experimental results; important information might be missed. For this reason, the Herson Lab at the University of Colorado School of Medicine routinely prepares sex-stratified primary disassociated embryonic neuronal cultures from both hippocampus and cortex. Embryos are sexed before harvesting of brain tissue and male and female tissue are disassociated separately, plated separately, and maintained separately. Using this method, the Herson Lab has demonstrated a male-specific role for the ion channel TRPM2 in ischemic cell death. In this manuscript, we share and discuss our protocol for sexing embryonic mice and preparing sex-stratified hippocampal primary disassociated neuron cultures. This method can be adapted to prepare sex-stratified cortical cultures and the method for embryo sexing can be used in conjunction with other protocols for any study in which sex is thought to be an important determinant of outcome.

Primary disassociated embryonic hippocampal neuronal cultures are useful for investigating the signaling mechanisms involved in neuron death. Sexing the embryos before the isolation and dissociation of the hippocampus allows the preparation of separate male and female cultures, which enables the researcher to identify and investigate sex-specific cell signaling.

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

Rápido Genotipado de animales seguidas del establecimiento de cultivos primarios de neuronas cerebrales

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Un método simplificado para determinar la densidad ultra-baja, a largo plazo del hipocampo primaria Neurona Cultura

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. Imaging studies are widely used to investigate their function and plasticity in physiological and pathological conditions. Because of their size and structure, localization studies of proteins require high-resolution imaging techniques. In this protocol, we describe a procedure to study in primary neurons the co-localization of target proteins with synaptic markers at a super-resolution level using structured illumination microscopy (SIM). SIM is a patterned-light illumination technique that doubles the spatial resolution of wide-field microscopy, reaching a detail of around 100 nm. The protocol indicates the required controls and settings for robust co-localization studies and an overview of the statistical methods to analyze the imaging data properly.

This protocol shows how to employ super-resolution microscopy to study protein co-localization in primary neuronal cultures.

Imágenes de Superresoridad para estudiar la co-localización de proteínas y marcadores sinápticos en neuronas primarias

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons

Neuronal culture is a valuable system for evaluating synaptic functions and drug screenings. In particular, a low-density culture of primary hippocampal neurons allows the study of individual neurons or subcellular components. We have shown subcellular protein localization within a neuron by immunocytochemistry, neuronal polarity, synaptic morphology, and its developmental change using a low-density primary hippocampal culture. Recently, ready-to-use frozen stocks of neurons have become commercially available. These frozen stocks of neurons reduce the time needed to prepare animal experiments and also contribute to the reduction of the number of animals used. Here, we introduce a reproducible low-density primary culture method using a 96-well plate. We used a commercially available frozen stock of neurons from the rat embryonic hippocampus. The neurons can be stably cultured long-term without media changes by reducing the growth of glial cells at particular timepoints. This high-throughput assay using low-density culture allows reproducible imaging-based evaluations of synaptic plasticity.

A ready-to-use frozen stock of neurons is a powerful tool for evaluating synaptic functions. Here, we introduce an easy low-density primary culture from frozen stock using a 96-well plate.

Cultivo primario de baja densidad fácil y reproducible utilizando existencias congeladas de neuronas embrionarias del hipocampo

Neuronal culture is a valuable system for evaluating synaptic functions and drug screenings. In particular, a low-density culture of primary hippocampal ...

A Technique to Culture Mouse Hippocampal Neurons

Source: Yang, R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61411">Use of Primary Cultured Hippocampal Neurons to Study the Assembly of Axon Initial Segments.</a> J. Vis. Exp. (2021)
The video demonstrates a method for culturing neurons from murine hippocampi. Initially, the hippocampi undergo enzymatic digestion to break down the extracellular tissue matrix. Subsequently, the digested tissue is mechanically disrupted to isolate individual neurons. Finally, these neurons are cultured on glial feeder cells.

Una técnica para cultivar neuronas del hipocampo de ratón

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparing glia cell feeder dishes ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Generating a Low-Density Primary Neuron Culture From Frozen Embryonic Neurons

Source: Koganezawa, N. et al., <a href="https://app.jove.com/v/64872">Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2023)
This video demonstrates the method of culturing cryopreserved embryonic neurons, involving controlled thawing, dilution with a neurobasal medium, and seeding onto a poly-L-lysine-coated plate. Subsequent incubation supports the growth and maintenance of neuronal connections.

Generación de un cultivo de neuronas primarias de baja densidad a partir de neuronas embrionarias congeladas

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Plate coating

	Coat a 96-well ...