Las sinapsis son los elementos funcionales de las neuronas y sus defectos o pérdidas están en la base de varios trastornos neurodegenerativos y neurológicos. Los estudios por imágenes se utilizan ampliamente para investigar su función y plasticidad en condiciones fisiológicas y patológicas. Debido a su tamaño y estructura, los estudios de localización de proteínas requieren técnicas de imagen de alta resolución.
En este protocolo, describimos un procedimiento para estudiar en las neuronas primarias la co-localización de proteínas diana con marcadores sinápticos a un nivel de superresción utilizando microscopía de iluminación estructurada. SIM es una técnica de iluminación de luz con patrón que duplica la resolución espacial de la microscopía de campo ancho, alcanzando un detalle de alrededor de 100 nanómetros. El protocolo indica los controles y la configuración necesarios para estudios de co-localización robustos y una visión general de los métodos estadísticos para analizar los datos de imagen correctamente.
La clave para permitir el análisis a nivel de superrescencia es, sin embargo, los reactivos utilizados durante la adquisición, tales como cubiertas con cámara y soluciones de montaje compatibles con el índice de difracción del objetivo. Para obtener una neurona primaria hipocampal de ratón, aísle los hipocampos de P1 a P4 cachorros. Células de placa a 70.000 células por pozo en un volumen de 200 microlitros por pozo.
Espere hasta que las neuronas primarias del hipocampo maduren completamente de 12 a 14 días después del enchapado para realizar estudios de co-localización. Añadir 4%paraformaldehído, PFA, en PBS 200 microlitros por pozo a las neuronas para fijarlas rápidamente. Retire la solución e incubar las muestras con 1%albúmina sérica bovina, BSA, en PBS a 200 microlitros por pozo durante una hora a temperatura ambiente para cubrir pasivamente todas las superficies de unión libre de la placa con una proteína irrelevante para el análisis.
Un búfer de bloqueo basado en BSA sin Triton X-100 reduce el fondo de anticuerpos de manera más eficiente que el mismo búfer con 0.2%Triton X-100. Agregue el anticuerpo primario. Como control negativo, no agregue ningún anticuerpo primario a uno de los pozos.
Monte las células con un montura compatible con SIM, por ejemplo, ProLong Glass Antifade Mountant. Cubra y proteja las celdas con una cubierta, por ejemplo, una cubierta redonda con un diámetro de ocho milímetros.
También se pueden utilizar plazas. Guarde los cubreobjetos con cámara a temperatura ambiente y espere al menos 48 horas antes de adquirir imágenes. El vidrio de diamante requiere al menos dos días de curado antes de las adquisiciones de superresor resolución.
Utilice dos estrategias para asegurar la especificidad de los anticuerpos. El primero es el uso de al menos dos anticuerpos diferentes dirigidos al mismo sustrato. La segunda estrategia es la neutralización de anticuerpos por incubación con el objetivo de proteína purificada, o la utilizada para aumentar el anticuerpo.
Utilizamos rutinariamente un microscopio de superconorción N-SIM fabricado por Nikon para nuestro análisis. Las instrucciones siguientes deben estar destinadas a la adquisición de imágenes SIM independientemente del microscopio de uso. También es importante maximizar el rendimiento del microscopio para realizar una calibración precisa de los instrumentos, incluyendo anillo de corrección, alineación láser y enfoque de bloque de rejilla.
Antes de la adquisición de imágenes SIM, el sistema requiere una calibración adecuada con perlas fluorescentes de tamaño de subrescresación específicas. Un ejemplo son las microesferas TetraSpeck. Estas perlas están teñidas con diferentes tintes fluorescentes para permitir la calibración de diferentes láseres con una sola muestra.
En un baño de agua, sonicar alrededor de 1.8 veces 10 a la 8a microesferas fluorescentes durante 10 minutos. Diluir las microesferas fluorescentes una de cada 500 en agua doble destilada. Sonicar una segunda vez durante 10 minutos adicionales.
Pipeta 15 microlitros de las perlas diluidas en un pozo de un cubreobjetos con cámara. Deje secar la solución durante cinco minutos a temperatura ambiente. Añadir 10 microlitros de la solución de montaje, p. ej.
ProLong Glass, y coloque un cubreobjetos de ocho milímetros en la parte superior. Espere al menos 48 horas para permitir un curado adecuado. Encienda el microscopio y los láseres.
Deje que el sistema se caliente para alcanzar el equilibrio térmico de todos los componentes del microscopio y el sistema de microscopio de superconorción SIM requiere al menos tres horas. Seleccione el objetivo 100X. Inicie la calibración alineando los láseres con el centro del bloque de rejilla de difracción.
En el sistema N-SIM, una perilla de micrómetros y una cámara dedicada permiten centrar los haces de luz al objetivo. Inserte la cubierta con cámara del microscopio para su visualización. Ajuste el sistema al espesor de la cubierta con cámara ajustando la cubierta de corrección objetiva.
NIS Software, el software propietario proporcionado con sistemas de microscopio de superresor resolución N-SIM, tiene una función automática para regular la corrección de colores. Ajuste el enfoque del bloque de rejilla para cada canal para garantizar una iluminación de patrón estructurado enfocada en la muestra. El software proporciona una función automática para esta tarea.
Adquiera imágenes SIM 3D en bruto de las microesferas multicolores. Calcula para cada longitud de onda separada la transformación de Fourier de la imagen superconsuel. Si la imagen transformada no puede obtener un patrón correcto similar a una flor, reinicie la calibración ya que no se ha logrado la superrtención.
En la imagen superconsútil, seleccione una sola microesfera y calcule su perfil de intensidad para cada canal para medir la resolución alcanzada. Ahora debería estar cerca de 100 nanómetros lateralmente. Realice el registro de canales superponiendo una adquisición multicanal de las microesferas.
El objetivo es colisionar todas las señales de canal de forma lateral y axial. Esto eliminará las aberraciones cromáticas debido a la desalineación de los diferentes canales y ayudará al análisis de la co-localización. Confirme la calidad de la calibración utilizando el paso de fase de iluminación de funciones y el enfoque con patrón de iluminación de SIMcheck, un conjunto de plugins para la aplicación de código abierto ImageJ.
Comience a analizar la muestra utilizando un objetivo 40X en modo confocal o de campo ancho. Esto permite la navegación de la muestra, manteniendo un buen detalle y un gran campo de visión. Utilice la señal de anticuerpos MAP2 para detectar un área que represente procesos neuronales.
Adquiera imágenes de la muestra en modo confocal para determinar la calidad de la tinción. Cambie al objetivo 100X. Aplique aceite al objetivo 100X.
Adquiera una imagen de campo ancho o confocal que se utilizará más adelante para evaluar la calidad de la imagen superconstionada. Cambie al modo SIM 3D. Mediante las ventanas de diálogo para establecer los parámetros para la adquisición, seleccione la configuración de profundidad de bits más alta disponible para maximizar la información de color.
Típicamente, 16 bits es la opción estándar. Además, para mejorar la relación señal-ruido, seleccione un valor de baja frecuencia para la adquisición, como un megahercios. Usando ventanas de histograma, ajuste la potencia del láser para obtener una respuesta lineal de la señal para evitar la pérdida de información, limite los píxeles saturados en las imágenes.
El sistema N-SIM utiliza una cámara Andor iXon3. Cuando trabaje a 16 bits, elija una intensidad objetivo de 16.000 para garantizar la respuesta lineal de la cámara. Alternativamente, elija un rango entre 30.000 y 45.000 para maximizar el rango dinámico de las adquisiciones.
Establezca la potencia del láser entre 0,1% y 50% al tomar imágenes de las muestras y los tiempos de exposición entre 50 milisegundos y dos segundos. Las potencias láser superiores al 50% pueden causar un fotoblanqueo rápido de los fluoróforos en uso. Comience a adquirir las imágenes en modo 3D SIM.
Utilice SIMcheck, un conjunto de plugins gratuitos para ImageJ, para evaluar la calidad de las adquisiciones de las imágenes en bruto. Si SIMcheck no detecta artefactos ni problemas de calidad, adquiera un mínimo de 10 imágenes de réplicas técnicas completas para permitir el análisis estadístico. Las imágenes adquiridas son datos sin procesar que deben procesarse para obtener imágenes SIM reconstruidas que se utilizarán para su posterior análisis.
En el protocolo, sugerimos utilizar sinaptofisina y PSD-95 como marcadores sinápticos previos y posteriores. Sin embargo, se pueden utilizar marcadores adicionales. Un enorme cuerpo de literatura apoya el uso de otras proteínas, como la drebrin y el fabanón como marcadores sinápticos.
Las imágenes adquiridas por 3D SIM son imágenes sin procesar que deben procesarse para obtener imágenes superconsueltas reconstruidas. La reconstrucción incorrecta de imágenes sin procesar puede dar lugar a artefactos que afectarían al análisis de las muestras. Por lo tanto, se debe prestar una gran atención a la elección adecuada de los parámetros de reconstrucción.
Procesar las imágenes sin procesar utilizando el software de análisis de reconstrucción del microscopio para obtener una imagen superconsuel. Alternativamente, utilice un plugin ImageJ freely fairSIM para reconstruir las imágenes sin procesar. Calcule la transformación de Fourier de las imágenes superconsuelven utilizando el software de reconstrucción del microscopio o el plugin ImageJ SIMcheck.
Una buena imagen reconstruida debe devolver, para cada canal, una imagen similar a una flor. Si las imágenes reconstruidas no pueden volver a crear una forma similar a una flor, reinicie desde las imágenes sin procesar y reconstruya modificando los parámetros de reconstrucción, como el filtrado lineal, la apodización y la supresión de orden cero. En el software NIS que utiliza la vista previa para supervisar cómo el cambio de los parámetros afecta a la imagen final resuelta, modifique el contraste de modulación de iluminación del parámetro, la supresión de ruido de alta resolución y la supresión fuera de foco.
Analice la imagen reconstruida para detectar artefactos de forma imparcial mediante NanoJ-SQUIRREL, un complemento basado en ImageJ, para evaluar la calidad de las imágenes superconsúcedas. En nuestro análisis de la co-localización, utilizamos dos enfoques. El primero es un enfoque visual basado en el análisis de perfil que muestra eventos individuales de co-localización y que identifica la contribución de cada canal.
Como primer paso para estudiar la co-localización entre marcadores sinápticos y una proteína de interés, tome una imagen superconsuelta y analice un solo locus para determinar la superposición de la señal. Identifique un solo locus en la imagen superconsuel. Obtener los perfiles de intensidad de las señales fluorescentes al locus de interés.
Si el análisis de perfil ha sugerido una sola co-localización de locus, se puede llevar a cabo un análisis más general de toda la imagen calculando los coeficientes de Pearson y Mander. Utilice JACoP, un plugin de ImageJ, para determinar dos parámetros de co-localización, Pearson y Mander. Después de haber calibrado el sistema y evaluado la calidad de las imágenes reconstruidas, comenzamos a analizar los cultivos neuronales primarios manchados con un anticuerpo contra MAP2, un marcador neuronal, PSD-95, un marcador postsináptico, y nuestra proteína objetivo SUMO1.
Primero analizamos la muestra realizando microscopía confocal de cuatro canales con un objetivo 40X. Al seleccionar un área que representa los procesos neuronales, cambiamos a un objetivo 100X. Adquirimos imágenes confocales y SIM de la misma zona para evaluar la calidad de la reconstrucción con NanoJ-SQUIRREL y realizar análisis de co-localización.
Elucidar la estructura y composición de la sinapsis es crucial para la comprensión de los procesos fisiológicos y patológicos que regulan la memoria y la cognición. Mientras que en el estado normal las sinapsis son los bloques de construcción de la memoria, también están en la base de trastornos neurológicos complejos, como una de las formas más comunes de demencia enfermedad de Alzheimer. El protocolo descrito aquí permite el estudio de la composición proteica de las sinapsis con una técnica de microscopía de superrescidad llamada microscopía de iluminación estructurada.
