Este trabajo fue apoyado por CIHR RP-142209 a TJS.

Todos los experimentos y protocolos que utilizan animales de laboratorio fueron aprobados por el comité de ética animal de la Universidad de Manitoba y se ajustaban a las directrices del Consejo Canadiense de los Animales. 1. Preparación de instrumentos, tampones y soluciones <ol><li> Esterilizar en autoclave todos los equipos de la disección, pipetas Pasteur de vidrio, puntas de pipeta, aparato de filtro, y agua desionizada. </li><li> Preparar un 20% (w / v; 1,1 M) solución madre de glucosa en agua desionizada y se filtro a esterilizar. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Preparar una solución de piruvato de sodio 100 mM en agua desionizada y el filtro a esterilizar. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Preparar solución salina equilibrada de calcio y de magnesio libre Hank (CMF-HBSS) haciendo una solución de 10% HBSS (10x), HEPES 10 mM, y 100 U / ml de penicilina-estreptomicina en agua desionizada. Almacenar a 4 ° C durante no más de 1 a 2 meses. </li><li> Preparar 10 mg / ml de desoxirribonucleasa I (ADNasa) en CMF-HBSS,y luego filtrar-esterilizar y almacenar a -20 ° C. </li><li> Preparar medio glial haciendo una solución de glucosa 30 mM (a partir de la solución estéril), 95 U / ml de penicilina-estreptomicina, y 10-15% de suero de crecimiento bovina (BGS) en medio esencial mínimo (MEM). NOTA: Como se indica en el protocolo, una solución de 5% BGS se puede utilizar si es necesario para frenar la proliferación celular. Suero de Caballo se puede utilizar en lugar de BGS, pero tenga en cuenta que cada lote debe ser probado antes de su uso debido a la variación inter-lote. Almacenar la solución preparada a 4 ° C durante no más de 1 a 2 meses. Aunque muchos laboratorios utilizan FBS, se observó consistentemente que el crecimiento glial en BGS es tan robusto como en FBS. BGS se deriva de suero de ternera fetal que se complementa con componentes químicamente definidos. Además, BGS es sustancialmente más económico que FBS. </li><li> Preparar el crecimiento de neuronas y medio de mantenimiento (neurobasal-B27, NBG) haciendo una solución de 1x B27 suplemento y 0,5 mM de L-glutamina en 500 ml de Neurobasal Medium. Almacenar a 4 ° C durante no más de 1 a 2 meses. L-glutamina puede estar sustituido con GlutaMAX, que ha sido sugerido para ser más estable en el medio de crecimiento. </li><li> Preparar la neurona medio de siembra al hacer una solución de glucosa 30 mM (a partir de la solución estéril), piruvato de sodio 1 mM (a partir de la solución estéril), y 10% BGS en MEM. Almacenar a 4 ° C durante no más de 1 a 2 meses. </li><li> Preparar una solución de citarabina 1 mM (Ara-C) y el filtro a esterilizar. Alícuota en porciones de 1 ml y almacenar a -20 ° C. </li><li> Preparar una solución de mM APV 100 en NaOH esterilizada-filtro de 100 mN. Almacenar a -20 ° C. </li><li> Disolver 1 mg / ml de poli-L-lisina en tampón de borato, pH 8,5 (50 mM de ácido bórico y bórax 12 mM) y el filtro a esterilizar. Alícuota y almacenar a -20 ° C. En lugar de poli-L-lisina, se puede usar poli-L-ornitina que puede ser menos tóxico para las células. </li></ol> 2. Glia Cultura Preparación <ol><li> Preparar cultivo celular astroglia cortical <ol><li&gt; Obtener crías de rata dentro de las 24 horas siguientes al nacimiento. Coloque los cachorros en el hielo para anestesiar a ellos. </li><li> Pulverizar las crías con 70% de etanol y decapitar a ellos. </li><li> Colocar las cabezas en un plato de 100 mm en el hielo que contiene 15 ml CMF-HBSS. </li><li> Diseccionar cada cerebro cortando el cuero cabelludo, abrir el cráneo, cortando el tronco cerebral, y luego transferir el cerebro a 60 mm placas de Petri en el hielo que contenía 3 ml CMF-HBSS. </li><li> Separar los hemisferios cerebrales del hipocampo y luego tira lejos las meninges que rodean ellos. Ejercer precaución adecuada para asegurar la contaminación mínima a partir de fibroblastos meníngeos. fibroblastos meníngeos en la cultura puede competir con la glía para el crecimiento y ser perjudiciales para la salud de las neuronas. Recoge todas las hemisferios cerebrales en un 60 mm placa de Petri en el hielo que contiene 5 ml CMF-HBSS. </li><li> Eliminar la CMF-HBSS y luego picar el tejido cortical recogido tan finamente como sea posible usando resorte-tijeras-micro disección. </li><li> Añadir suficiente CMF-HBSS para la chuletatejido ped. Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio, transferir las piezas de tejido a un tubo de 15 ml. Llevar el volumen total a 12 ml mediante la adición de CMF-HBSS. </li><li> Añadir 1,5 ml de cada uno de 2,5% de tripsina y 10 mg / ml de solución de DNasa. Incubar la mezcla resultante a 37 ° C en un baño de agua durante 12 min. </li><li> Se tritura el tejido 10-15 veces usando una pipeta Pasteur de vidrio, y más en incubar en un baño de agua a 37 ° durante 3 min. </li><li> Filtrar el sobrenadante a través de papel de la lente o de una malla de filtro en un tubo de 50 ml que contenía 5 ml de BGS. Esto se hace para eliminar trozos de tejido no disociado. Alternativamente, utilizar tamices de células disponibles comercialmente. </li><li> Añadir 13,5 ml de CMF-HBSS y 1,5 ml de 2,5% de tripsina al tubo que contiene las piezas de tejido restantes y además incubar a 37 ° C en un baño de agua durante 10 min adicionales. </li><li> Se tritura el tejido restante una vez más, y luego filtrar la suspensión de nuevo en el tubo de 50 ml que contiene el filtrado inicial. A continuación, enjuagar la lepapel ns con 3 ml de BGS. El volumen final debe ser de aproximadamente 38 ml. </li><li> Centrifugar la suspensión que contiene las células gliales disociadas durante 6 min a 130 x g. deseche cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio. Asegúrese de que las células sedimentadas en el fondo no se vean perturbadas. La parte inferior de la pastilla aparece ligeramente rojizo que contienen componentes de la sangre. </li><li> Transferencia de las células gliales en 1 ml de medio glial en un tubo nuevo, teniendo cuidado de no perturbar la porción rojizo de la pastilla. </li><li> Añadir hasta 2 ml de medio glial por pup para resuspender el combinado disociarse células gliales. Por ejemplo, se utilizaron si 10 crías, y después el volumen total resuspensión fuera 20 ml. </li><li> Preparar matraz de cultivo de uno 75 cm 2 de células por cachorro. Añadir 18 ml de medio de glial pre-calentado a cada matraz. </li><li> Transferencia de 2 ml de suspensión celular a cada matraz y se incuban en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Después de un día, reemplazar con 20 ml glial medio. En esta etapa, el cultivo es una mezcla de glial y otros tipos de células no deseadas. </li><li> Cuatro días después de sembrar las células, agitar vigorosamente los matraces para desalojar las células no de astrocitos. Para ello, enjuagar los matraces una vez con CMF-HBSS, y luego añadir 10 ml fresco CMF-HBSS a cada matraz. Agitar vigorosamente los matraces de 5-10 veces, y luego aspirar fuera de la CMF-HBSS. Enjuague dos veces con CMF-HBSS y, a continuación añadir 20 ml de medio de glial. NOTA: Este paso es crucial para asegurar la eliminación de tipos de células no objetivo, y no debe dar lugar a la pérdida de los astrocitos deseados. </li><li> Reemplazar con medio glial fresco dos veces a la semana hasta que las células son confluentes (Figura 1). </li></ol></li><li> glía congelación <ol><li> Una vez que son confluentes las culturas, aspirar fuera el medio y lavar la monocapa de células con 10 ml de CMF-HBSS. </li><li> Añadir 10 ml de 0,25% de tripsina / EDTA a cada matraz y se incuba a 37 ° C durante 3 min. </li><li> matraces golpear suavemente para desalojar las células. Añadir 1 ml BGS to cada matraz y la transferencia de las suspensiones de células en tubos de 15 ml. </li><li> Centrifugar los tubos a 130 xg durante 6 min. Descartar el sobrenadante resultante. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 2 ml de medio de glial. </li><li> Preparar el medio de congelación glial (dimetilsulfóxido 1-parte y 4 partes BGS). Añadir 0,5 ml de esta solución a cada uno de 4 viales criogénicos por matraz. </li><li> Transferir 0,5 ml de suspensión celular a cada vial, y a continuación, congelar las células lentamente mediante la colocación de los viales en un recipiente aislado en un congelador C -80 ° durante la noche. Después de un día, la transferencia de los viales a un congelador de nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo. </li></ol></li><li> Chapado revivió glía <ol><li> glía Plate 1-2 semanas antes del día de la cultura de las neuronas. </li><li> Preparar un ml tubo 50 con 10 ml calentó medio glial. </li><li> Descongelar 1 vial congelado de la glía en un baño de agua a 37 ° durante 2-3 min. </li><li> Transferir el contenido del vial en el tubo de 50 ml que contiene 10 ml de medio de glial. </li><li> centrifuge el tubo durante 5 minutos a 130 xg y aspirar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el precipitado en 20 ml de medio de glial. </li><li> Añadir 3 ml de medio de glial fresco a cada una de las placas de cultivo (60 mm), y luego transferir 1 mL de la suspensión celular a cada plato. Incubar los cultivos en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. </li><li> Alimentar las células dos veces a la semana. Si la densidad celular alcanza% de confluencia 50 mucho antes de la cultura día neurona, cambiar a medio glial que contiene 5% BGS para ralentizar la tasa de crecimiento glial. La confluencia deseada de la monocapa glial para la cultura neurona es 50% - 70%. </li><li> Reemplazar el medio glial con medio NBG (6 ml / placa) 1-2 días antes de la cultura neurona. </li></ol></li></ol> 3. Coverslip Preparación <ol><li> Limpieza y Preparación de perlas de parafina <ol><li> Sumergir cubreobjetos en ácido nítrico concentrado (70% peso / peso; PRECAUCIÓN: altamente corrosivo) y someter a ultrasonidos ellos durante 30 min a temperatura ambiente. Otros laboratorios han found que es beneficioso para incubar los cubreobjetos en ácido nítrico al 70% en bastidores de cerámica durante 12-24 h a temperatura ambiente en su lugar. </li><li> desechar cuidadosamente el ácido nítrico en una campana de humos química designada de acuerdo a las directrices institucionales. Lavar los cubreobjetos 3-5 veces con agua desionizada. </li><li> Sumergir los cubreobjetos en agua desionizada y someter a ultrasonidos de nuevo durante 30 min (omitir si siguiendo el método alternativo). </li><li> Eliminar el agua desionizada y enjuagar los cubreobjetos otras tres veces. </li><li> Sumergir los cubreobjetos en 50 ml de agua desionizada y esterilizarlas en autoclave. Alternativamente, esterilizar los cubreobjetos a 225 ° C en un horno durante 6 h. Si se utiliza este enfoque alternativo, vaya al paso 3.1.9. </li><li> Una vez tratada en autoclave, transferir los cubreobjetos a una campana de flujo laminar estéril para los pasos siguientes. </li><li> Eliminar el agua desionizada y enjuague con 20-30 ml de etanol al 100%. </li><li> Añadir 20-30 ml de etanol al 100% y transferir los cubreobjetos y seetanol a una placa de Petri de 100 mm. </li><li> Use pinzas romas para transferir cubreobjetos de 60 mm placas de Petri, 4-5 cubreobjetos por placa, y luego permitir que se seque al aire apoyándose los cubreobjetos contra el borde del plato. Una vez que el etanol se ha evaporado, sentar las cubreobjetos plana en la superficie. </li><li> Transferir 10 g de parafina a una botella de vidrio resistente al calor adecuado. Derretir la parafina y mantenerla a aproximadamente 150-200 ° C sobre una placa caliente durante al menos 1 h. La temperatura ideal a la que la parafina se debe calentar puede tomar algunos ajustes. temperaturas no ideales puede conducir a la dificultad para producir el tamaño correcto de las perlas de parafina. El período de espera después de la fusión ayuda a asegurar una temperatura constante durante todo el líquido. </li><li> Sumergir una pipeta Pasteur en la parafina, y luego rápidamente tocarlo para tres puntos cerca del borde de cada cubreobjetos (cada punto es aproximadamente de 120 ° de separación). Las gotas se solidifican en perlas de aproximadamente 0,3-0,5 mm de alto y 1,0-2,0 mm de diameter y funcionará para proporcionar un espacio entre las neuronas en el cubreobjetos y la monocapa glial a continuación (Figura 2). </li><li> Esterilizar los platos bajo luz UV durante 30 min, y luego cubrir con papel de aluminio y se almacena a temperatura ambiente. cubreobjetos preparados pueden ser almacenados y utilizados hasta por un mes. perlas de parafina se debe permitir que se adhieran a los cubreobjetos durante al menos una semana antes de su uso. Esto evitará que la parafina se desprenda durante los pasos restantes del protocolo. </li></ol></li><li> Los cubreobjetos de recubrimiento con poli-L-lisina <ol><li> Obtener placas de Petri que contienen cubreobjetos previamente preparadas con las perlas de parafina. </li><li> Añadir 200! L de poli-L-lisina en tampón de borato a la superficie de cada cubreobjetos y dejar que la solución se asiente en los cubreobjetos durante la noche, cubierto, a temperatura ambiente. Escudo la misma superficie que aquella en la que están situadas las perlas de parafina. Tenga en cuenta que si se limpian adecuadamente, la poli-L-lisina debe propagarse fácilmentepara cubrir la superficie del cubreobjetos. </li><li> Después de un día, lavar los cubreobjetos dos veces por remojo en agua desionizada estéril para 2 h cada vez. Después del lavado final, reemplazar el agua con 4 ml de medio de chapado neuronal por plato. Tenga en cuenta que es importante que la superficie de los cubreobjetos no permitir que se seque después de haber sido revestido con poli-L-lisina. </li><li> Colocar las cápsulas que contienen cubreobjetos-en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora. Los cubreobjetos recubiertos deben incubarse durante al menos 24 h antes de la cultura neurona. Esto se hace para preparar el medio para el cultivo de neuronas. </li></ol></li></ol> 4. La disección del hipocampo y neuronas Plating <ol><li> Obtener una rata preñada (día embrionario 18-19, medido desde el día del descubrimiento tapón vaginal) y la eutanasia por decapitación isoflurano anestesiados u otro método aprobado. </li><li> Pulverizar la parte inferior de la rata con 70% de etanol, y luego hacer una incisión de la región púbica throuf al extremo de la cavidad abdominal. Para evitar la contaminación, tener cuidado de cortar sólo a través de la piel en este paso. </li><li> Enjuagar los instrumentos de disección de nuevo con 70% de etanol, y luego se corta a través de la pared abdominal para exponer el útero. Retire los dos cuernos uterinos y colocarlos en un 100 mm placa de Petri estéril. </li><li> Realizar los pasos restantes en una campana de flujo laminar. Retire la membrana uterina que rodea a los fetos. Decapitar a ellos y colocar las cabezas en una placa de Petri de 100 mm que contiene 20 ml CMF-HBSS. </li><li> Diseccionar el cerebro e inmediatamente colocarlos en un 60 mm placa de Petri que contiene 2 ml CMF-HBSS en hielo. Recoger sólo 2-3 cerebros por placa para permitir espacio suficiente para el paso siguiente. </li><li> Bajo un microscopio de disección tira lejos las meninges de la línea media de los hemisferios cerebrales, y luego diseccionar los hipocampos y colocarlos en un 60 mm placa de Petri que contiene 4,5 ml CMF-HBSS. Tenga en cuenta que el hipocampo puede ser distinguido como una estruc forma de media lunatura en la superficie medial del hemisferio cortical, y es fácil de eliminar, ya que está bordeado lateralmente por un ventrículo. </li><li> Transferir el tejido del hipocampo recogido y CMF-HBSS a un tubo de 15 ml. Añadir 0,5 ml de 2,5% de tripsina, y luego se incuba a 37 ° C durante 10 min. La papaína se puede utilizar en lugar de la tripsina, ya que es más suave y puede aumentar el rendimiento. </li><li> eliminar suavemente la solución de tripsina por pipeta Pasteur, dejando el tejido del hipocampo no alterados en la parte inferior del tubo. </li><li> Lavar suavemente el tejido dos veces con 5 ml CMF-HBSS mientras que la incubación a 37 ° C durante 5 min. Después del segundo lavado, llevar el volumen total a al menos 5 ml mediante la adición de un volumen suficiente de CMF-HBSS al tejido. Si hay hipocampos de más de 10 crías, hasta 8 ml CMF-HBSS se puede añadir. </li><li> Preparar dos variantes de pipetas pulida al fuego para la disociación del tejido. La punta de una variante es del diámetro normal de la pipeta, pero con bordes smoothened pulida al fuego. La otra varihormiga es uno con el diámetro de la punta reducido a la mitad. Brevemente exponer la punta de una pipeta Pasteur de vidrio en diagonal a una fuente de llama, y ​​luego examinar las puntas de las pipetas. <ol><li> Repita este paso hasta que el borde de la punta había sido smoothened o el diámetro se ha reducido. Es importante practicar para encontrar el diámetro ideal para asegurar que el tejido se disocia para producir células individuales sin dañar estas células. </li></ol></li><li> Se tritura el tejido del hipocampo primero por cerca de 10 pases a través de una pipeta Pasteur de vidrio normal, de bordes lisos, y luego un adicional de 5 a 10 pases a través de la pipeta con el diámetro reducido. El objetivo es obtener una solución homogénea de células sin o con muy pocos grumos de tejido. </li><li> Determinar la densidad de células usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Típicamente, se obtienen 0,8 a 1,0 millones de células por pup cuando se combinan hipocampos de los dos hemisferios. </li><li> Transferir un volumen suficiente de la suspensión de células a platosque contiene cubreobjetos de poli-L-lisina en 4 ml medio de siembra para obtener una densidad de placas de 300.000 células por placa de 60 mm. La densidad de las células puede variar de 100.000 a 500.000, dependiendo del experimento previsto. </li><li> Después de 3-4 h, transferir los cubreobjetos con las neuronas unidos a platos que contienen células gliales en medio NBG. Esto debe hacerse de tal manera que el lado en el que se sembraron las neuronas se enfrenta hacia abajo hacia la capa de células glial. Añadir un total de 4-5 cubreobjetos por placa de células gliales. </li><li> Dos o tres días después de la siembra, añadir la solución de Ara-C a una concentración final de 5 mM por placa para detener el crecimiento glial. </li><li> Alimentar a las células una vez a la semana mediante la sustitución de 2 ml de la vieja medio con 2,5 ml de medio fresco en cada alimentación. El medio extra añadido es para compensar la evaporación con el tiempo, y sólo una parte del medio se cambia para garantizar acondicionado coherente del medio por las células gliales. Estos cultivos son típicamente sanos durante al menos un mes (La Figura 3). la supervivencia neuronal se puede mejorar mediante la adición de APV al medio de cultivo a una concentración final de 100? M. APV es un antagonista del receptor NMDA y promueve la supervivencia mediante la reducción de la excitotoxicidad del glutamato. </li></ol>

<ol>
	<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Res. 126, 397-425 (1977).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Adamantidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics:+10+years+after+ChR2+in+neurons--views+from+the+community.">Optogenetics: 10 years after ChR2 in neurons--views from the community.</a> Nat Neurosci. 18, 1202-1212 (2015).</li><li>Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+synaptic+plasticity.">The cell biology of synaptic plasticity.</a> Science. 334, 623-628 (2011).</li><li>Huganir, R. L., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPARs+and+synaptic+plasticity:+the+last+25+years.">AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years.</a> Neuron. 80, 704-717 (2013).</li><li>Luscher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+AMPA+receptor+cycling+in+synaptic+transmission+and+plasticity.">Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity.</a> Neuron. 24, 649-658 (1999).</li><li>Varoqueaux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+determine+synapse+maturation+and+function.">Neuroligins determine synapse maturation and function.</a> Neuron. 51, 741-754 (2006).</li><li>Huettner, J. E., Baughman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+identified+neurons+from+the+visual+cortex+of+postnatal+rats.">Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats.</a> J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).</li><li>Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione+with+the+N-methyl-D-aspartate+receptor-associated+glycine+binding+site.">Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site.</a> Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+survival+of+hippocampal+neurons+in+B27-supplemented+Neurobasal,+a+new+serum-free+medium+combination.">Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination.</a> J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).</li><li>Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+low-density+culture.">Rat hippocampal neurons in low-density culture.</a> Culturing nerve cells. 2, 339-370 (1998).</li><li>Hanisch, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+as+a+source+and+target+of+cytokines.">Microglia as a source and target of cytokines.</a> Glia. 40, 140-155 (2002).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Mientras que el método &quot;sandwich&quot; de las neuronas que el cultivo haya sido bien descrito en otras partes 2, 11, hay varios pasos a lo largo del protocolo que son muy difíciles de describir en texto por sí solo, que puede conducir a la frustración para los investigadores que desean adoptarlo. El método se puede dividir en tres grandes flujos de trabajo: cultura glial, preparación cubreobjetos y cultivo de neuronas y de...

El cerebro está organizado en intrincadas redes de neuronas. La contribución de las neuronas individuales a la actividad de red y la función cerebral puede ser estudiada por la alteración selectiva de su composición molecular y perturbación de sus propiedades fisiológicas. La manipulación genética y química de las neuronas individuales es posiblemente más fácil en neuronas cultivadas que en el tejido del cerebro intacto, sin el estorbo de la heterogeneidad y complejidad celular de este último. Las neuronas en cultivo desarrollan axonal bien definido y cenadores dendríticas y forman extensas conexiones sinápticas entre sí. Mientras que la cultura de las neuronas de animales adultos o de otras regiones del sistema nervioso es posible, cultivos de hipocampo embrionarias son frecuentemente preferidos debido a su población celular piramidal definida y una densidad relativamente baja glial 1, 2. Las neuronas del hipocampo cultivadas a baja densidad en cultivo son particularmente AMEnable al estudio de la localización subcelular, el tráfico de proteínas, la polaridad neuronal y desarrollo de sinapsis. Las neuronas en cultivo también se han empleado ampliamente en el estudio de los procesos moleculares en la plasticidad sináptica 3, 4, 5, 6. Preparaciones de cultivos de neuronas de ratones con deleciones genéticas globales que no sobreviven después del nacimiento han sido especialmente útil en el estudio de funciones celulares y sinápticas de ciertos genes 7. Al igual que en el cerebro, las neuronas del hipocampo en cultivo dependen de soporte trófico de las células gliales. Esto complica su cultura, y ha llevado al desarrollo de varios métodos diferentes de los que se toma este apoyo. Un método comúnmente utilizado implica chapado neuronas directamente sobre una monocapa de células gliales 8, o permitiendo que las células gliales contaminantes de la hipp adquiridotejido ocampal a proliferar y formar una monocapa debajo de las neuronas 9. Si bien este método ha encontrado cierto éxito, la impureza de la cultura neuronal resultante es desventajoso para los experimentos de imagen. Otro método utilizado comúnmente de la cultura neurona es dejar de salida del alimentador glial capa por completo, y en lugar de proporcionar soporte trófico en la forma de un medio de crecimiento definido 10. A continuación, se describe el método de &quot;banquero&quot; de la cultura de la neurona 2, 11 &quot;sándwich&quot; o. Este método consiste en placas las neuronas del hipocampo en cubreobjetos de vidrio, que luego son suspendidos sobre una monocapa de células gliales separadas por perlas de cera de parafina. Esto facilita cultivo a largo plazo de una población homogénea de neuronas sin contaminar glia permitiendo al mismo tiempo soporte trófico de la monocapa glial subyacente. Cuando las neuronas son mayores de edad o nivel de madurez suficiente,los cubreobjetos neurona puede ser volteado de salida del plato glial y se usan en formación de imágenes o ensayos funcionales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dissection Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps (#5)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps (#PP)</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-4950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (2.5%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25-200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swinnex Filter Holder, 25&#160;mm</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>SX0002500</td>
			<td>Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflorane</td>
			<td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td>
			<td>CP0406V2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grade 105 Lens Cleaning Tissue</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>2105-841</td>
			<td>Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes with cotton filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14-185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butane bunsen burner</td>
			<td>Wall-Lenk Mfg. Co.</td>
			<td>Model 65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (100 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (60 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td>Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Dish (60 mm)</td>
			<td>Corning, Inc</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Flasks (75 cm^2)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytarabine (Ara-C)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3350000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Growth Serum (BGS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH3054103</td>
			<td>Heat-inactivation is recommended before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17-504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic Vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tetraborate decahydrate (borax)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9876-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoplast Paraffin Wax</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-900-700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gravity Convection Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89511-404</td>
			<td>Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Bath (Sonicator)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15337400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitric Acid</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>62786-460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Staining Racks</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td>Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Glaswarenfabrik Karl Hecht&#160;GmbH</td>
			<td>1001/18</td>
			<td>Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringe Filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-477</td>
			<td>Used with BD syringe for filter-sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td>Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-460-16Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

low-density primary hippocampal neuron culture

La capacidad para sondar la estructura y fisiología de las células nerviosas individuales en cultivo es crucial para el estudio de la neurobiología, y permite la flexibilidad en la manipulación genética y química de las células individuales o redes definidas. Tal facilidad de manipulación es más sencilla en el sistema de cultivo reducido en comparación con el tejido cerebral intacta. Aunque existen muchos métodos para el aislamiento y crecimiento de estas neuronas primarias, cada uno tiene sus propias limitaciones. Este protocolo describe un método para el cultivo de baja densidad y de roedores de alta pureza neuronas del hipocampo embrionarias en cubreobjetos de vidrio, que luego son suspendidos sobre una monocapa de células gliales. Esta &#39;cultura sándwich&#39; permite el crecimiento exclusiva a largo plazo de una población de neuronas permitiendo al mismo tiempo soporte trófico de la monocapa glial subyacente. Cuando las neuronas son de edad suficiente o nivel de madurez, los cubreobjetos neurona puede ser volteado de salida del plato glial y se usan en formación de imágenes o ensayos funcionales. Las neuronas grown por este método normalmente sobrevivir durante varias semanas y desarrollar amplias pérgolas, conexiones sinápticas, y propiedades de la red.

En este método &quot;sandwich&quot; de cultivo de células de nervio primario, las neuronas del hipocampo (Figura 3) crecen en una cama de células gliales (Figura 1) separadas por perlas de parafina (Figura 2). Esto asegura que las neuronas crezcan selectivamente en cubreobjetos de vidrio con la contaminación de células glial mínima, pero reciben soporte trófico adecuada de la glía que crecen en la placa de cultivo tisular. Típic...

Watch this Scientific Journal Video about Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture at JoVE.com

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

Este artículo describe el protocolo para el cultivo de baja densidad de neuronas del hipocampo primarias que crecen en cubreobjetos de vidrio invertida sobre una monocapa glial. Las capas de neuronas y de la glía están separados por perlas de cera de parafina. Las neuronas cultivadas por este método son adecuados para formación de imágenes ópticas de alta resolución y ensayos funcionales.

Baja densidad primaria del hipocampo Neurona Cultura

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

low-density-primary-hippocampal-neuron-culture

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.4K vistas.  University of Manitoba.  Este artículo describe el protocolo para el cultivo de baja densidad de neuronas del hipocampo primarias que crecen en cubreobjetos de vidrio invertida sobre una monocapa glial. Las capas de neuronas y de la glía están separados por perlas de cera de parafina. Las neuronas cultivadas por este método son adecuados para formación de imágenes ópticas de alta resolución y ensayos funcionales. 

Video: Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

El organotípicos rebanada hipocampo modelo de cultivo para el examen de la lesión neuronal

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Investigación

Neurociencias

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection y cultivos primarios de neuronas del hipocampo de embriones de ratón y corticales

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Aislamiento y cultivo de neuronas del hipocampo de ratones prenatales

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Fosfato de Calcio La transfección de Primaria neuronas del hipocampo

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

Imaging las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo de rata primaria utilizando Estructurado Iluminación Microscopía

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

Ratón Rombencéfalo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura para el Estudio de la Migración facial Branchiomotor Neurona

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions such as motor control, motivation, and working memory. Nigrostriatal dopaminergic neurons selectively degenerate in Parkinson&#39;s disease (PD). This progressive neuronal loss is unequivocally associated with the motors symptoms of the pathology (bradykinesia, resting tremor, and muscular rigidity). The main agent responsible of dopaminergic neuron degeneration is still unknown. However, these neurons appear to be extremely vulnerable in diverse conditions. Primary cultures constitute one of the most relevant models to investigate properties and characteristics of dopaminergic neurons. These cultures can be submitted to various stress agents that mimic PD pathology and to neuroprotective compounds in order to stop or slow down neuronal degeneration. The numerous transgenic mouse models of PD that have been generated during the last decade further increased the interest of researchers for dopaminergic neuron cultures. Here, the video protocol focuses on the delicate dissection of embryonic mouse brains. Precise excision of ventral mesencephalon is crucial to obtain neuronal cultures sufficiently rich in dopaminergic cells to allow subsequent studies. This protocol can be realized with embryonic transgenic mice and is suitable for immunofluorescence staining, quantitative PCR, second messenger quantification, or neuronal death/survival assessment.

Dopaminergic neurons play a vital regulatory role in the brain. Their loss is associated with Parkinson's disease. In this video, we show how to generate primary cultures of central dopaminergic neurons from embryonic mouse mesencephalon. Such cultures are useful to study the extreme vulnerability of these neurons to various stresses.

Cultivo primario de ratón neuronas dopaminérgicas

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we describe a pERK immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. Specifically, we used pERK immunostaining to study neuronal activation following Morris water maze (MWM, a classical hippocampal-dependent learning task) in Engrailed-2 knockout (En2-/-) mice, a model of autism spectrum disorders (ASD). As compared to wild-type (WT) controls, En2-/- mice showed significant spatial learning deficits in the MWM. After MWM, significant differences in the number of pERK-positive neurons were detected in specific hippocampal subfields of En2-/- mice, as compared to WT animals. Thus, our protocol can robustly detect differences in pERK-positive neurons associated to hippocampal-dependent learning impairment in a mouse model of ASD. More generally, our protocol can be applied to investigate the profile of hippocampal neuron activation in both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

We describe an immunohistochemistry protocol to study the profile of hippocampal neuron activation following exposure to a spatial learning task in a mouse model characterized by cognitive deficits of neurodevelopmental origin. This protocol can be applied to both genetic or pharmacological mouse models characterized by cognitive deficits.

Visualización inmunohistoquímico de hipocampo Neurona Actividad Después espacial aprendizaje en un modelo de ratón de los trastornos del desarrollo neurológico

Induction of phosphorylated extracellular-regulated kinase (pERK) is a reliable molecular readout of learning-dependent neuronal activation. Here, we ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Un método simplificado para determinar la densidad ultra-baja, a largo plazo del hipocampo primaria Neurona Cultura

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Spiral Ganglion Neuron Explant Culture and Electrophysiology on Multi Electrode Arrays

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons. 
We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.

We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.

Ganglio espiral neurona explante cultura y Electrofisiología de multi electrodos matrices

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in ...